Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Vi ønsker å takke Juan J. Tena for bruken av homogenisatoren og CABD Proteomics and Animal Husbandry-fasilitetene for teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av det spanske utdannings-, kultur- og sportsdepartementet gjennom stipendiat FPU16/03264 til J.D.H.C., Foreningen Française contre les Myopathies (AFM) gjennom stipend #22450 til C.V.-G., et institusjonelt tilskudd MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis ved CABD) og BFU2017-83150-P til J.J.C. Junta de Andalucía-stipendet P18-RT-4572, FEDER Funding Program fra EU og det spanske vitenskaps-, innovasjons- og universitetsdepartementet gir RED2018-102576-T til P.N.

Mushus og vevsinnsamling ble utført ved hjelp av protokoller godkjent av Universidad Pablo de Olavide Ethics Committee (Sevilla, Spania, protokoller 24/04/2018/056 og 12/03/2021/033) i samsvar med spansk kongelig resolusjon 53/2013, Europeisk direktiv 2010/63/EU, og andre relevante retningslinjer.
1. Utarbeidelse av aksjer, buffere og reagenser for respirasjonsanalysene
<ol><li>Forbered følgende lagerløsninger, som kan lagres ved angitt temperatur i flere måneder. Bruk u...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

Alle metoder som brukes til å studere mitokondrie respirasjon har sine begrensninger; Derfor er det avgjørende å velge metoden som passer best til et bestemt eksperimentelt spørsmål. Dette arbeidet gir en oppdatert og detaljert protokoll for å isolere mitokondrier fra mus skjelettmuskulatur for å utføre forskjellige respiratoriske analyser for å undersøke mitokondriefunksjon. Faktisk er studiet av mitokondriebioenergetikk i isolerte mitokondrier ved hjelp av mikroplatebaserte teknologier verdifullt for å stude...

Mitokondrier er de primære metabolske organellene i cellen1. Disse spesialiserte membran-lukkede organellene bruker næringsmolekyler til å produsere energi i form av adenosin tripfosfat (ATP) av OXPHOS. Denne prosessen er avhengig av overføring av elektroner fra donormolekyler i en rekke redoksreaksjoner i ETC2. CoQ er den eneste redoksaktive lipiden som er endogent produsert i alle cellulære membraner og sirkulerende lipoproteiner som viser antioksidantfunksjon3. Det er en viktig komponent i ETC, overføring av elektroner fra NADH-avhengig kompleks I og FADH2-avhengig kompleks II til kompleks III, selv om mange andre reduktaser kan drive reduksjonen av mitokondrie CoQ til ubiquinol som et obligatorisk skritt i flere cellulære metabolske veier4,5.
Gjennom hele prosessen opprettes en elektrokjemisk protongradient over mitokondrie indre membran, som omdannes til biologisk aktiv energi av ATP-syntasekomplekset V2. Følgelig fører mitokondrie dysfunksjon til et utall patologiske forhold som hovedsakelig påvirker vev med høye energibehov - hjernen, hjertet og skjelettmuskelen6,7. Derfor er det grunnleggende å utvikle metoder for å nøyaktig analysere mitokondriebioenergetikk for å undersøke sin rolle i helse og sykdom, spesielt i svært energiske vev som skjelettmuskler.
Den Clark-type oksygenelektroden har blitt klassisk brukt i studiet av mitokondrie respirasjon8. Imidlertid har dette systemet blitt gradvis fordrevet av teknologier med høyere oppløsning, med mikroplatebaserte oksygenforbruksteknologier som Agilent Seahorse XF-analysatorer som er spesielt populære9. I skjelettmuskulaturfeltet utføres disse studiene vanligvis i dyrkede celler, hovedsakelig i C2C12 udødeliggjort mus myoblastcellelinje eller primærkulturer avledet fra satellittceller10,11. Imidlertid rekapitulerer disse studiene ikke situasjonen i vivo, spesielt når du undersøker mitokondriebiologi og funksjon på vevsnivå på spesifikke fornærmelser, ikke-genetiske intervensjoner eller genetiske manipulasjoner.
Videre er respirasjonsanalyser i celler mer komplekse på grunn av tilleggsfaktorer, inkludert ekstra mitokondriebehov av ATP og analysesubstrater eller signalhendelser, noe som kan villede tolkningen av resultatene. Alternativt er det også mulig å bruke enkelt- eller bunter av nyisolerte myofibers fra muskler. Isolasjonsmetoden er imidlertid teknisk utfordrende og bare mulig for noen få muskeltyper. I dette tilfellet brukes flexor digitorum brevis (FDB) og extensor digitorum longus (EDL) muskler hovedsakelig 10,12,13, selv om noen få rapporter beskriver bruken av andre muskeltyper også14,15.
Bioenergetisk profilering av skjelettmuskulaturseksjoner er også rapportert16. Den største fordelen med denne metoden er at intakte muskler kan studeres (forfatterne viser at kutting gjennom fibre ikke forstyrrer resultatene sammenlignet med isolerte myofibers). Imidlertid er mitokondrietilgangen til substrater og analysehemmere begrenset, og dermed kan bare noen få parametere måles16. Til slutt kan isolerte mitokondrier også brukes9,17,18,19. I dette tilfellet mister mitokondrier sitt cytosoliske miljø, noe som kan påvirke deres funksjon. I motsetning garanterer denne metoden tilgang til substrater og inhibitorer, muliggjør analyse av en mengde prøvetyper, og krever vanligvis mindre materiale.
Dette dokumentet beskriver en metode for å utføre bioenergetisk profilering av isolerte mitokondrier fra mus skjelettmuskulatur ved hjelp av mikroplatebaserte respirometriske analyser (figur 1). Spesielt er tre protokoller detaljerte: Koblingsanalysen, CA for å vurdere graden av kobling mellom ETC og OXPHOS-maskineriet; Electron Flow Assay, EFA for å måle aktiviteten til de enkelte ETC-kompleksene; og BOX-analysen for å bestemme mitokondriedon β-oksidasjonskapasitet. Spesielt er det bare nødvendig med små mengder prøver sammenlignet med konvensjonelle respirometrimetoder. Isolasjonsprotokollen som brukes her, er endret fra metoden som er publisert andre steder18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

