Name: quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke María Pilar Crespo og Paula Alejandra Abadie fra CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) for hjælp til flowcytometri og Gabriela Furlan og Noelia Maldonado for hjælp til cellekultur. Vi takker også Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication of FCQ) for videoproduktion og redigering.
Denne artikel blev finansieret af tilskud fra Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) og Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alle til M.C S).

BEMÆRK: For buffersammensætninger se tabel 1.
1. Forberedelse af cellekultur
BEMÆRK: Beskrevet her er kulturpræparatet af MIO-M1-celler, en spontant udødeliggjort human Müller glialcellelinje (Moorfields / Institut for Oftalmologi - Müller 1). Brug altid korrekt aseptisk teknik og arbejd i en laminær flowhætte.
<ol><li>Forbered Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) komplette medium. Til DMEM indeholdende 4,5 g/l D-...

<ol>
	<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+retina:+M&#252;ller+glia+commanding+survival+and+death.">A journey into the retina: M&#252;ller glia commanding survival and death.</a> European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).</li><li>Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+and+diabetic+retinopathy.">M&#252;ller cells and diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 93-100 (2017).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Kamalden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+microRNA-15a+transfer+from+the+pancreas+augments+diabetic+complications+by+inducing+oxidative+stress.">Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress.</a> Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+inflammatory+cytokine+TNF&#945;+is+upregulated+in+retinal+angiogenesis+under+hyperoxia.">Transcription of inflammatory cytokine TNF&#945; is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia.</a> Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).</li><li>Rojas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX2-induced+activation+of+arginase+and+diabetes-induced+retinal+endothelial+cell+senescence.">NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence.</a> Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).</li><li>Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+nitric+oxide+synthase+mediates+retinal+apoptosis+in+ischemic+proliferative+retinopathy.">Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).</li><li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase,+NOX1,+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy.">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li><li>Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+triggered+by+oxidative+stress+that+mediate+features+of+severe+retinopathy+of+prematurity.">Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity.</a> JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M&#252;ller+glial+cells.">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal M&#252;ller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells:+The+role+of+M&#252;ller+glial+cells+and+NRF2.">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of M&#252;ller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M&#252;ller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc(-),+the+Na(+)-independent+glutamate-cystine+exchanger.">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal M&#252;ller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li><li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability.">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice.">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li><li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light.">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A.">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury.">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching.">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li><li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy.">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion.">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li><li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III.">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li><li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc&#947;R+cross-linking.">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to Fc&#947;R cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems.">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV.">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li></ol>

Flere patologiske tilstande, såsom kræft, inflammatoriske sygdomme, iskæmi / reperfusion, iskæmisk hjertesygdom, diabetes og retinopatier og også fysiologiske situationer som aldring, fører til ROS-overproduktion 6,7,8,9,10,11. Derfor er detektion, måling og forståelse af den vej, der er involveret i moduleringen af R...

