Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Vi vill tacka Juan J. Tena för användningen av homogenisatorn och CABD Proteomics and Animal Husbandry-anläggningarna för teknisk support. Detta arbete stöddes av det spanska ministeriet för utbildning, kultur och sport genom stipendium FPU16/03264 till J.D.H.C., Association Française contre les Myopathies (AFM) genom stipendiebidrag #22450 till C.V.-G., ett institutionellt bidrag MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis at CABD) och BFU2017-83150-P till JJ.C. Junta de Andalucía-bidraget P18-RT-4572, FEDER-finansieringsprogrammet från Europeiska unionen, och det spanska ministeriet för vetenskap, innovation och universitet beviljar RED2018-102576-T till P.N.

Mushus och vävnadsinsamling utfördes med hjälp av protokoll som godkänts av Universidad Pablo de Olavide etikkommitté (Sevilla, Spanien; protokoll 24/04/2018/056 och 12/03/2021/033) i enlighet med spanskt kungligt dekret 53/2013, europeiskt direktiv 2010/63/EU och andra relevanta riktlinjer.
1. Beredning av lager, buffertar och reagenser för andningsanalyser
<ol><li>Förbered följande lagerlösningar, som kan förvaras vid den angivna temperaturen i månader. Använd ...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

Alla metoder som används för att studera mitokondriell andning har sina begränsningar; Därför är det viktigt att välja den metod som bäst passar en specifik experimentell fråga. Detta arbete ger ett uppdaterat och detaljerat protokoll för att isolera mitokondrier från musskelettmuskeln för att utföra olika andningsanalyser för att undersöka mitokondriell funktion. Faktum är att studien av mitokondriell bioenergetik i isolerade mitokondrier med hjälp av mikroplattbaserad teknik är värdefull för att stu...

Mitokondrier är de primära metaboliska organellerna i cellen1. Dessa specialiserade membranslutna organeller använder näringsmolekyler för att producera energi i form av adenosintrifosfat (ATP) av OXPHOS. Denna process bygger på överföring av elektroner från givarmolekyler i en serie redoxreaktioner i ETC2. Q är den enda redoxaktiva lipiden som produceras endogent i alla cellulära membran och cirkulerande lipoproteiner som visar antioxidantfunktion3. Det är en väsentlig komponent i ETC, som överför elektroner från NADH-beroende komplex I och FADH2-beroende komplex II till komplex III, även om många andra reduktaser kan driva minskningen av mitokondriell q till ubiqinol som ett obligatoriskt steg i flera cellulära metaboliska vägar4,5.
Under hela processen skapas en elektrokemisk protongradient över det mitokondriella inre membranet, som omvandlas till biologiskt aktiv energi av ATP-syntaskomplexet V2. Följaktligen leder mitokondriell dysfunktion till en myriad av patologiska tillstånd som huvudsakligen påverkar vävnader med höga energibehov - hjärnan, hjärtat och skelettmuskeln6,7. Därför är det grundläggande att utveckla metoder för att noggrant analysera mitokondriella bioenergetik för att undersöka dess roll i hälsa och sjukdom, särskilt i mycket energiska vävnader som skelettmuskler.
Syreelektroden av Clark-typ har klassiskt använts i studien av mitokondriell andning8. Detta system har dock gradvis förskjutits av tekniker med högre upplösning, med mikroplattbaserad syreförbrukningsteknik som Agilent Seahorse XF-analysatorer som är särskilt populära9. Inom skelettmuskelfältet utförs dessa studier vanligtvis i odlade celler, främst i C2C12 odödliggjord mus myoblastcellinje eller primära kulturer härledda från satellitceller10,11. Dessa studier rekapitulerar emellertid inte helt situationen in vivo, särskilt när man undersöker mitokondriell biologi och funktion på vävnadsnivå vid specifika förolämpningar, icke-genetiska ingrepp eller genetiska manipulationer.
Dessutom är andningsanalyser i celler mer komplexa på grund av ytterligare faktorer, inklusive extramitokondriell efterfrågan på ATP- och analyssubstrat eller signalhändelser, vilket kan vilseleda tolkningen av resultaten. Alternativt är det också möjligt att använda singel eller buntar av nyisolerade myofibrer från muskler. Isoleringsmetoden är dock tekniskt utmanande och endast genomförbar för några få muskeltyper. I detta fall används flexor digitorum brevis (FDB) och extensor digitorum longus (EDL) muskler huvudsakligen10,12,13, även om några rapporter beskriver användningen av andra muskeltyper också14,15.
Bioenergetisk profilering av skelettmuskelsektioner har också rapporterats16. Den stora fördelen med denna metod är att intakta muskler kan studeras (författarna visar att skivning genom fibrer inte stör resultaten jämfört med isolerade myofibrer). Mitokondriell tillgång till substrat och analyshämmare är dock begränsad, och således kan endast ett fåtal parametrar mätas16. Slutligen kan isolerade mitokondrier också användas9,17,18,19. I detta fall förlorar mitokondrier sin cytosoliska miljö, vilket kan påverka deras funktion. Däremot garanterar denna metod tillgång till substrat och hämmare, möjliggör analys av en uppsjö av provtyper och kräver vanligtvis mindre material.
Denna uppsats beskriver en metod för att utföra bioenergetisk profilering av isolerade mitokondrier från musskelettmuskeln med hjälp av mikroplattbaserade respirometriska analyser (Figur 1). I synnerhet är tre protokoll detaljerade: kopplingsanalysen, CA för att bedöma graden av koppling mellan ETC och OXPHOS-maskinen; Elektronflödesanalysen, EFA för att mäta aktiviteten hos de enskilda ETC-komplexen. och BOX-analysen för att bestämma mitokondriell β oxidationskapacitet. I synnerhet krävs endast små mängder prover jämfört med konventionella respirometrimetoder. Isoleringsprotokollet som används här har modifierats från den metod som publicerats på annat håll18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