Mesteparten av cellens energi oppnås ved nedbrytning av glukose, fettsyrer og aminosyrer ved forskjellige veier som konvergerer på mitokondrieoksidativ fosforylering (OXPHOS) -systemet, som reguleres som svar på cellulære krav. Lipidmolekylet Coenzyme Q (CoQ) er avgjørende i denne prosessen ved å overføre elektroner til kompleks III i elektrontransportkjeden (ETC) gjennom konstante oksidasjons-/reduksjonssykluser. Mitokondrier status og til slutt cellulær helse kan vurderes ved å måle ETC oksygenforbruk ved hjelp av respirometriske analyser. Disse studiene utføres vanligvis i etablerte eller primære cellelinjer som har vært dyrket i flere dager. I begge tilfeller kan de oppnådde åndedrettsparametrene ha avviket fra normale fysiologiske tilstander i et gitt organ eller vev.
I tillegg hindrer de iboende egenskapene til dyrkede enkeltfibre isolert fra skjelettmuskulatur denne typen analyse. Dette papiret presenterer en oppdatert og detaljert protokoll for analyse av åndedrett i nyisolerte mitokondrier fra mus skjelettmuskulatur. Vi tilbyr også løsninger på potensielle problemer som kan oppstå når som helst i prosessen. Metoden som presenteres her kan brukes til å sammenligne oksygenforbruk i forskjellige transgene musemodeller og studere mitokondrieresponsen på narkotikabehandlinger eller andre faktorer som aldring eller sex. Dette er en mulig metode for å svare på viktige spørsmål om mitokondriebioenergetikk metabolisme og regulering.

