Name: isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Juan J. Tena'ya homojenizatörün kullanımı için ve teknik destek için CABD Proteomik ve Hayvancılık tesislerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, İspanya Eğitim, Kültür ve Spor Bakanlığı tarafından FPU16/03264 - J.D.H.C., Association Française contre les Myopathies (AFM) tarafından C.V.-G.'ye burs hibesi #22450, Kurumsal Hibe MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Mükemmellik Birimi, CABD'de Gen Düzenleme ve Morfogenez Bölümü) ve BFU2017-83150-P ile J.J.C'ye desteklenmiştir. Endülüs Cuntası, P18-RT-4572, Avrupa Birliği'nden FEDER Finansman Programı ve İspanya Bilim, İnovasyon ve Üniversiteler Bakanlığı RED2018-102576-T'yi P.N.'ye hibe ediyor.

Fare muhafazası ve doku toplama, Universidad Pablo de Olavide Etik Komitesi (Sevilla, İspanya; protokoller 24/04/2018/056 ve 12/03/2021/033) tarafından onaylanan protokoller kullanılarak İspanya Kraliyet Kararnamesi 53/2013, Avrupa Direktifi 2010/63/EU ve diğer ilgili yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Solunum tahlilleri için stokların, tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Belirtilen sıcaklıkta aylarca saklanabilen aşağıdaki sto...

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrion.">The mitochondrion.</a> Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).</li><li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q.">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li><li>Alc&#225;zar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency.">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li><li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallij&#228;rvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III:+biochemistry+and+pathophysiology.">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes.">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 165, 312-323 (2021).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746 (2011).</li><li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis.">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).</li><li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-&#312;B.">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-&#312;B.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles.">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li><li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers.">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li><li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry.">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart:+role+of+superoxide+dismutase-2.">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li><li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster.">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).</li></ol>

Mitokondriyal solunumu incelemek için kullanılan tüm yöntemlerin sınırlamaları vardır; Bu nedenle, belirli bir deneysel soruya en uygun yöntemi seçmek çok önemlidir. Bu çalışma, mitokondriyal fonksiyonu araştırmak için farklı solunum tahlilleri yapmak üzere mitokondrileri fare iskelet kasından izole etmek için güncellenmiş ve ayrıntılı bir protokol sağlar. Gerçekten de, mikroplaka bazlı teknolojiler kullanılarak izole mitokondride mitokondriyal biyoenerjetik çalışmaların incelenmesi, do...