Det mesta av cellens energi erhålls genom nedbrytning av glukos, fettsyror och aminosyror genom olika vägar som konvergerar på mitokondriell oxidativ fosforylering (OXPHOS) -systemet, som regleras som svar på cellulära krav. Lipidmolekylen Koenzym Q (CoQ) är väsentlig i denna process genom att överföra elektroner till komplex III i elektrontransportkedjan (ETC) genom konstanta oxidations- / reduktionscykler. Mitokondriernas status och i slutändan cellulär hälsa kan bedömas genom att mäta ETC-syreförbrukning med hjälp av respirometriska analyser. Dessa studier utförs vanligtvis i etablerade eller primära cellinjer som har odlats i flera dagar. I båda fallen kan de erhållna andningsparametrarna ha avvikit från normala fysiologiska förhållanden i ett givet organ eller vävnad.
Dessutom hindrar de inneboende egenskaperna hos odlade enskilda fibrer isolerade från skelettmuskeln denna typ av analys. Detta dokument presenterar ett uppdaterat och detaljerat protokoll för analys av andning i nyligen isolerade mitokondrier från musskelettmuskeln. Vi tillhandahåller också lösningar på potentiella problem som kan uppstå när som helst i processen. Metoden som presenteras här kan tillämpas för att jämföra syreförbrukningshastigheter i olika transgena musmodeller och studera mitokondriellt svar på läkemedelsbehandlingar eller andra faktorer som åldrande eller kön. Detta är en genomförbar metod för att svara på avgörande frågor om mitokondriell bioenergetik metabolism och reglering.