Protokollen som presenteres her tillater in vivo analyse av mitokondrie respirasjon gjennom isolering av mitokondrier fra musen skjelettmuskulatur. En oversikt over metoden vises i figur 1. Etter dissekering av skjelettmuskulaturen fra bakbenene (figur 2) blir vev homogenisert og mitokondrier renset, under isotoniske forhold, gjennom serielle sentrifugeringer. Renheten til de forskjellige fraksjonene oppnådd under isolasjonsprosessen kan analyseres av ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Her beskriver vi en detaljert metode for mitokondrierisolasjon fra mus skjelettmuskulatur og den påfølgende analysen av respirasjon av oksygenforbrukshastighet (OCR) ved hjelp av mikroplatebaserte respirometriske analyser. Denne rørledningen kan brukes til å studere effekten av flere miljømessige eller genetiske intervensjoner på mitokondriemetabolisme.

Isolering av mitokondrier fra mus skjelettmuskel for respirometriske analyser

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Dette ordet beskriver respirasjonsanalyse i behandling av mitokondrier fra mus skjelettmuskulatur. Denne protokollen reduserer rensetiden betydelig og gjør det mulig å behandle flere prøver samtidig. Mitokondrier fra dyr med åtte kjønn av United-bakgrunn kan lemlestes ved hjelp av denne protokollen som muliggjør studiet av åndedrett under et bredt spekter av eksperimentelle forhold.Denne metoden er egnet for alle forskningsområder der mitokondrierfunksjon er relevant, inkludert aldring, legemiddeltesting, kreft eller utvikling. Det kan til og med tilpasses andre vev og organismer også. Forsikre deg om at alle materialer er kalde ved å plassere alt på isen under prosedyren for å beskytte mitokondrier mot skade.Legg tre 50 milliliter beger per prøve på is og tilsett 10 milliliter PBS i beger en, 10 milliliter 10 millimolar EDTA PBS i beger to, og fire milliliter IB1 i beger tre. Spray høyre bakre lem av en euthanized mus med 70% etanol for å forhindre pels fra å kaste og tape lemmen til kork disseksjonsbrettet og deretter tape venstre forben. Lag et snitt med en steril engangs skalpell gjennom huden fra kne til tå.Ta tak i huden med tann tang på ankelnivå og kutt den med fin saks rundt ankelen. Lett huden bort fra den underliggende muskulaturen med fine tweezers i den ene hånden mens du trekker den opp med tann tang i den andre hånden. Disseker alle skjelettmuskler fra ankel til kne og fjern alt bindevev over tibialis fremre muskel ved hjelp av fine pinsett og saks.Finn de fire distale sener av extensor digitorum longus muskel og seksjon dem nær sine innsettinger i tåene. Finn tibialis fremre distal sene og kutt den nær innsettingen under ankelen. Trekk tibialis fremre og ekstensor digitorum longus sener over ankelen for å frigjøre de løse endene.Grip de løse endene av senene og lette musklene bort fra resten av muskulaturen i bein ved å trekke dem opp. Klipp de proksimale senene i disse musklene så nært som mulig til kneskålen. Snu musen opp ned for å fortsette med gastrocnemius og soleus muskel ekstraksjon.Grip lommen dannet mellom biceps, femoris, og gastrocnemius og skille disse musklene ved hjelp av fin saks for å visualisere proksimal gastrocnemius sene. Grip og kutt forsiktig den distale akillessenen med fin saks. Klipp den proksimale gastrocnemius senen frigjøre den med den underliggende soleus.Disseker forsiktig de resterende musklene og fest musen i den opprinnelige posisjonen for å dissekere quadriceps-muskelen. Kast fettvevet og sett inn fine pinsett mellom quadriceps og lårbenet for å skille muskelen fra beinet. Grip distal quadriceps muskel sener og kutte senen så nært som mulig til kneskålen.Trekk quadriceps opp og frigjøre dem med fin saks ved proksimal innsetting. Gjenta det samme for venstre bakre lem. Skyll alle musklene i beger en, deretter to, etterfulgt av beger tre.Til slutt hakker du alle musklene i beger tre med skarp saks på is. Overfør suspensjonen til et C-rør, lukk den tett og fest