Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Мы хотим поблагодарить Juan J. Tena за использование гомогенизатора и объектов CABD Proteomics and Animal Farming за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством образования, культуры и спорта Испании через стипендию FPU16/03264 для J.D.H.C., Ассоциацию Française contre les Myopathies (AFM) через стипендиальный грант No 22450 для C.V.-G., институциональный грант MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Департамент регуляции генов и морфогенеза в CABD) и BFU2017-83150-P для J.J.C. Грант Хунты Андалусии P18-RT-4572, Программа финансирования FEDER от Европейского Союза и Министерство науки, инноваций и университетов Испании предоставляют RED2018-102576-T P.N.

Сбор у мышей и тканей был выполнен с использованием протоколов, одобренных Комитетом по этике Universidad Pablo de Olavide (Севилья, Испания; протоколы 24/04/2018/056 и 12/03/2021/033) в соответствии с Испанским королевским указом 53/2013, Европейской директивой 2010/63/EU и другими соответствующими руководящими принци...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

Все методы, используемые для изучения митохондриального дыхания, имеют свои ограничения; следовательно, крайне важно выбрать метод, который наилучшим образом соответствует конкретному экспериментальному вопросу. Эта работа предоставляет обновленный и подробный протокол для изоляци...

Митохондрии являются первичными метаболическими органеллами в клетке1. Эти специализированные мембранно-закрытые органеллы используют молекулы питательных веществ для производства энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ) OXPHOS. Этот процесс основан на переносе электронов от донорских молекул в серии окислительно-восстановительных реакций в ETC2. CoQ является единственным окислительно-активным липидом, который эндогенно вырабатывается во всех клеточных мембранах и циркулирующих липопротеинах, которые проявляют антиоксидантную функцию3. Это важный компонент ETC, передающий электроны из NADH-зависимого комплекса I и FADH2-зависимого комплекса II в комплекс III, хотя многие другие редуктазы могут стимулировать восстановление митохондриального CoQ до убихинола в качестве обязательного шага в нескольких клеточных метаболических путях4,5.
На протяжении всего процесса через внутреннюю мембрану митохондрий создается электрохимический протонный градиент, который преобразуется в биологически активную энергию комплексом АТФ-синтазы V2. Следовательно, митохондриальная дисфункция приводит к множеству патологических состояний, в основном затрагивающих ткани с высокими энергетическими потребностями - мозг, сердце и скелетные мышцы6,7. Поэтому крайне важно разработать методы точного анализа митохондриальной биоэнергетики для изучения ее роли в здоровье и болезнях, особенно в высокоэнергетических тканях, таких как скелетные мышцы.
Кислородный электрод типа Кларка был классически использован при изучении митохондриального дыхания8. Однако эта система постепенно вытесняется технологиями с более высоким разрешением, причем особенно популярны технологии потребления кислорода на основе микропластин, такие как анализаторы Agilent Seahorse XF9. В области скелетных мышц эти исследования обычно проводятся в культивируемых клетках, главным образом в увековеченной клеточной линии миобластов C2C12 или первичных культурах, полученных из клеток-сателлитов10,11. Тем не менее, эти исследования не полностью повторяют ситуацию in vivo, особенно при изучении митохондриальной биологии и функционирования на тканевом уровне при конкретных нарушениях, негенетических вмешательствах или генетических манипуляциях.
Кроме того, анализ дыхания в клетках является более сложным из-за дополнительных факторов, включая внемитохондриальную потребность в АТФ и субстратах анализа или сигнальные события, которые могут ввести в заблуждение интерпретацию результатов. В качестве альтернативы также возможно использование одиночных или пучков свежеизолированных миофиберов из мышц. Тем не менее, метод изоляции технически сложен и осуществим только для нескольких типов мышц. В этом случае в основном используются мышцы сгибателя digitorum brevis (FDB) и разгибателя digitorum longus (EDL)10,12,13, хотя в нескольких отчетах также описывается использование других типов мышц14,15.
Также сообщалось о биоэнергетическом профилировании участков скелетных мышц16. Основным преимуществом этого метода является то, что интактные мышцы могут быть изучены (авторы показывают, что нарезка через волокна не нарушает результаты по сравнению с изолированными миофибрами). Однако митохондриальный доступ к субстратам и ингибиторам анализа ограничен, и, таким образом, можно измерить лишь несколько параметров16. Наконец, изолированные митохондрии также могут быть использованы9,17,18,19. В этом случае митохондрии теряют цитозольную среду, что может повлиять на их функцию. Напротив, этот метод гарантирует доступ к субстратам и ингибиторам, позволяет анализировать множество типов образцов и, как правило, требует меньше материала.
В данной работе описан метод выполнения биоэнергетического профилирования изолированных митохондрий из скелетных мышц мыши с использованием респирометрических анализов на основе микропластин (рисунок 1). В частности, подробно описаны три протокола: Анализ связи, CA для оценки степени связи между ETC и механизмом OXPHOS; Анализ потока электронов, EFA для измерения активности отдельных комплексов внеземных цивилизаций; и анализ BOX для определения митохондриальной β окислительной способности. Примечательно, что требуется только небольшое количество образцов по сравнению с обычными методами респирометрии. Используемый здесь протокол изоляции был изменен по сравнению с методом, опубликованным в другом месте18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