Mitokondri, hücredeki birincil metabolik organellerdir1. Bu özel membranla çevrili organeller, OXPHOS tarafından adenozin trifosfat (ATP) formunda enerji üretmek için besin molekülleri kullanır. Bu süreç, ETC2'deki bir dizi redoks reaksiyonunda donör moleküllerden elektronların transferine dayanır. CoQ, tüm hücresel membranlarda endojen olarak üretilen ve antioksidan fonksiyon gösteren dolaşımdaki lipoproteinlerde bulunan tek redoks-aktif lipittir3. Elektronları NADH'ye bağımlı kompleks I ve FADH2'ye bağımlı kompleks II'den kompleks III'e aktaran ETM'nin önemli bir bileşenidir, ancak diğer birçok redüktaz, mitokondriyal CoQ'nun çoklu hücresel metabolik yollarda zorunlu bir adım olarak ubikinol'e indirgenmesini sağlayabilir4,5.
İşlem boyunca, ATP sentaz kompleksi V2 tarafından biyolojik olarak aktif enerjiye dönüştürülen mitokondriyal iç zar boyunca bir elektrokimyasal proton gradyanı oluşturulur. Sonuç olarak, mitokondriyal disfonksiyon, esas olarak yüksek enerji gereksinimi olan beyin, kalp ve iskelet kası gibi dokuları etkileyen sayısız patolojik duruma yol açar6,7. Bu nedenle, mitokondriyal biyoenerjetik maddeleri, özellikle iskelet kasları gibi yüksek enerjili dokularda, sağlık ve hastalıktaki rolünü araştırmak için doğru bir şekilde analiz etmek için yöntemler geliştirmek esastır.
Clark tipi oksijen elektrodu, mitokondriyal solunum çalışmasında klasik olarak kullanılmıştır8. Bununla birlikte, bu sistem giderek daha yüksek çözünürlüklü teknolojilerle yer değiştirmiştir ve Agilent Seahorse XF analizörleri gibi mikroplaka tabanlı oksijen tüketim teknolojileri özellikle popülerdir9. İskelet kası alanında, bu çalışmalar tipik olarak kültürlenmiş hücrelerde, özellikle C2C12 ölümsüzleştirilmiş fare miyoblast hücre hattında veya uydu hücrelerinden türetilen birincil kültürlerde gerçekleştirilir10,11. Bununla birlikte, bu çalışmalar, özellikle mitokondriyal biyolojiyi araştırırken ve belirli hakaretler, genetik olmayan müdahaleler veya genetik manipülasyonlar üzerine doku düzeyinde işlev görürken, durumu in vivo olarak tam olarak özetlememektedir.
Ayrıca, hücrelerdeki solunum tahlilleri, ATP'nin mitokondriyal olmayan talebi ve sonuçların yorumlanmasını yanlış yönlendirebilecek tahlil substratları veya sinyal olayları da dahil olmak üzere ek faktörler nedeniyle daha karmaşıktır. Alternatif olarak, kaslardan yeni izole edilmiş miyoliflerin tek veya demetlerini kullanmak da mümkündür. Bununla birlikte, izolasyon yöntemi teknik olarak zordur ve sadece birkaç kas tipi için uygulanabilir. Bu durumda, fleksör digitorum brevis (FDB) ve ekstansör digitorum longus (EDL) kasları esas olarak kullanılır10,12,13, ancak birkaç rapor diğer kas tiplerinin kullanımını da açıklamaktadır14,15.
İskelet kası kesitlerinin biyoenerjetik profillemesi de bildirilmiştir16. Bu yöntemin en büyük avantajı, sağlam kasların çalışılabilmesidir (yazarlar, liflerden dilimlemenin, izole miyoliflerle karşılaştırıldığında sonuçları rahatsız etmediğini göstermektedir). Bununla birlikte, substratlara ve tahlil inhibitörlerine mitokondriyal erişim sınırlıdır ve bu nedenle sadece birkaç parametre ölçülebilir16. Son olarak, izole mitokondri de aynı şekilde kullanılabilir9,17,18,19. Bu durumda, mitokondri sitozolik ortamlarını kaybeder ve bu da işlevlerini etkileyebilir. Buna karşılık, bu yöntem substratlara ve inhibitörlere erişimi garanti eder, çok sayıda numune tipinin analizini sağlar ve tipik olarak daha az malzeme gerektirir.
Bu yazıda, mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak fare iskelet kasından izole edilmiş mitokondrinin biyoenerjetik profillemesini gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1). Özellikle, üç protokol detaylandırılmıştır: ETC ve OXPHOS makineleri arasındaki bağlantı derecesini değerlendirmek için Kaplin Testi, CA; Elektron Akış Testi, bireysel ETC komplekslerinin aktivitesini ölçmek için EFA; ve mitokondriyal β-oksidasyon kapasitesini belirlemek için BOX testi. Özellikle, geleneksel respirometri yöntemlerine kıyasla sadece az miktarda numune gereklidir. Burada kullanılan yalıtım protokolü, başka bir yerde yayınlanan yöntemden değiştirilmiştir18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>C67E7</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Goat HRP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401504</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7076</td>
			<td>Horse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#7074</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MBS4-48085</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td>It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V, Fatty Acid-Free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Purple lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calnexin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA3-027</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BDH</td>
			<td>280254D</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP70 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10995-1-AP</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH-A antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC27230</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-255260A</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BMG LABTECH GmbH</td>
			<td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore system</td>
			<td>F7HA17757A</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtTFA antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC23588</td>
			<td>Goat (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+/K+-ATPase &#945;1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-14755</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>1x stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-203211</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60377</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td>Stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420179</td>
			<td>XFe24 model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102342-100</td>
			<td>The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7626</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Stock at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMM23 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab230253</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7394</td>
			<td>Stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOMM20 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab56783</td>
			<td>Mouse (Host species)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>Rabbit (Host species)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays

Hücrenin enerjisinin çoğu, glikozun, yağ asitlerinin ve amino asitlerin, hücresel taleplere yanıt olarak düzenlenen mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) sistemi üzerinde birleşen farklı yollarla parçalanmasıyla elde edilir. Lipid molekülü Koenzim Q (CoQ), elektronları sabit oksidasyon/indirgeme döngüleri yoluyla elektron taşıma zincirindeki (ETM) kompleks III'e aktararak bu süreçte esastır. Mitokondri durumu ve nihayetinde hücresel sağlık, respirometrik testler kullanılarak ETC oksijen tüketiminin ölçülmesiyle değerlendirilebilir. Bu çalışmalar tipik olarak birkaç gündür kültürlenmiş yerleşik veya birincil hücre hatlarında gerçekleştirilir. Her iki durumda da, elde edilen solunum parametreleri, herhangi bir organ veya dokudaki normal fizyolojik koşullardan sapmış olabilir.
Ek olarak, iskelet kasından izole edilen kültürlenmiş tek liflerin içsel özellikleri bu tür analizleri engellemektedir. Bu yazıda, fare iskelet kasından yeni izole edilmiş mitokondrilerde solunumun analizi için güncellenmiş ve ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, sürecin herhangi bir adımında ortaya çıkabilecek potansiyel sorunlara da çözümler sunuyoruz. Burada sunulan yöntem, çeşitli transgenik fare modellerinde oksijen tüketim oranlarını karşılaştırmak ve ilaç tedavilerine veya yaşlanma veya cinsiyet gibi diğer faktörlere mitokondriyal yanıtı incelemek için uygulanabilir. Bu, mitokondriyal biyoenerjetik metabolizma ve düzenleme ile ilgili önemli sorulara cevap vermek için uygun bir yöntemdir.

