Name: quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

ويود المؤلفان أن يشكرا ماريا بيلار كريسبو وبولا أليخاندرا أبادي من مركز البحوث في مجال الكيمياء الحيوية وعلم الاندماج، كونيسيت - أون سي، قرطبة، الأرجنتين، وغابرييلا فورلان ونويليا مالدونادو على المساعدة في زراعة الخلايا. كما نشكر فيكتور دياز (نائب وزير الاتصالات المؤسسية في FCQ) على إنتاج الفيديو وتحريره.
تم تمويل هذه المقالة من خلال منح من أمانة العلوم والتكنولوجيا ، والجامعة الوطنية في قرطبة (SECyT-UNC) التضامنية 2018-2021 ، و Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) ، و Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (جميعها إلى M.C.S.).

ملاحظة: للحصول على تركيبات المخزن المؤقت، راجع الجدول 1.
1. إعداد زراعة الخلايا
ملاحظة: فيما يلي التحضير الاستزراعي لخلايا MIO-M1 ، وهو خط خلايا دبقية بشري مخلد تلقائيا من مولر (مورفيلد / معهد طب العيون - مولر 1). استخدم دائما تقنية التعقيم المناسبة...

<ol>
	<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+retina:+M&#252;ller+glia+commanding+survival+and+death.">A journey into the retina: M&#252;ller glia commanding survival and death.</a> European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).</li><li>Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+and+diabetic+retinopathy.">M&#252;ller cells and diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 93-100 (2017).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Kamalden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+microRNA-15a+transfer+from+the+pancreas+augments+diabetic+complications+by+inducing+oxidative+stress.">Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress.</a> Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+inflammatory+cytokine+TNF&#945;+is+upregulated+in+retinal+angiogenesis+under+hyperoxia.">Transcription of inflammatory cytokine TNF&#945; is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia.</a> Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).</li><li>Rojas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX2-induced+activation+of+arginase+and+diabetes-induced+retinal+endothelial+cell+senescence.">NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence.</a> Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).</li><li>Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+nitric+oxide+synthase+mediates+retinal+apoptosis+in+ischemic+proliferative+retinopathy.">Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).</li><li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase,+NOX1,+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy.">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li><li>Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+triggered+by+oxidative+stress+that+mediate+features+of+severe+retinopathy+of+prematurity.">Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity.</a> JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M&#252;ller+glial+cells.">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal M&#252;ller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells:+The+role+of+M&#252;ller+glial+cells+and+NRF2.">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of M&#252;ller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M&#252;ller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc(-),+the+Na(+)-independent+glutamate-cystine+exchanger.">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal M&#252;ller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li><li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability.">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice.">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li><li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light.">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A.">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury.">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching.">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li><li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy.">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion.">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li><li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III.">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li><li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc&#947;R+cross-linking.">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to Fc&#947;R cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems.">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV.">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li></ol>

العديد من الحالات المرضية ، مثل السرطان والأمراض الالتهابية ونقص التروية / التروية وأمراض القلب الإقفارية والسكري واعتلال الشبكية ، وكذلك الحالات الفسيولوجية مثل الشيخوخة ، تؤدي إلى فرط إنتاج ROS6،7،8،9،10<su...