Большая часть энергии клетки получается за счет деградации глюкозы, жирных кислот и аминокислот различными путями, которые сходятся в системе митохондриального окислительного фосфорилирования (OXPHOS), которая регулируется в ответ на клеточные потребности. Липидная молекула коэнзима Q (CoQ) имеет важное значение в этом процессе путем переноса электронов в комплекс III в цепи переноса электронов (ETC) через постоянные циклы окисления / восстановления. Статус митохондрий и, в конечном счете, здоровье клеток можно оценить, измеряя потребление кислорода внеземными цивилизациями с использованием респирометрических анализов. Эти исследования обычно проводятся в установленных или первичных клеточных линиях, которые культивировались в течение нескольких дней. В обоих случаях полученные параметры дыхания могли отклоняться от нормальных физиологических условий в любом данном органе или ткани.
Кроме того, внутренние характеристики культивируемых одиночных волокон, выделенных из скелетных мышц, препятствуют этому типу анализа. В данной работе представлен обновленный и подробный протокол анализа дыхания в свежеизолированных митохондриях скелетных мышц мыши. Мы также предоставляем решения потенциальных проблем, которые могут возникнуть на любом этапе процесса. Метод, представленный здесь, может быть применен для сравнения показателей потребления кислорода в различных трансгенных моделях мышей и изучения митохондриального ответа на медикаментозное лечение или другие факторы, такие как старение или пол. Это возможный метод ответа на важнейшие вопросы о метаболизме и регуляции митохондриальной биоэнергетики.

Протокол, представленный здесь, позволяет анализировать in vivo митохондриальное дыхание путем выделения митохондрий из скелетных мышц мыши. Схема метода показана на рисунке 1. После рассечения скелетных мышц от задних конечностей (рисунок 2) ткани го?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Здесь мы описываем подробный метод выделения митохондрий из скелетных мышц мыши и последующий анализ дыхания по скорости потребления кислорода (OCR) с использованием респирометрических анализов на основе микропластин. Этот конвейер может быть применен для изучения влияния многочисленных экологических или генетических вмешательств на митохондриальный метаболизм.