Protokollet som presenteras här möjliggör in vivo-analys av mitokondriell andning genom isolering av mitokondrier från musskelettmuskeln. En översikt över metoden visas i figur 1. Efter dissekering av skelettmuskler från bakbenen (figur 2) homogeniseras vävnaderna och mitokondrier renas, under isotoniska förhållanden, genom seriella centrifugeringar. Renheten hos de olika fraktionerna som erhålls under isoleringsprocessen kan analyseras av we...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Här beskriver vi en detaljerad metod för mitokondriisolering från musskelettmuskeln och den efterföljande analysen av andning med oxygen consumption rate (OCR) med hjälp av mikroplattbaserade respirometriska analyser. Denna pipeline kan tillämpas för att studera effekterna av flera miljömässiga eller genetiska ingrepp på mitokondriell metabolism.

Isolering av mitokondrier från musskelettmuskel för respirometriska analyser

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Detta ord beskriver andningsanalys vid bearbetning av mitokondrier från musskelettmuskeln. Detta protokoll minskar reningstiden avsevärt och gör att flera prover kan bearbetas samtidigt. Mitokondrier från djur vid vilket åtta kön som helst med united-bakgrund kan stympas med hjälp av detta protokoll som möjliggör studier av andning under en mängd olika experimentella förhållanden.Denna metod är lämplig för alla forskningsområden där mitokondriernas funktion är relevant inklusive åldrande, drogtestning, cancer eller utveckling. Det kan till och med anpassas till andra vävnader och organismer också. Se till att allt material är kallt genom att placera allt på isen under proceduren för att skydda mitokondrier från skador.Placera tre 50 ml bägare per prov på is och tillsätt 10 ml PBS i bägare ett, 10 ml 10 millimolar EDTA PBS i bägare två och fyra milliliter IB1 i bägare tre. Spraya den högra bakbenet på en avlivad mus med 70% etanol för att förhindra att päls tappar och tejpa lemmen på korkdissektionsskivan och tejpa sedan vänster framben. Gör ett snitt med en steril engångsskalpell genom huden från knä till tå.Ta tag i huden med tandade pincett på fotledsnivå och skär den med fin sax runt fotleden. Lätta huden bort från den underliggande muskulaturen med fin spetspincett i ena handen medan du drar upp den med tandade pincett i den andra handen. Dissekera alla skelettmuskler från fotled till knä och ta bort all bindväv över tibialis främre muskel med fin pincett och sax.Hitta de fyra distala senorna i extensor digitorum longus-muskeln och sektionera dem nära deras införanden i tårna. Leta reda på tibialis främre distala senan och skär den nära dess införande under fotleden. Dra tibialis främre och extensor digitorum longus senor ovanför fotleden för att befria de lösa ändarna.Ta tag i de lösa ändarna av senorna och lätta musklerna bort från resten av muskulaturen i benen genom att dra upp dem. Skär de proximala senorna i dessa muskler så nära knäskålen som möjligt. Vänd musen upp och ner för att fortsätta med gastrocnemius och soleus muskelextraktion.Ta tag i fickan som bildas mellan biceps, femoris och gastrocnemius och separera dessa muskler med fin sax för att visualisera den proximala gastrocnemius senan. Greppa och skär försiktigt den distala hälsenena med fin sax. Skär den proximala gastrocnemius senan och frigör den med den underliggande soleusen.Dissekera försiktigt de återstående musklerna och fäst musen i det ursprungliga läget för att dissekera quadricepsmuskeln. Kassera fettvävnaden och sätt sedan in fin pincett mellan quadriceps och lårbenet för att separera muskeln från benet. Ta tag i de distala quadriceps muskelsenorna och skär senan så nära knäskålen som möjligt.Dra upp quadriceps och frigör dem med fin sax vid den proximala insättningen. Upprepa samma sak för vänster bakben. Skölj alla muskler i bägare ett, sedan två, följt av bägare tre.Slutligen hacka alla muskler i bägare tre med vass sax på is. Överför upphängningen till ett C-rör, stäng den ordentligt och fäst den upp och ner på homogenisatorns hylsa. Dela homogenatet i två 2 ml förkylda mikrocentrifugrör och centrifug i 10 minuter.