Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
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Agradecemos a Juan J. Tena pelo uso do homogeneizador e das instalações de Proteomia e Pecuária CABD para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Cultura e Esportes espanhol através da bolsa FPU16/03264 a J.D.H.C., a Associação Française contre les Myopathies (AFM) através do bolsa de estudos nº 22450 à C.V.-G., uma Subvenção Institucional MDM-2016-0687 (Unidade de Excelência Maria de Maeztu, Departamento de Regulação Genética e Morfogênese na CABD) e BFU2017-83150-P para J.J.C. A Junta de Andalucía concede P18-RT-4572, o Programa de Financiamento feder da União Europeia, e o Ministério da Ciência, Inovação e Universidades espanholas concede RED2018-102576-T à P.N.

A coleta de camundongos e a coleta de tecidos foram realizadas por meio de protocolos aprovados pelo Comitê de Ética da Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, Espanha; protocolos 24/04/2018/056 e 03/12/2021/033) de acordo com o Decreto Real Espanhol 53/2013, Diretiva Europeia 2010/63/UE, e outras diretrizes relevantes.
1. Preparação de estoques, buffers e reagentes para os ensaios de respiração
<ol><li>Prepare as seguintes soluções de estoque, que podem ser armazenad...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

Todos os métodos utilizados para estudar a respiração mitocondrial têm suas limitações; portanto, é crucial selecionar o método que melhor se adequa a uma questão experimental específica. Este trabalho fornece um protocolo atualizado e detalhado para isolar mitocôndrias do músculo esquelético do rato para realizar diferentes ensaios respiratórios para investigar a função mitocondrial. De fato, o estudo de bioenergésicos mitocondriais mitocôndicos em mitocôndrias isoladas usando tecnologias baseadas em ...

Mitocôndrias são as organelas metabólicas primárias na célula1. Essas organelas especializadas em membrana usam moléculas de nutrientes para produzir energia na forma de triphosfato de adenosina (ATP) por OXPHOS. Este processo se baseia na transferência de elétrons de moléculas de doadores em uma série de reações redox no ETC2. CoQ é o único lipídio ativo de redox que é endogenosamente produzido em todas as membranas celulares e lipoproteínas circulantes que mostra função antioxidante3. É um componente essencial do ETC, transferindo elétrons do complexo I e fadh2 dependentes de NADH II para o complexo III, embora muitas outras reductases possam conduzir a redução do CoQ mitocondrial para o ubiquinol como um passo obrigatório em múltiplas vias metabólicas celulares4,5.
Ao longo do processo, um gradiente de prótons eletroquímicos é criado através da membrana interna mitocondrial, que é transformada em energia biologicamente ativa pelo complexo de sintetizador ATP V2. Consequentemente, a disfunção mitocondrial leva a uma miríade de condições patológicas que afetam principalmente tecidos com necessidades de alta energia - o cérebro, o coração e o músculo esquelético6,7. Por isso, é fundamental desenvolver métodos para analisar com precisão os bioenergésicos mitocondriais para investigar seu papel na saúde e na doença, particularmente em tecidos altamente energéticos, como os músculos esqueléticos.
O eletrodo de oxigênio do tipo Clark tem sido usado clássicamente no estudo da respiração mitocondrial8. No entanto, este sistema tem sido progressivamente deslocado por tecnologias de maior resolução, com tecnologias de consumo de oxigênio baseadas em microplaca, como os analisadores XF Agilent Seahorse sendo especialmente populares9. No campo muscular esquelético, esses estudos são tipicamente conduzidos em células cultivadas, principalmente na linha de células mioblast do camundongo imortalizada C2C12 ou culturas primárias derivadas de células satélite10,11. No entanto, esses estudos não recapitulam totalmente a situação in vivo, especialmente quando se investigam a biologia mitocondrial e funcionam no nível tecidual sobre insultos específicos, intervenções nãogenéticas ou manipulações genéticas.
Além disso, os ensaios de respiração nas células são mais complexos devido a fatores adicionais, incluindo a demanda extra-mitocondrial de ATP e ensaios substratos ou eventos de sinalização, o que poderia enganar a interpretação dos resultados. Alternativamente, também é possível usar pacotes únicos ou de miofibers recém-isolados dos músculos. No entanto, o método de isolamento é tecnicamente desafiador e só é viável para alguns tipos musculares. Neste caso, os músculos flexor digitorum brevis (FDB) e extensor digitorum longus (EDL) são usados principalmente10,12,13, embora alguns relatórios descrevam o uso de outros tipos musculares também14,15.
O perfil bioenergésico das seções musculares esqueléticas também foi relatado16. A maior vantagem deste método é que músculos intactos podem ser estudados (os autores mostram que o corte através de fibras não perturba os resultados quando comparado com miofibers isolados). No entanto, o acesso mitocondrial a substratos e inibidores de ensaios é limitado e, portanto, apenas alguns parâmetros podem ser medidos16. Por fim, mitocôndrias isoladas também podem ser empregadas9,17,18,19. Neste caso, mitocôndrias perdem seu ambiente citosolico, o que pode afetar sua função. Em contraste, este método garante o acesso a substratos e inibidores, permite a análise de uma infinidade de tipos de amostragem e normalmente requer menos material.
Este artigo descreve um método para realizar o perfil bioenergéstico de mitocôndrias isoladas do músculo esquelético do rato usando assins respirométricos à base de microplacas (Figura 1). Em particular, três protocolos são detalhados: o Ensaio de Acoplamento, CA para avaliar o grau de acoplamento entre o ETC e o maquinário OXPHOS; o Ensaio de Fluxo de Elétrons, EFA para medir a atividade dos complexos etc individuais; e o ensaio BOX para determinar a capacidade mitocondrial de β-oxidação. Notavelmente, apenas pequenas quantidades de amostras são necessárias em comparação com métodos convencionais de respirometria. O protocolo de isolamento utilizado aqui foi modificado a partir do método publicado em outros lugares18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