Выделение митохондрий из скелетных мышц мыши для респирометрических анализов

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Это слово описывает анализ дыхания при обработке митохондрий скелетных мышц мыши. Этот протокол значительно сокращает время очистки и позволяет обрабатывать несколько образцов одновременно. Митохондрии животных любого восьми пола объединенного происхождения могут быть изуродованы с помощью этого протокола, позволяющего изучать дыхание в самых разных экспериментальных условиях.Этот метод подходит для всех областей исследований, где функция митохондрий актуальна, включая старение, тестирование лекарств, рак или развитие. Он может быть даже адаптирован к другим тканям и организмам. Убедитесь, что все материалы холодные, поместив все на лед во время процедуры, чтобы защитить митохондрии от повреждений.Поместите на лед три стакана по 50 миллилитров на образец и добавьте 10 миллилитров PBS в стакан один, 10 миллилитров 10 миллимоляров EDTA PBS в стакан два и четыре миллилитра IB1 в стакан три. Распылите на правую заднюю конечность усыпленной мыши 70% этанолом, чтобы предотвратить выпадение меха, и приклейте конечность к пробковой рассеченной доске, а затем заклейте левую переднюю конечность. Сделайте разрез стерильным одноразовым скальпелем через кожу с колена до ног.Обхватите кожу зубчатыми щипцами на уровне лодыжки и разрежьте ее тонкими ножницами вокруг лодыжки. Освободите кожу от подлежащей мускулатуры с помощью тонкого пинцета в одной руке, одновременно подтягивая ее зубчатыми щипцами в другой руке. Рассекните все скелетные мышцы от лодыжки до колена и удалите всю соединительную ткань над передней мышцей большеберцовой кости с помощью тонкого пинцета и ножниц.Найдите четыре дистальных сухожилия мышцы-разгибателя digitorum longus и разделите их близко к их вставкам в пальцах ног. Найдите переднее дистальное сухожилие большеберцовой кости и обрежьте его близко к его вставке ниже лодыжки. Потяните передние и разгибательные сухожилия digitorum longus выше лодыжки, чтобы освободить свободные концы.Захватите свободные концы сухожилий и ослабьте мышцы от остальной мускулатуры в костях, подтянув их вверх. Отрежьте проксимальные сухожилия этих мышц как можно ближе к коленной чашечке. Переверните мышь вверх дном, чтобы продолжить извлечение икроножных и камбаловидных мышц.Захватите карман, образованный между бицепсом, феморисом и икроножной мышцей, и разделите эти мышцы, используя тонкие ножницы для визуализации проксимального сухожилия икроножной мышцы. Схватите и аккуратно срежьте дистальное ахиллово сухожилие тонкими ножницами. Отрежьте проксимальное сухожилие икроножной мышцы, освободив его с помощью подстилающей камбалы.Осторожно рассекните оставшиеся мышцы и повторно закрепите мышь в исходном положении, чтобы рассекнуть четырехглавую мышцу. Отбросьте жировую ткань, затем вставьте тонкий пинцет между квадрицепсами и бедренной костью, чтобы отделить мышцу от кости. Захватите дистальные сухожилия четырехглавой мышцы и срежьте сухожилие как можно ближе к коленной чашечке.Потяните квадрицепсы вверх и освободите их тонкими ножницами при проксимальном введении. Повторите то же самое для левой задней конечности. Промыть все мышцы стаканом одну, затем две, затем стакан три.Наконец, измельчите все мышцы в стакане три острыми ножницами на льду. Перенесите суспензию на трубку С, плотно закройте ее и прикрепите вверх ногами к втулке гомогенизатора. Разделите гомогенат на две предварительно охлажденные микроцентрифужные трубки по 2 миллилитра и центрифугу в течение 10 минут.Затем перенесите супернатант в новые предварительно охлажденные трубки и центрифугу еще на 10 минут. Объедините гранулу в 500 микролитров IB2 Перенесите супернатант в новую 2-миллилитрную предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку и пометьте его как супернатант номер два, или SN2. Re приостановить конечную митохондриальную гранулу в 200 микролитрах буфера re-суспензии.Быстро отложите 10 микролитров для количественной оценки белка и немедленно добавьте 10 микролитров 10% FFA BSA к оставшейся митохондриальной суспензии, чтобы предотвратить повреждение. Центрифугируйте концентрированную митохондриальную суспензию в 10 500 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Суспендировать митохондриальную гранулу в 100 микролитрах 1X связующей пробирной среды с BSA, 1X среды для анализа потока электронов с BSA или среды бета-окисления 1X с BSA, в зависимости от протокола, который будет выполнен.Разбавьте этот концентрированный митохондриальный образец до 0,2 мкг на микролитр, используя соответствующую пробирную среду. Посейте 50 микролитров суспензии на лунку в предварительно охлажденную 24-луночную микроплиту на льду. В фоновые коррекционные колодцы добавляют только соответствующую пробирную среду.Храните оставшуюся митохондриальную суспензию при минус 80 градусах Цельсия для определения чистоты фрагментации. Раскрутите микропластинку в предварительно охлажденной подготовительной центрифуге в течение 20 минут. А пока подогрейте оставшуюся пробирную среду до 37 градусов по Цельсию.После центрифугирования оставьте микропластинку на скамейке на пять минут, чтобы уравновесить. Медленно и осторожно добавляйте 450 микролитров теплой пробирной среды на лунку, чтобы избежать отсоединения митохондрий. Поместите микропластину немедленно в прибор для измерения потребления кислорода без крышки и запустите программу измерения.Убедитесь, что первым шагом является 10-минутная инкубация, чтобы микропластинка прогрелась. Как только эксперимент будет завершен, извлеките картридж и микропластину, выключите прибор и начните анализ. Общие профили белков из различных фракций, полученных путем серийных центрифугирования, показали различные белковые популяции в изолированных фракциях.Наличие всего митохондриального содержимого проявляется по сильным сигналам для маркеров внешней и внутренней митохондриальной мембраны и нуклеоидных ассоциированных белков. Фракция N представляет собой ядра и неразрушенный материал. Большинство эндоплазматических ретикулумов, плазматической мембраны или маркеров цитоплазмы во фракциях SN1 или SN2 подчеркивают высокую чистоту, полученную при выделении.Увеличение потребления кислорода наблюдалось после добавления АДФ в анализы связи и бета-окисления. После добавления карбонилцианида-п-трифторметоксифенилгидразона потребление кислорода достигло самого высокого уровня. Низкий коэффициент контроля дыхания обеспечивает целостность изолированных митохондрий.Анализ потока электронов исследовал активность комплексов электронной транспортной цепи по отдельности или в комбинации путем инъекции конкретных субстратов и ингибиторов. Изоляция митохондрий чрезвычайно чувствительна. Следовательно, все шаги после смягчения тканей должны выполняться усердно и осторожно, чтобы сохранить их жизнеспособность.Экспериментальные анализы могут дополняться детерминированным сематическим анализом ключевых молекул митохондрий или исследованием сборки респирометрических комплексов с использованием электрофореза синего нативного полиакриламидного геля.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Взрослые и эмбриональные скелетных мышц Microexplant культуры и выделение скелетных мышц стволовых клеток

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Митохондриальная Изоляция от скелетных мышц

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Очистка прародителей из скелетных мышц

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Лазерная нанесенные травмы рыбок данио эмбриональных скелетных мышц

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Выделение и культура Индивидуальные мышечных волокон и их сателлитные клетки от взрослых скелетных мышц

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Анализ скелетных мышц дефектов в личинок данио рерио по двулучепреломления и сенсорный вызывают Побег реагирования Анализы

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Выделение кровеносных сосудов, полученных мультипотентные прекурсоров от человека скелетных мышц

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Выделение и функциональный анализ митохондрий из культивируемых клеток и мышь ткани

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...