الشبكية العصبية هي نسيج منظم للغاية يقدم طبقات عصبية محددة جيدا. في هذه ، ترتبط الخلايا العصبية (العقدة ، الأمكرين ، الخلايا ثنائية القطب ، الأفقية ، والمستقبلات الضوئية) ببعضها البعض وكذلك مع خلايا مولر الدبقية (MGCs) والخلايا النجمية ، مما يؤدي إلى نقل ضوئي كاف ومعالجة المعلومات البصرية 1,2. من المعروف أن MGCs لها دور مهم في الحفاظ على توازن الشبكية لأنها تعبر قسم الشبكية بأكمله ، وبالتالي ، يمكنها التفاعل مع جميع أنواع الخلايا التي تعدل عمليات الحماية المتعددة. وقد أفيد أن MGCs لديها العديد من الوظائف الهامة للحفاظ على وبقاء الخلايا العصبية الشبكية ، بما في ذلك تحلل السكر لتوفير الطاقة للخلايا العصبية ، وإزالة النفايات العصبية ، وإعادة تدوير الناقلات العصبية ، وإطلاق عوامل التغذية العصبية ، من بين أمور أخرى3،4،5.
من ناحية أخرى ، يشارك الالتهاب والإجهاد التأكسدي والنيتروجيني في التسبب في العديد من الأمراض البشرية وتطورها ، بما في ذلك اعتلالات الشبكية6،7،8،9،10،11. يعتمد توازن الأكسدة والاختزال في الخلايا على التنظيم الصارم لمستويات ROS. يتم إنشاء ROS باستمرار في ظل الظروف الفسيولوجية نتيجة للتنفس الهوائي بشكل رئيسي. يشمل الأعضاء الرئيسيون في عائلة ROS الجذور الحرة التفاعلية مثل أنيون الأكسيد الفائق (O 2 ̘ ̘ •−) ، وجذور الهيدروكسيل (•OH) ، والبيروكسيدات المختلفة (ROOR′) ، والهيدروبيروكسيدات (ROOH) ، وبيروكسيد الهيدروجين غير الجذري (H 2 O 2)12,13. في السنوات الأخيرة ، أصبح من الواضح أن ROS يلعب دورا مهما في الإشارة في الخلايا من خلال التحكم في العمليات الأساسية. تتمتع MGCs بدفاع قوي مضاد للأكسدة عن طريق تنشيط العامل النووي النسخي الإريثرويد 2 المرتبط بالعامل 2 (Nrf2) والتعبير اللاحق عن البروتينات المضادة للأكسدة للقضاء على الإنتاج المفرط ل ROS في ظل الظروف المرضية14،15،16. عندما تفقد الخلايا توازن الأكسدة والاختزال بسبب الإنتاج المبالغ فيه ل ROS أو القدرة المعيبة على إزالة ROS ، فإن تراكم الإجهاد التأكسدي يعزز التعديلات الضارة في البروتينات والدهون والحمض النووي ، مما يؤدي إلى الإجهاد الخلوي أو الموت. تعمل زيادة نظام الدفاع المضاد للأكسدة في الشبكية على تحسين دقة اعتلالات الشبكية والوقاية منها ، مثل ROP و RD 17,18,19,20,21,22,23,24. لذلك ، يعد قياس إنتاج ROS في الوقت الفعلي أداة قوية ومفيدة.
هناك عدة طرق لقياس إنتاج ROS أو الإجهاد التأكسدي في الخلايا. من بين هذه ، مسبار ثنائي الأسيتات ثنائي كلورو فلوريسين ثنائي الفلور ثنائي الأسيتات (DCFH-DA) هو واحد من أكثر التقنيات استخداما على نطاق واسع لتحديد حالة الأكسدة والاختزال للخلية مباشرة25،26،27،28. هذا المسبار محب للدهون وغير فلورسنت. يسمح انتشار هذا المسبار عبر غشاء الخلية بانقسامه بواسطة الاسترازات داخل الخلايا في رابطتي الإستر ، مما ينتج منتجا قطبيا نسبيا وغير منفذ بغشاء الخلية ، 2′,7′-dichlorofluorescein (H2DCF). يتراكم هذا الجزيء غير الفلوري داخل الخلايا ، وينتج عن الأكسدة اللاحقة بواسطة ROS المنتج DCF عالي الفلورسنت. أكسدة المسبار هي نتاج عمل أنواع متعددة من ROS (البيروكسينتريت ، جذور الهيدروكسيل ، أكسيد النيتريك ، أو البيروكسيدات) ، والتي يمكن اكتشافها عن طريق قياس التدفق الخلوي أو المجهر البؤري (الانبعاثات عند 530 نانومتر والإثارة عند 485 نانومتر). الحد من هذه التقنية هو أن الأكسيد الفائق وبيروكسيد الهيدروجين لا يتفاعلان بقوة مع H2DCF25,29. في هذه المقالة ، نستخدم مسبار DCFH-DA لقياس وقياس ROS عن طريق قياس التدفق الخلوي. لهذا السبب ، فإننا نحث على إنتاج ROS عن طريق تحفيز MGCs باستخدام محفز ROS ، A أو B ، قبل تحميل الخلايا باستخدام مسبار الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، نستخدم مركبا مضادا للأكسدة. أخيرا ، نعرض بيانات تمثيلية وموثوقة تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-DCFH-DA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 100x20 mm</td>
			<td>Cell Star- Greiner Bio-One</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Sorvall legend micro 17 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>CRYO.S - Greiner Bio-One</td>
			<td>126263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Internegocios</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer, Neubauer chamber</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-6E8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>A12860-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>BD-352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>822335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 6 well</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>111732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.5% 10X</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells

توازن الأكسدة والاختزال له دور مهم في الحفاظ على التوازن الخلوي. يعزز الجيل المتزايد من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تعديل البروتينات والدهون والحمض النووي ، مما قد يؤدي في النهاية إلى تغيير في الوظيفة الخلوية وموت الخلايا. لذلك ، من المفيد للخلايا زيادة دفاعها المضاد للأكسدة استجابة للإهانات الضارة ، إما عن طريق تنشيط مسار مضاد للأكسدة مثل Keap1 / Nrf2 أو عن طريق تحسين زبالات الأكسدة والاختزال (الفيتامينات A و C و E β كاروتين والبوليفينول ، من بين أمور أخرى). يشارك الالتهاب والإجهاد التأكسدي في التسبب في اعتلال الشبكية وتطوره ، مثل اعتلال الشبكية السكري (DR) واعتلال الشبكية الخداجي (ROP). نظرا لأن خلايا مولر الدبقية (MGCs) تلعب دورا رئيسيا في توازن أنسجة الشبكية العصبية ، فإنها تعتبر نموذجا مثاليا لدراسة آليات الحماية الخلوية هذه. وبهذا المعنى ، فإن تحديد مستويات ROS كميا بطريقة بسيطة وقابلة للتكرار أمر ضروري لتقييم مساهمة المسارات أو الجزيئات التي تشارك في آلية الدفاع عن الخلايا المضادة للأكسدة. في هذه المقالة ، نقدم وصفا كاملا للإجراءات المطلوبة لقياس ROS باستخدام مسبار DCFH-DA وقياس التدفق الخلوي في MGCs. يتم توفير الخطوات الرئيسية لمعالجة بيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام البرنامج هنا ، بحيث سيتمكن القراء من قياس مستويات ROS (الوسائل الهندسية ل FITC) وتحليل الرسوم البيانية الفلورية. هذه الأدوات مفيدة للغاية لتقييم ليس فقط الزيادة في ROS بعد إهانة خلوية ولكن أيضا لدراسة التأثير المضاد للأكسدة لبعض الجزيئات التي يمكن أن توفر تأثيرا وقائيا على الخلايا.

كما هو موضح في قسم البروتوكول ، أظهرنا بيانات تمثيلية وكمية توضح اكتشاف التدفق الخلوي لإنتاج ROS باستخدام مسبار التألق DCFH-DA من خلايا MIO-M1 التي تم تحفيزها باستخدام محفز ROS ، A أو B. كما هو متوقع ، لاحظنا تغيرات في تألق FITC في الخلايا غير المحفزة فوق مستويات التألق الذاتي (الشكل 1A ،...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²,7ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÆ’Ã‚Â¼ller Glial Cells

هنا ، نقترح بروتوكولا منهجيا ويمكن الوصول إليه وقابلا للتكرار للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية الخلوية (ROS) باستخدام مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلوروريسين ثنائي الفلور 2′,7′ (DCFH-DA) في خلايا مولر الدبقية (MGCs). تحدد هذه الطريقة إجمالي مستويات ROS الخلوية باستخدام مقياس التدفق الخلوي. هذا البروتوكول سهل الاستخدام للغاية ومناسب وقابل للتكرار.

القياس الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو الفلوريسين ثنائي كلورو فلوريسين 2′,7′ وقياس التدفق الخلوي في خلايا مولر الدبقية