Burada sunulan protokol, mitokondrinin fare iskelet kasından izole edilmesi yoluyla mitokondriyal solunumun in vivo analizine izin verir. Yöntemin bir anahattı Şekil 1'de gösterilmiştir. İskelet kasları arka bacaklardan diseke ettikten sonra (Şekil 2), dokular homojenize edilir ve izotonik koşullar altında, seri santrifüjlemeler yoluyla mitokondri saflaştırılır. İzolasyon işlemi sırasında elde edilen farklı fraksiyonların saflığ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays at JoVE.com

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Bu kelime, fare iskelet kasından mitokondri işlenmesinde solunum analizini açıklar. Bu protokol saflaştırma süresini önemli ölçüde azaltır ve aynı anda birden fazla numunenin işlenmesine izin verir. Birleşik arka plana sahip herhangi sekiz cinsiyetteki hayvanlardan elde edilen mitokondri, çok çeşitli deneysel koşullarda solunum çalışmasını sağlayan bu protokol kullanılarak parçalanabilir.Bu yöntem, yaşlanma, ilaç testi, kanser veya gelişme dahil olmak üzere mitokondri fonksiyonunun ilgili olduğu tüm araştırma alanları için uygundur. Diğer dokulara ve organizmalara da uyarlanabilir. Mitokondrileri hasardan korumak için prosedür sırasında her şeyi buzun üzerine yerleştirerek tüm malzemelerin soğuk olduğundan emin olun.Buz üzerine numune başına üç adet 50 mililitrelik beher yerleştirin ve bir beherde 10 mililitre PBS, ikinci beherde 10 mililitre 10 milimolar EDTA PBS ve üçüncü beherde dört mililitre IB1 ekleyin. Kürkün dökülmesini önlemek için ötenazi yapılmış bir farenin sağ arka bacağına% 70 etanol püskürtün ve uzuvları mantar diseksiyon panosuna bantlayın, ardından sol ön ekstremiteyi bantlayın. Steril tek kullanımlık neşter ile dizden ayak parmağına kadar deriden bir kesi yapın.Cildi ayak bileği seviyesinde dişli forseps ile tutun ve ayak bileği çevresinde ince makasla kesin. Bir elinizde ince uçlu cımbızla cildi altta yatan kas yapısından uzaklaştırırken, diğer yandan dişli forseps ile yukarı çekin. Ayak bileğinden dize kadar tüm iskelet kaslarını disseke edin ve ince cımbız ve makas kullanarak tibialis ön kası üzerindeki tüm bağ dokusunu çıkarın.Ekstansör digitorum longus kasının dört distal tendonunu bulun ve ayak parmaklarındaki yerleştirmelerine yakın bir şekilde kesitleyin. Tibialis anterior distal tendonunu bulun ve ayak bileğinin altına yerleştirilmesine yakın bir yerde kesin. Gevşek uçları serbest bırakmak için tibialis anterior ve extensor digitorum longus tendonlarını ayak bileğinin üzerine çekin.Tendonların gevşek uçlarını tutun ve kasları yukarı çekerek kemiklerdeki kas sisteminin geri kalanından uzaklaştırın. Bu kasların proksimal tendonlarını diz kapağına mümkün olduğunca yakın kesin. Gastroknemius ve soleus kas ekstraksiyonuna devam etmek için fareyi baş aşağı çevirin.Pazılar, femoris ve gastroknemius arasında oluşan cebi tutun ve proksimal gastroknemius tendonunu görselleştirmek için ince makas kullanarak bu kasları ayırın. Distal Aşil tendonunu ince makasla tutun ve dikkatlice kesin. Proksimal gastroknemius tendonunu altta yatan soleus ile serbest bırakarak kesin.Kalan kasları dikkatlice inceleyin ve kuadriseps kasını diseke etmek için fareyi ilk pozisyonda yeniden sabitleyin. Yağ dokusunu atın, ardından kası kemikten ayırmak için kuadriseps ve femur arasına ince cımbız yerleştirin. Distal kuadriseps kas tendonlarını tutun ve tendonu diz kapağına mümkün olduğunca yakın kesin.Kuadrisepsleri yukarı çekin ve proksimal yerleştirmede ince makasla serbest bırakın. Sol arka bacak için de aynısını tekrarlayın. Tüm kasları beherde bir, sonra iki, ardından beher üçünde durulayın.Son olarak, beherdeki tüm kasları buz üzerinde