Den neurale nethinde er et meget organiseret væv, der præsenterer veldefinerede neuronale lag. I disse er neuroner (ganglion, amakrine, bipolære, vandrette og fotoreceptorceller) forbundet med hinanden og også med Müller glialceller (MMC'er) og astrocytter, hvilket fører til tilstrækkelig fototransduktion og behandling af visuel information 1,2. MMC'er er kendt for at have en vigtig rolle i opretholdelsen af retinal homeostase, fordi de krydser hele retinalsektionen, og dermed kan de interagere med alle celletyper, der modulerer flere beskyttelsesprocesser. Det er blevet rapporteret, at MMC'er har flere vigtige funktioner til vedligeholdelse og overlevelse af retinale neuroner, herunder glykolyse for at give energi til neuroner, fjernelse af neuronalt affald, genbrug af neurotransmittere og frigivelse af neurotrofiske faktorer, blandt andre 3,4,5.
På den anden side er inflammation, oxidativ og nitrosativ stress involveret i patogenesen og progressionen af mange menneskelige sygdomme, herunder retinopatier 6,7,8,9,10,11. Redoxbalancen i celler afhænger af tæt regulering af ROS-niveauer. ROS genereres konstant under fysiologiske forhold som følge af aerob respiration hovedsageligt. De vigtigste medlemmer af ROS-familien omfatter reaktive frie radikaler såsom superoxidanionen (O2͘͘͘͘•−), hydroxylradikaler (•OH), forskellige peroxider (ROOR′), hydroperoxider (ROOH) og det ikke-radikale hydrogenperoxid (H202)12,13. I de senere år er det blevet tydeligt, at ROS spiller en vigtig signalrolle i cellerne ved at kontrollere væsentlige processer. MMC'er har et stærkt antioxidantforsvar ved aktivering af den transkriptionelle nukleare faktor erythroid-2-relateret faktor 2 (Nrf2) og den efterfølgende ekspression af antioxidantproteiner for at eliminere overdreven produktion af ROS under patologiske forhold 14,15,16. Når cellerne mister deres redoxbalance på grund af en overdreven produktion af ROS eller en defekt evne til at fjerne ROS, fremmer akkumuleringen af oxidativ stress skadelige modifikationer i proteiner, lipider og DNA, hvilket fører til cellulær stress eller død. Forøgelsen af retinal antioxidantforsvarssystemet forbedrer opløsningen og forebyggelsen af retinopatier, såsom ROP og RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Derfor er måling af ROS-produktion i realtid et kraftfuldt og nyttigt værktøj.
Der er flere metoder til måling af ROS-produktion eller oxidativ stress i celler. Blandt disse er 2′,7′-dichlorfluoresceindiacetate (DCFH-DA) sonde en af de mest anvendte teknikker til direkte kvantificering af redoxtilstanden for en celle 25,26,27,28. Denne sonde er lipofil og ikke-fluorescerende. Diffusion af denne sonde over cellemembranen tillader dens spaltning ved intracellulære esteraser ved de to esterbindinger, hvilket producerer et relativt polært og cellemembran-uigennemtrængeligt produkt, 2′,7′-dichlorfluorescein (H2DCF). Dette ikke-fluorescerende molekyle akkumuleres intracellulært, og efterfølgende oxidation med ROS giver det stærkt fluorescerende produkt DCF. Oxidationen af sonden er produktet af virkningen af flere typer ROS (peroxynitrit, hydroxylradikaler, nitrogenoxid eller peroxider), som kan detekteres ved flowcytometri eller konfokalmikroskopi (emission ved 530 nm og excitation ved 485 nm). Begrænsningen af denne teknik er, at superoxid og hydrogenperoxid ikke reagerer stærkt medH2DCF 25,29. I denne artikel bruger vi DCFH-DA-sonde til at måle og kvantificere ROS ved flowcytometri. Af den grund inducerer vi ROS-produktion ved at stimulere MMC'er med ROS-induktor, A eller B, inden cellerne fyldes med den fluorescerende sonde. Derudover bruger vi en antioxidantforbindelse. Endelig viser vi repræsentative og pålidelige data opnået ved hjælp af denne protokol.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-DCFH-DA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 100x20 mm</td>
			<td>Cell Star- Greiner Bio-One</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Sorvall legend micro 17 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>CRYO.S - Greiner Bio-One</td>
			<td>126263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Internegocios</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer, Neubauer chamber</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-6E8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>A12860-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>BD-352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>822335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 6 well</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>111732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.5% 10X</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells

Redoxbalancen har en vigtig rolle i opretholdelsen af cellulær homeostase. Den øgede generation af reaktive iltarter (ROS) fremmer modifikationen af proteiner, lipider og DNA, hvilket endelig kan føre til ændring i cellulær funktion og celledød. Derfor er det gavnligt for celler at øge deres antioxidantforsvar som reaktion på skadelige fornærmelser, enten ved at aktivere en antioxidantvej som Keap1 / Nrf2 eller ved at forbedre redox-ådselædere (vitaminerne A, C og E, β-caroten og polyfenoler, blandt andre). Inflammation og oxidativ stress er involveret i patogenesen og progressionen af retinopatier, såsom diabetisk retinopati (DR) og retinopati af præmaturitet (ROP). Da Müller gliaceller (MMC'er) spiller en nøglerolle i homeostase af neuralt retinalvæv, betragtes de som en ideel model til at studere disse cellulære beskyttelsesmekanismer. I denne forstand er kvantificering af ROS-niveauer med en reproducerbar og enkel metode afgørende for at vurdere bidraget fra veje eller molekyler, der deltager i antioxidantcelleforsvarsmekanismen. I denne artikel giver vi en komplet beskrivelse af de procedurer, der kræves til måling af ROS med DCFH-DA-sonde og flowcytometri i MMC'er. Nøgletrin til flowcytometri databehandling med softwaren leveres her, så læserne vil være i stand til at måle ROS-niveauer (geometriske midler til FITC) og analysere fluorescenshistogrammer. Disse værktøjer er yderst nyttige til at evaluere ikke kun stigningen i ROS efter en cellulær fornærmelse, men også til at studere antioxidantvirkningen af visse molekyler, der kan give en beskyttende virkning på cellerne.

Som beskrevet i protokolafsnittet har vi vist repræsentative og kvantitative data, der demonstrerer flowcytometridetektion af ROS-produktion med fluorescenssonden DCFH-DA fra MIO-M1-celler stimuleret med ROS-induktor, A eller B. Som forventet observerede vi ændringer i FITC-fluorescens i ustimulerede celler over autofluorescensniveauer (figur 1A, sammenlign "basal kontrol" vs. "autofluorescenskontrol", prakplotgraf). Dette skete på grund af en basal produktion af ROS i MIO-M1-cellerne. (<...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²,7ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÆ’Ã‚Â¼ller Glial Cells

Her foreslår vi en systematiseret, tilgængelig og reproducerbar protokol til påvisning af cellulære reaktive iltarter (ROS) ved hjælp af 2′,7′-dichlorfluoresceindiacetersonde (DCFH-DA) i Müller glialceller (MMC'er). Denne metode kvantificerer de samlede cellulære ROS-niveauer med et flowcytometer. Denne protokol er meget nem at bruge, egnet og reproducerbar.