A maior parte da energia da célula é obtida através da degradação da glicose, ácidos graxos e aminoácidos por diferentes vias que convergem para o sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS), que é regulado em resposta às demandas celulares. A molécula lipídica Coenzyme Q (CoQ) é essencial nesse processo, transferindo elétrons para o complexo III na cadeia de transporte de elétrons (ETC) através de ciclos constantes de oxidação/redução. O estado mitocôndria e, em última análise, a saúde celular podem ser avaliadas medindo o consumo de oxigênio etc usando assistos respirométricos. Esses estudos são tipicamente realizados em linhas celulares estabelecidas ou primárias que foram cultivadas por vários dias. Em ambos os casos, os parâmetros de respiração obtidos podem ter se desviado de condições fisiológicas normais em qualquer determinado órgão ou tecido.
Além disso, as características intrínsecas das fibras únicas cultivadas isoladas do músculo esquelético impedem esse tipo de análise. Este artigo apresenta um protocolo atualizado e detalhado para a análise da respiração em mitocôndrias recém-isoladas do músculo esquelético do camundongo. Também fornecemos soluções para possíveis problemas que possam surgir em qualquer etapa do processo. O método aqui apresentado poderia ser aplicado para comparar as taxas de consumo de oxigênio em diversos modelos de camundongos transgênicos e estudar a resposta mitocondrial a tratamentos medicamentosos ou outros fatores como envelhecimento ou sexo. Este é um método viável para responder a perguntas cruciais sobre metabolismo e regulação bioenergetics mitocondrial.

O protocolo aqui apresentado permite a análise in vivo da respiração mitocondrial através do isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo. Um esboço do método é mostrado na Figura 1. Após dissecar músculos esqueléticos das retalhos (Figura 2), os tecidos são homogeneizados e mitocôndrias purificadas, sob condições isotônicas, através de centrífugas em série. A pureza das diferentes frações obtidas durante o pro...

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Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.

Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Esta palavra descreve a análise de respiração no processamento de mitocôndrias do músculo esquelético do rato. Este protocolo reduz consideravelmente o tempo de purificação e permite que várias amostras sejam processadas simultaneamente. Mitocôndrias de animais de qualquer oito sexo de fundo united podem ser mutiladas usando este protocolo permitindo o estudo da respiração em uma ampla variedade de condições experimentais.Este método é adequado para todas as áreas de pesquisa onde a função mitocôndria é relevante, incluindo envelhecimento, testes de drogas, câncer ou desenvolvimento. Pode até ser adaptado a outros tecidos e organismos também. Certifique-se de que todos os materiais estão frios colocando tudo no gelo durante o procedimento para proteger mitocôndrias de danos.Coloque três 50 béquers mililitros por amostra no gelo e adicione 10 mililitros de PBS no béquer um, 10 mililitros de 10 mililitros EDTA PBS no béquer dois, e quatro mililitros IB1 no béquer três. Pulverize o membro traseiro direito de um rato eutanizado com 70% de etanol para evitar que a pele se desça e tape o membro na placa de dissecção da rolha e, em seguida, fita o membro do antedo esquerdo. Faça uma incisão com um bisturi descartável estéril através da pele do joelho aos dedos dos dois.Segure a pele com fórceps dentadas ao nível do tornozelo e corte-a com uma tesoura fina ao redor do tornozelo. Alivie a pele da musculatura subjacente com pinças finas de ponta em uma mão enquanto puxa-a para cima com fórceps dentados na outra mão. Disseque todos os músculos esqueléticos do tornozelo ao joelho e remova todo o tecido conjuntivo sobre o músculo anterior da tíbia usando pinças finas e tesouras.Encontre os quatro tendões distais do músculo extensor digitorum longus e selá-los perto de suas inserções nos dedos dos dedos. Localize o tendão distal anterior tibialis e corte-o perto de sua inserção abaixo do tornozelo. Puxe os tendões tibialis anterior e extensor digitorum longus acima do tornozelo para liberar as pontas soltas.Segure as pontas soltas dos tendões e alivie os músculos para longe do resto da musculatura nos ossos puxando-os para cima. Corte os tendões proximais desses músculos o mais próximo possível da rótula. Vire o rato de cabeça para baixo para prosseguir com extração muscular gastrocnemius e soleus.Segure o bolso formado entre os bíceps, femoris e gastrocnemius e separe esses músculos usando uma tesoura fina para visualizar o tendão gastrocnemius proximal. Segure e corte cuidadosamente o tendão de Aquiles distal com uma tesoura fina. Corte o tendão gastrocnemius proximal liberando-o com o soleus subjacente.Disseca cuidadosamente os músculos restantes e recue o mouse na posição inicial para dissecar o músculo quadríceps. Descarte o tecido adiposo e insira pinças finas entre o quadríceps e o fêmur para separar o músculo do osso. Segure os tendões musculares do quadríceps distal e corte o tendão o mais próximo possível da rótula.Puxe os quadríceps para cima e liberte-os com uma tesoura fina na inserção proximal. Repita o mesmo para o membro traseiro esquerdo. Enxágüe todos os músculos no béquer um, depois dois, seguido por béquer três.Finalmente, pique todos os músculos em béquer três com uma tesoura afiada no gelo. Transfira a suspensão para um tubo C, feche-a firmemente e coloque-a de cabeça para baixo na manga do homogeneizador. Divida a homogeneidade em dois tubos de micro centrífugas pré-refrigerados de 2 mililitros e centrífuga por 10 minutos.Em seguida, transfira o supernatante para novos tubos pré-refrigerados e centrífuga por mais 10 minutos. Combine a pelota em 500 microliters de IB2 Transfira o supernascer para um novo tubo de micro centrífuga pré-refrigerado de 2 mililitros e rotule-o como supernatante número dois, ou SN2. Suspender novamente a última pelota mitocondrial em 200 microliters de tampão de suspensão re.Reserve rapidamente 10 microliters para quantificação de proteínas e adicione imediatamente 10 microliters de 10% FFA BSA à suspensão mitocondrial restante para evitar danos. Centrifugar a suspensão mitocondrial concentrada a 10.500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Suspender novamente a pelota mitocondrial em 100 microliters de 1X acoplamento médio com BSA, 1X medidor de ensaio de fluxo de elétrons com BSA, ou 1X meio de oxidação beta com BSA, dependendo do protocolo a ser realizado.Diluir esta amostra mitocondrial concentrada para 0,2 microgramas por microliter utilizando o meio de ensaio correspondente. Semente 50 microliters da suspensão por poço em uma micro placa pré-refrigerada de 24 poços no gelo. Nos poços de correção de fundo, adicione apenas o meio de ensaio correspondente.Armazene a suspensão mitocondrial restante a menos 80 graus Celsius para determinação de pureza de fragmentação. Gire a micro placa na centrífuga pré-refrigerada por 20 minutos. Enquanto isso, aqueça o ensaio restante médio a 37 graus Celsius.Após a centrifugação, deixe a micro placa no banco por cinco minutos para equilibrar. Adicione 450 microliters do meio de ensaio quente por poço lentamente e cuidadosamente para evitar o descolamento das mitocôndrias. Coloque a micro placa imediatamente no instrumento de medição de consumo de oxigênio sem a tampa e inicie o programa de medição.Certifique-se de que o primeiro passo é uma incubação de 10 minutos para permitir que a micro placa aqueça. Uma vez terminado o experimento, remova o cartucho e a micro placa, desligue o instrumento e inicie a análise. Perfis gerais de proteínas das diferentes frações obtidas através de centrífugas seriais mostraram populações proteicas distintas nas frações isoladas.A presença de todo o conteúdo mitocondrial é evidente pelos fortes sinais de marcadores da membrana mitocondrial externa e interna e proteínas associadas a nucleóides. A fração N representa núcleos e material não rompido. A maioria dos marcadores de tiquelum endoplasmático, membrana plasmática ou citoplasma nas frações SN1 ou SN2 destacam a alta pureza obtida durante o isolamento.Observou-se aumento no consumo de oxigênio após a adição de ADP nos ensaios de acoplamento e oxidação beta. Após a adição de cianeto-cianeto-p-trifluortotoxy, o consumo de oxigênio atingiu seu nível mais alto. Uma baixa relação de controle respiratório garante a integridade das mitocôndrias isoladas.O ensaio de fluxo de elétrons examinou a atividade da cadeia de transporte de elétrons se complexa individualmente ou em combinação através da injeção de substratos e inibidores específicos. Mitocôndrias isolando são extremamente sensíveis. Portanto, todas as etapas após a mitigação do tecido precisam ser realizadas com diligência e cuidado para preservar sua viabilidade.Ensaios experimentais podem ser elogiados com uma análise semática determinística das moléculas-chave das mitocôndrias ou com o estudo da montagem de complexos respirométricos usando eletroforese de gel de poliacrilamida nativa azul.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biologia

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purificação de Progenitores do músculo esquelético

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...