keskin makasla üç kez doğrayın. Süspansiyonu bir C tüpüne aktarın, sıkıca kapatın ve homojenizatörün manşonuna baş aşağı takın. Homojenatı iki adet 2 mililitrelik önceden soğutulmuş mikro santrifüj tüpüne bölün ve 10 dakika boyunca santrifüj yapın.Daha sonra süpernatantı yeni önceden soğutulmuş tüplere aktarın ve 10 dakika daha santrifüj yapın. Peleti 500 mikrolitre IB2'de birleştirin Süpernatantı yeni bir 2 mililitrelik önceden soğutulmuş mikro santrifüj tüpüne aktarın ve iki numaralı süpernatant veya SN2 olarak etiketleyin. Son mitokondriyal peleti 200 mikrolitre re süspansiyon tamponunda yeniden askıya alın.Protein miktarı için hızlı bir şekilde 10 mikrolitre ayırın ve hasarı önlemek için kalan mitokondriyal süspansiyona derhal 10 mikrolitre% 10 FFA BSA ekleyin. Konsantre mitokondriyal süspansiyonu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.500 kez G'de santrifüj yapın. Mitokondriyal peleti, gerçekleştirilecek protokole bağlı olarak, BSA ile 100 mikrolitre 1X kuplaj tahlil ortamı, BSA ile 1X elektron akış testi ortamı veya BSA ile 1X beta oksidasyon ortamı içinde yeniden askıya alın.Bu konsantre mitokondriyal numuneyi, karşılık gelen tahlil ortamını kullanarak mikrolitre başına 0.2 mikrograma seyreltin. Buz üzerinde önceden soğutulmuş 24 kuyucuklu mikro plakada kuyu başına süspansiyonun 50 mikrolitresini tohumlayın. Arka plan düzeltme kuyularında, yalnızca ilgili tahlil ortamını ekleyin.Parçalanma saflığının belirlenmesi için kalan mitokondriyal süspansiyonu eksi 80 santigrat derecede saklayın. Mikro plakayı önceden soğutulmuş hazırlık santrifüjünde 20 dakika boyunca döndürün. Bu arada, kalan tahlil ortamını 37 santigrat dereceye ısıtın.Santrifüjlemeden sonra, dengelemek için mikro plakayı tezgahta beş dakika bekletin. Mitokondrinin ayrılmasını önlemek için kuyu başına 450 mikrolitre ılık tahlil ortamını yavaşça ve dikkatlice ekleyin. Mikro plakayı hemen oksijen tüketimi ölçüm cihazına kapaksız olarak yerleştirin ve ölçüm programını başlatın.Mikro plakanın ısınmasına izin vermek için ilk adımın 10 dakikalık bir inkübasyon olduğundan emin olun. Deney bittiğinde, kartuşu ve mikro plakayı çıkarın, cihazı kapatın ve analize başlayın. Seri santrifüjlemelerle elde edilen farklı fraksiyonlardan elde edilen genel protein profilleri, izole fraksiyonlarda farklı protein popülasyonları göstermiştir.Tüm mitokondriyal içeriğin varlığı, dış ve iç mitokondriyal membranın belirteçleri ve nükleoid ile ilişkili proteinler için güçlü sinyallerle belirgindir. Fraksiyon N, çekirdekleri ve bozulmamış materyali temsil eder. SN1 veya SN2 fraksiyonlarındaki endoplazmik retikulum, plazma membranı veya sitoplazma belirteçlerinin çoğu, izolasyon sırasında elde edilen yüksek saflığı vurgulamaktadır.Kaplin ve beta oksidasyon testlerinde ADP ilavesinden sonra oksijen tüketiminde bir artış gözlenmiştir. Karbonil siyanür-p-triflorometoksi fenilhidrazon ilavesinden sonra oksijen tüketimi en yüksek seviyeye ulaşmıştır. Düşük solunum kontrol oranı, izole mitokondrinin bütünlüğünü sağlar.Elektron akış testi, elektron taşıma zinciri komplekslerinin aktivitesini ayrı ayrı veya spesifik substratların ve inhibitörlerin enjeksiyonu yoluyla kombinasyon halinde inceledi. İzole edici mitokondri son derece hassastır. Bu nedenle, doku azaltma işleminden sonraki tüm adımların, canlılıklarını korumak için özenle ve dikkatle uygulanması gerekir.Deneysel tahliller, anahtar mitokondri moleküllerinin deterministik bir sematik analizi veya mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak respirometrik komplekslerin montajının incelenmesi ile tamamlanabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...