Kvantificering af reaktive iltarter ved anvendelse af 2′,7′-dichlorfluoresceindiacetafet sonde og flowcytometri i Müller glialceller

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

Der er flere metoder til måling af ROS-produktion eller oxidativ stress i celler. Blandt disse er 2'7'dichlorfluorescein diacetate sonde en af de mest anvendte teknikker til direkte måling af redox tilstand. Denne sonde er lipofil og ikke-fluorescerende. Diffusion af denne sonde over cellemembranen tillader spaltning af intracellulære esteraser ved de to esterbindinger, hvilket producerer et relativt polært og cellemembran-uigennemtrængeligt produkt. Disse ikke-fluorescerende molekyler akkumuleres intracellulært, og efterfølgende oxidation af ROS giver det stærkt fluorescerende produkt dichlorfluorescein. Oxidationen af sonden er produktet af virkning af flere typer ROS. Hvilket kan detekteres ved flowcytometri eller konfokal mikroskopi. I denne artikel har vi brugt en dichlorfluorescein diacetate sonde til at måle og kvantificere ROS ved flowcytometri. Overfør 6-brøndsplader til en laminær strømningshætte fra inkubatoren. Aspirer supernatanten. Og vask cellerne en gang med PBS. Tilsæt 2 ml DMEM med lavt serum pr. Brønd. Og inkubere 6-brøndpladen i to timer i inkubatoren. Behandl cellerne med antioxidanten i seks timer. Behandl cellerne med ROS-induktoren, A eller B, i 30 minutter. Aspirer supernatanten. Og vask cellen tre gange med PBS for at fjerne alle stimuli. Sluk lyset på den laminære flowhætte og arbejd i mørke. Tilsæt 1 ml dichlorfluoresceindiacetatonde i DMEM uden phenolrød. Tilsæt 1 ml DMEM uden phenolrød til kontrolautofluorescenskontrolcellerne. Inkuber 6-brøndpladen i 30 minutter i inkubatoren. Overfør pladerne på is til laboratoriet. Vask cellerne tre gange med 2 ml kold PBS pr. Brønd. Tilsæt 0,5 ml kold afskedsbuffer til hver brønd. Høst cellerne ved forsigtigt at pipettere op og ned ved hjælp af en P1000-pipette. Saml dem i mærket 1,5 ml rør. Og centrifuger dem ved 600 x g i fem minutter ved 4 C.Kassér supernatanten forsigtigt, og adsocier forsigtigt pelleten med tapning. Tilsæt 1 ml FACS-buffer for at vaske cellerne til hvert mærket rør. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge hvirvel i den laveste intensitet til fuldstændig dissociation af pelleten. Centrifuger dem ved 600 x g i fem minutter ved 4 C.Gentag dette trin to gange mere. Tre vaske i alt. Resuspend cellepiller i 200 L FACS-buffer. Dissocier forsigtigt pelleten i hvert rør fuldstændigt ved hjælp af hvirvel. Og overfør til mærket 5 ml til flowcytometerrør. Opbevar rørene på is, indtil de analyseres på flowcytometer. Brug flowcytometrisoftwaren til at oprette et nyt eksperiment. Klik på prøven, og åbn en liste over rør. Dobbeltklik og omdøb dem. Placer autofluorescenskontrolrøret på aspiratorarmen, og flyt kun basen forsigtigt til venstre. Klik på Hent data, og vælg derefter Påtag data, og vælg den ønskede stopbetingelse. Tegn en port omkring cellerne af interesse, undtagen døde celler og snavs. Fjern røret. Klik på Næste rør, og kør basalkontrolprøven. Klik på Hent data og derefter på Record Data.Åbn softwaren. Tilføj eksemplerne ved hjælp af handlingsknappen Tilføj eksempler. Klik på Tilføj eksempel.Vælg mappen Eksperimentel dato, og klik på Vælg.Dobbeltklik på det første eksempel i arbejdsområdet, autofluorescenskontrol i dette tilfælde. Tegn en polygonport for at isolere cellen af interesse, undtagen døde celler og snavs. Skift plot til et histogram. Dobbeltklik i M

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolerende LacZ-udtrykkende celler fra mus indre øre Væv ved anvendelse af flowcytometri

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Den neuroblast Assay: Et assay for generering og berigelse af neuronale progenitorceller fra Differentiering neural stamcelle Afkom anvendelse af flowcytometri

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Vurdering af neuronal levedygtighed ved anvendelse af fluoresceindiacetat-propidiumiodid dobbeltfarvning i cerebellar granulærneuronkultur

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kvantificering af endosom og lysosommotiliteter i dyrkede neuroner ved anvendelse af fluorescerende prober

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse af immunceller i enkelt ischiadicus nerver og dorsalrods Ganglion fra et enkelt museklik bruge flowcytometri

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Ved hjælp af optisk kohærens tomografi og Optokinetic svar som strukturelle og funktionelle visuelle System udlæsninger i mus og rotter

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

En metode til 3D rekonstruktion og Virtual Reality analyse af glial og neuronal celler

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...