den opp ned på homogenisatorens hylse. Del homogenatet i to 2 milliliter forhåndskjølte mikrosentrifugerør og sentrifuger i 10 minutter.Overfør deretter supernatanten til nye forhåndskjølte rør og sentrifuger i ytterligere 10 minutter. Kombiner pelletsen i 500 mikroliter IB2 Overfør supernatanten til et nytt 2 milliliter forhåndskjølt mikrosentrifugerør og merk det som supernatant nummer to, eller SN2. Re suspender den endelige mitokondriepellet i 200 mikroliter re-suspensjon buffer.Sett raskt av 10 mikroliter for protein kvantifisering og tilsett umiddelbart 10 mikroliter av 10% FFA BSA til gjenværende mitokondrie suspensjon for å forhindre skade. Sentrifuger den konsentrerte mitokondriefjæringen ved 10.500 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Re suspender mitokondriepellet i 100 mikroliter av 1X koblingsanalysemedium med BSA, 1X elektronstrømanalysemedium med BSA eller 1X betaoksidasjonsmedium med BSA, avhengig av protokollen som skal utføres.Fortynn denne konsentrerte mitokondrieprøven til 0,2 mikrogram per mikroliter ved hjelp av det tilsvarende analysemediet. Frø 50 mikroliter av suspensjonen per brønn i en forhåndskjølt 24 brønnmikroplate på is. I bakgrunnskorreksjonsbrønnene legger du bare til det tilsvarende analysemediet.Oppbevar den gjenværende mitokondriefjæringen på minus 80 grader Celsius for fragmenteringsrenhet. Snurr mikroplaten i den forhåndskjølte forberedende sentrifugen i 20 minutter. I mellomtiden varmer du det gjenværende analysemediet til 37 grader Celsius.Etter sentrifugering, la mikroplaten stå på benken i fem minutter for å likevekte. Tilsett 450 mikroliter av det varme analysemediet per brønn sakte og forsiktig for å unngå løsrivelse av mitokondrier. Plasser mikroplaten umiddelbart i måleinstrumentet for oksygenforbruk uten lokket og start måleprogrammet.Forsikre deg om at det første trinnet er en 10 minutters inkubasjon slik at mikroplaten kan varmes opp. Når eksperimentet er ferdig, fjerner du patronen og mikroplaten, slår av instrumentet og starter analysen. Generelle proteinprofiler fra de forskjellige fraksjonene oppnådd gjennom serielle sentrifugeringer viste tydelige proteinpopulasjoner i de isolerte fraksjonene.Tilstedeværelsen av alt mitokondrieinnholdet er tydelig av de sterke signalene for markører av den ytre og indre mitokondriemembranen og nukleoid assosierte proteiner. Brøk N representerer kjerner og uoppløst materiale. De fleste endoplasmiske retikulum-, plasmamembran- eller cytoplasmamarkørene i SN1- eller SN2-fraksjonene fremhever den høye renheten som oppnås under isolasjon.En økning i oksygenforbruket ble observert etter ADP-tilsetning i oksidasjonsanalysene for kobling og beta. Etter karbonylcyanid-p-trifluorometoksy fenylhydrazon tilsetning nådde oksygenforbruket sitt høyeste nivå. Et lavt respiratorisk kontrollforhold sikrer integriteten til de isolerte mitokondriene.Elektronstrømanalysen undersøkte aktiviteten til elektrontransportkjedens komplekser individuelt eller i kombinasjon gjennom injeksjon av spesifikke substrater og inhibitorer. Isolerende mitokondrier er ekstremt følsomme. Derfor må alle trinnene etter vevsreduksjon utføres flittig og nøye for å bevare deres levedyktighet.Eksperimentelle analyser kan komplimenteres med en deterministisk sematisk analyse av viktige mitokondrier molekyler eller med studiet av montering av respirometriske komplekser ved hjelp av blå innfødt polyakrylamid gel elektroforese.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-påført skade av Sebrafisk Embryonic skjelettmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolasjon og kultur av individuelle myofibers og deres satellitt celler fra voksne Skeletal Muscle

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering av Blood-fartøy-avledet multipotent Forstadier fra Menneskelig Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolasjon og Funksjonell analyse av Mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...