Överför sedan supernatanten till nya förkylda rör och centrifug i ytterligare 10 minuter. Kombinera pelletsen i 500 mikroliter IB2 Överför supernatanten till ett nytt 2 ml förkylt mikrocentrifugrör och märk det som supernatant nummer två, eller SN2. Re suspendera den slutliga mitokondriella pelleten i 200 mikroliter re suspension buffert.Avsätt snabbt 10 mikroliter för proteinkvantifiering och tillsätt omedelbart 10 mikroliter 10% FFA BSA till den återstående mitokondriella suspensionen för att förhindra skador. Centrifugera den koncentrerade mitokondriella suspensionen vid 10 500 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Re suspendera mitokondriell pellet i 100 mikroliter 1X kopplingsanalysmedium med BSA, 1X elektronflödesanalysmedium med BSA eller 1X betaoxidationsmedium med BSA, beroende på vilket protokoll som ska utföras.Späd detta koncentrerade mitokondriella prov till 0,2 mikrogram per mikroliter med användning av motsvarande analysmedium. Frö 50 mikroliter av suspensionen per brunn i en förkyld 24 brunn mikroplatta på is. Lägg endast till motsvarande analysmedium i bakgrundskorrigeringsbrunnarna.Förvara den återstående mitokondriella suspensionen vid minus 80 grader Celsius för bestämning av fragmenteringsrenhet. Snurra mikroplattan i den förkylda preparativa centrifugen i 20 minuter. Under tiden värmer du det återstående analysmediet till 37 grader Celsius.Efter centrifugering, lämna mikroplattan på bänken i fem minuter för att balansera. Tillsätt 450 mikroliter av det varma analysmediet per brunn långsamt och försiktigt för att undvika att mitokondrier lossnar. Placera mikroplattan omedelbart i mätinstrumentet för syreförbrukning utan lock och starta mätprogrammet.Se till att det första steget är en 10 minuters inkubation så att mikroplattan kan värmas upp. När experimentet är klart, ta bort patronen och mikroplattan, stäng av instrumentet och starta analysen. Allmänna proteinprofiler från de olika fraktionerna erhållna genom seriella centrifugeringar visade distinkta proteinpopulationer i de isolerade fraktionerna.Närvaron av allt mitokondriellt innehåll framgår av de starka signalerna för markörer för det yttre och inre mitokondriella membranet och nukleoidassocierade proteiner. Fraktion N representerar kärnor och ostört material. De flesta endoplasmatiska retikulum-, plasmamembran- eller cytoplasmamarkörerna i SN1- eller SN2-fraktionerna belyser den höga renheten som erhålls under isoleringen.En ökning av syreförbrukningen observerades efter ADP-tillsats i kopplings- och betaoxidationsanalyserna. Efter karbonylcyanid-p-trifluormetoxifenylhydrazontillsats nådde syreförbrukningen sin högsta nivå. Ett lågt andningskontrollförhållande säkerställer integriteten hos de isolerade mitokondrierna.Elektronflödesanalysen undersökte aktiviteten hos elektrontransportkedjekomplexen individuellt eller i kombination genom injektion av specifika substrat och hämmare. Isolerande mitokondrier är extremt känsliga. Därför måste alla steg efter vävnadslindring utföras flitigt och noggrant för att bevara deras livskraft.Experimentella analyser kan kompletteras med en deterministisk sematisk analys av viktiga mitokondrimolekyler eller med studien av sammansättningen av respirometriska komplex med användning av blå infödd polyakrylamidgelelektrofores.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulta och embryonala skelettmuskler Microexplant Kultur och Isolering av skelettet muskelceller Stem

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitokondriell Isolering från skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Rening av stamceller från skelettmuskulatur

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-vållad skada av Zebrafish embryonala skelettmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering och odling av individuella Myofibers och deras satellit celler från vuxna skelettmuskulatur

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering av blod-kärl-härledda multi prekursorer från Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering och Funktionell analys av mitokondrier från odlade celler och mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...