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

هناك عدة طرق لقياس إنتاج ROS ، أو الإجهاد التأكسدي في الخلايا. من بين هذه ، 2'7'dichlorofluorescein ثنائي أسيتات التحقيق هي واحدة من أكثر التقنيات استخداما على نطاق واسع لقياس حالة الأكسدة والاختزال مباشرة. هذا المسبار محب للدهون وغير فلورسنت. يسمح انتشار هذا المسبار عبر غشاء الخلية بانقسام الإستراز داخل الخلايا في رابطتي الإستر ، مما ينتج منتجا قطبيا نسبيا وغير منفذ بغشاء الخلية. تتراكم هذه الجزيئات غير الفلورية داخل الخلايا ، وتنتج الأكسدة اللاحقة بواسطة ROS المنتج عالي الفلورسنت ثنائي كلورو فلوريسين. أكسدة المسبار هي نتاج عمل أنواع متعددة من ROS. والتي يمكن اكتشافها عن طريق قياس التدفق الخلوي أو المجهر البؤري. في هذه المقالة ، استخدمنا مسبارا ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلوريسين لقياس وقياس ROS عن طريق قياس التدفق الخلوي. انقل لوحات 6 آبار إلى غطاء تدفق صفائحي من الحاضنة. شفط السوبرناتانت. واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. أضف 2 مل من مصل DMEM منخفض لكل بئر. واحتضن لوحة 6 بئر لمدة ساعتين في الحاضنة. علاج الخلايا مع مضادات الأكسدة لمدة ست ساعات. عالج الخلايا باستخدام محفز ROS ، A أو B ، لمدة 30 دقيقة. شفط السوبرناتانت. واغسل الخلية ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة جميع المحفزات. أطفئ ضوء غطاء التدفق الرقائقي واعمل في الظلام. أضف 1 مل من مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلوريسين في DMEM بدون الفينول الأحمر. أضف 1 مل من DMEM بدون الفينول الأحمر إلى خلايا التحكم في التألق الذاتي. احتضن لوحة 6 بئر لمدة 30 دقيقة في الحاضنة. انقل الألواح على الجليد إلى المختبر. اغسل الخلايا ثلاث مرات مع 2 مل من PBS البارد لكل بئر. أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت المنفصل البارد إلى كل بئر. حصاد الخلايا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000. اجمعها في أنبوب 1.5 مل. وقم بطردها مركزيا عند 600 × g لمدة خمس دقائق عند 4 C.تخلص من supernatant بعناية ، وافصل الحبيبات بلطف مع التنصت. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS لغسل الخلايا إلى كل أنبوب ملصق. إذا لزم الأمر ، استخدم الدوامة بأقل كثافة للانفصال الكامل للبيليه. قم بطردها مركزيا عند 600 × g لمدة خمس دقائق عند 4 C.كرر هذه الخطوة مرتين أكثر. ثلاث غسلات في المجموع. أعد تعليق كريات الخلايا في 200 لتر من المخزن المؤقت FACS. افصل بلطف الكريات تماما في كل أنبوب باستخدام الدوامة. ونقل إلى 5 مل المسمى لأنابيب التدفق الخلوي. احتفظ بالأنابيب على الجليد حتى يتم تحليلها على مقياس التدفق الخلوي. باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي ، قم بإنشاء تجربة جديدة. انقر فوق العينة وسيقوم بفتح قائمة بالأنابيب. انقر نقرا مزدوجا فوقها وأعد تسميتها. ضع أنبوب التحكم في التألق الذاتي على ذراع الشافط، مع تحريك القاعدة بعناية إلى اليسار فقط. انقر فوق الحصول على البيانات ثم فوق تسجيل البيانات، وحدد شرط الإيقاف المطلوب. ارسم بوابة حول الخلايا المثيرة للاهتمام ، باستثناء الخلايا الميتة والحطام. قم بإزالة الأنبوب. انقر فوق الأنبوب التالي وقم بتشغيل نموذج التحكم الأساسي. انقر فوق الحصول على البيانات ثم في سجل البيانات.افتح البرنامج. أضف العينات باستخدام زر الإجراء إضافة عينات. انقر فوق إضافة عينة.حدد مجلد التاريخ التجريبي وانقر فوق اختيار.انقر نقرا مزدوجا فوق العينة الأولى في مساحة العمل، عنصر تحكم التألق التلقائي في هذه الحالة. ارسم بوابة مضلع لعزل الخلية ذات الأهمية ، باستثناء الخلايا الميتة والحطام. تغيير المؤامرة إلى رسم بياني. انقر نقرا مزدوجا داخل M

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

تحديد أنواع غشاء الميتوكوندريا المحتملة والأوكسجين التفاعلي في الخلايا العصبية الفئران الحية القشرية

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

عزل LacZ - معربا عن خلايا من أنسجة الأذن الداخلية باستخدام الماوس التدفق الخلوي

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

الفحص Neuroblast: والفحص للانشاء وإثراء خلايا متعلق بالخلايا العصبية السلف من التفريق العصبية الجذعية آله الخلية باستخدام التدفق الخلوي

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

تقييم الجدوى العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات-بروبيديوم يوديد تلطيخ مزدوج في المخيخ الحبيبية الثقافة العصبية

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

كمي من إندوسوم و ليسوسوم التحركات في الخلايا العصبية المستزرعة باستخدام تحقيقات الفلورسنت

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

تحليل للخلايا المناعية في واحد الوركي الأعصاب والعقدة الظهرية الجذرية من ماوس واحدة باستخدام التدفق الخلوي

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

استخدام التصوير المقطعي التماسك البصري والاستجابة أوبتوكينيتيك كقراءات النظام المرئي الهيكلية والوظيفية في الفئران والجرذان

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

طريقه لأعاده البناء 3D وتحليل الواقع الافتراضي للخلايا العصبية والخلايا الددالي

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...