Name: quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

Die Autoren danken María Pilar Crespo und Paula Alejandra Abadie von CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentinien) für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie und Gabriela Furlan und Noelia Maldonado für die Zellkulturunterstützung. Wir danken auch Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication von FCQ) für die Videoproduktion und -bearbeitung.
Dieser Artikel wurde durch Zuschüsse von Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) und Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alle an M.C.S.) finanziert.

HINWEIS: Informationen zu Pufferzusammensetzungen finden Sie in Tabelle 1.
1. Zellkulturvorbereitung
HINWEIS: Beschrieben wird hier die Kulturvorbereitung von MIO-M1-Zellen, einer spontan immortalisierten menschlichen Müller-Gliazelllinie (Moorfield's/Institute of Ophthalmology- Müller 1). Verwenden Sie immer die richtige aseptische Technik und arbeiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube.
<ol><li>Bereiten Sie Dulbeccos modifizierte...

<ol>
	<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+retina:+M&#252;ller+glia+commanding+survival+and+death.">A journey into the retina: M&#252;ller glia commanding survival and death.</a> European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).</li><li>Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+and+diabetic+retinopathy.">M&#252;ller cells and diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 93-100 (2017).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Kamalden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+microRNA-15a+transfer+from+the+pancreas+augments+diabetic+complications+by+inducing+oxidative+stress.">Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress.</a> Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+inflammatory+cytokine+TNF&#945;+is+upregulated+in+retinal+angiogenesis+under+hyperoxia.">Transcription of inflammatory cytokine TNF&#945; is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia.</a> Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).</li><li>Rojas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX2-induced+activation+of+arginase+and+diabetes-induced+retinal+endothelial+cell+senescence.">NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence.</a> Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).</li><li>Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+nitric+oxide+synthase+mediates+retinal+apoptosis+in+ischemic+proliferative+retinopathy.">Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).</li><li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase,+NOX1,+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy.">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li><li>Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+triggered+by+oxidative+stress+that+mediate+features+of+severe+retinopathy+of+prematurity.">Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity.</a> JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M&#252;ller+glial+cells.">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal M&#252;ller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells:+The+role+of+M&#252;ller+glial+cells+and+NRF2.">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of M&#252;ller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M&#252;ller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc(-),+the+Na(+)-independent+glutamate-cystine+exchanger.">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal M&#252;ller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li><li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability.">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice.">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li><li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light.">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A.">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury.">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching.">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li><li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy.">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion.">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li><li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III.">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li><li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc&#947;R+cross-linking.">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to Fc&#947;R cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems.">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV.">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li></ol>

Mehrere pathologische Zustände wie Krebs, entzündliche Erkrankungen, Ischämie / Reperfusion, ischämische Herzerkrankungen, Diabetes und Retinopathien sowie physiologische Situationen wie das Altern führen zu einer ROS-Überproduktion 6,7,8,9,10,11. Daher sind der Nachweis, die Messung und das Verständnis des Signalwegs,...

Die neuronale Netzhaut ist ein sehr organisiertes Gewebe, das gut definierte neuronale Schichten aufweist. In diesen sind Neuronen (Ganglien-, Amakrin-, bipolare, horizontale und Photorezeptorzellen) miteinander und auch mit Müller-Gliazellen (MGCs) und Astrozyten verbunden, was zu einer adäquaten Phototransduktion und Verarbeitung visueller Informationenführt 1,2. Es ist bekannt, dass MGCs eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der retinalen Homöostase spielen, da sie den gesamten Netzhautabschnitt durchqueren und somit mit allen Zelltypen interagieren können, die mehrere Schutzprozesse modulieren. Es wurde berichtet, dass MGCs mehrere wichtige Funktionen für die Erhaltung und das Überleben von retinalen Neuronen haben, einschließlich Glykolyse zur Energieversorgung von Neuronen, die Entfernung von neuronalen Abfällen, das Recycling von Neurotransmittern und die Freisetzung neurotropher Faktoren, unter anderem 3,4,5.
Auf der anderen Seite sind Entzündungen, oxidativer und nitrosativer Stress an der Pathogenese und dem Fortschreiten vieler menschlicher Krankheiten beteiligt, einschließlich der Retinopathien 6,7,8,9,10,11. Das Redoxgleichgewicht in den Zellen hängt von einer strengen Regulierung der ROS-Werte ab. ROS werden ständig unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich durch aerobe Atmung erzeugt. Zu den Hauptmitgliedern der ROS-Familie gehören reaktive freie Radikale wie das Superoxid-Anion (O2͘͘͘͘•−), Hydroxylradikale (•OH), verschiedene Peroxide (ROOR′), Hydroperoxide (ROOH) und das radikalfreie Wasserstoffperoxid (H2O2)12,13. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass ROS eine wichtige Signalisierungsrolle in den Zellen spielt, indem es essentielle Prozesse steuert. MGCs haben eine starke antioxidative Abwehr durch die Aktivierung des transkriptionellen Kernfaktors Erythroid-2-verwandter Faktor 2 (Nrf2) und die anschließende Expression von antioxidativen Proteinen, um die übermäßige Produktion von ROS unter pathologischen Bedingungenzu beseitigen 14,15,16. Wenn die Zellen ihr Redoxgleichgewicht aufgrund einer übertriebenen Produktion von ROS oder einer mangelhaften Fähigkeit, ROS zu entfernen, verlieren, fördert die Anhäufung von oxidativem Stress schädliche Veränderungen in Proteinen, Lipiden und DNA, was zu zellulärem Stress oder Tod führt. Die Erhöhung des retinalen antioxidativen Abwehrsystems verbessert die Auflösung und Vorbeugung von Retinopathien wie ROP und RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Daher ist die Messung der ROS-Produktion in Echtzeit ein leistungsfähiges und nützliches Werkzeug.
Es gibt mehrere Methoden, um die ROS-Produktion oder den oxidativen Stress in Zellen zu messen. Unter diesen ist die 2',7'-Dichlorfluorescein-Diacetat (DCFH-DA)-Sonde eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur direkten Quantifizierung des Redoxzustands einer Zelle25,26,27,28. Diese Sonde ist lipophil und nicht fluoreszierend. Die Diffusion dieser Sonde über die Zellmembran ermöglicht ihre Spaltung durch intrazelluläre Esterasen an den beiden Esterbindungen, wodurch ein relativ polares und zellmembranundurchlässiges Produkt, 2′,7'-Dichlorfluorescein (H2 DCF), entsteht. Dieses nicht-fluoreszierende Molekül reichert sich intrazellulär an, und die anschließende Oxidation durch ROS ergibt das hochfluoreszierende Produkt DCF. Die Oxidation der Sonde ist das Produkt der Wirkung mehrerer Arten von ROS (Peroxynitrit, Hydroxylradikale, Stickstoffmonoxid oder Peroxide), die durch Durchflusszytometrie oder konfokale Mikroskopie (Emission bei 530 nm und Anregung bei 485 nm) nachgewiesen werden können. Die Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass Superoxid und Wasserstoffperoxid nicht stark mitH2DCF25,29 reagieren. In diesem Artikel verwenden wir die DCFH-DA-Sonde, um ROS durch Durchflusszytometrie zu messen und zu quantifizieren. Aus diesem Grund induzieren wir die ROS-Produktion, indem wir MGCs mit ROS-Induktor, A oder B, stimulieren, bevor wir die Zellen mit der Fluoreszenzsonde beladen. Darüber hinaus verwenden wir eine antioxidative Verbindung. Schließlich zeigen wir repräsentative und zuverlässige Daten, die mit diesem Protokoll erhalten wurden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-DCFH-DA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 100x20 mm</td>
			<td>Cell Star- Greiner Bio-One</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Sorvall legend micro 17 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>CRYO.S - Greiner Bio-One</td>
			<td>126263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Internegocios</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer, Neubauer chamber</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-6E8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>A12860-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>BD-352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>822335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 6 well</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>111732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.5% 10X</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells

Das Redoxgleichgewicht spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Die erhöhte Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) fördert die Modifikation von Proteinen, Lipiden und DNA, was schließlich zu einer Veränderung der Zellfunktion und des Zelltods führen kann. Daher ist es für die Zellen von Vorteil, ihre antioxidative Abwehr als Reaktion auf schädliche Beleidigungen zu erhöhen, entweder durch Aktivierung eines antioxidativen Weges wie Keap1 / Nrf2 oder durch Verbesserung der Redoxfänger (Vitamine A, C und E, β-Carotin und Polyphenole, unter anderem). Entzündungen und oxidativer Stress sind an der Pathogenese und dem Fortschreiten von Retinopathien wie der diabetischen Retinopathie (DR) und der Frühgeborenen-Retinopathie (ROP) beteiligt. Da Müller-Gliazellen (MGCs) eine Schlüsselrolle bei der Homöostase von neuronalem Netzhautgewebe spielen, gelten sie als ideales Modell, um diese zellulären Schutzmechanismen zu untersuchen. In diesem Sinne ist die Quantifizierung der ROS-Spiegel mit einer reproduzierbaren und einfachen Methode unerlässlich, um den Beitrag von Signalwegen oder Molekülen zu beurteilen, die am antioxidativen Zellabwehrmechanismus beteiligt sind. In diesem Artikel geben wir eine vollständige Beschreibung der Verfahren, die für die Messung von ROS mit DCFH-DA-Sonde und Durchflusszytometrie in MGCs erforderlich sind. Wichtige Schritte für die Datenverarbeitung der Durchflusszytometrie mit der Software werden hier bereitgestellt, so dass die Leser in der Lage sein werden, ROS-Werte (geometrische Mittel von FITC) zu messen und Fluoreszenzhistogramme zu analysieren. Diese Werkzeuge sind sehr hilfreich, um nicht nur den Anstieg des ROS nach einer zellulären Beleidigung zu bewerten, sondern auch die antioxidative Wirkung bestimmter Moleküle zu untersuchen, die eine schützende Wirkung auf die Zellen haben können.

Wie im Protokollabschnitt beschrieben, haben wir repräsentative und quantitative Daten gezeigt, die die Durchflusszytometrie-Detektion der ROS-Produktion mit der Fluoreszenzsonde DCFH-DA aus MIO-M1-Zellen demonstrieren, die mit ROS-Induktor, A oder B stimuliert wurden. Wie erwartet, beobachteten wir Veränderungen der FITC-Fluoreszenz in unstimulierten Zellen oberhalb der Autofluoreszenzspiegel (Abbildung 1A, vergleichen Sie "Basalkontrolle" vs. "Autofluoreszenzkontrolle", Punktdiagrammdiag...

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Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²,7ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÆ’Ã‚Â¼ller Glial Cells

Hier schlagen wir ein systematisiertes, zugängliches und reproduzierbares Protokoll vor, um zelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung einer 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde (DCFH-DA) in Müller-Gliazellen (MGCs) nachzuweisen. Diese Methode quantifiziert die gesamten zellulären ROS-Spiegel mit einem Durchflusszytometer. Dieses Protokoll ist sehr einfach zu bedienen, geeignet und reproduzierbar.

Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde und Durchflusszytometrie in Müller-Gliazellen

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

Es gibt mehrere Methoden, um die ROS-Produktion oder den oxidativen Stress in Zellen zu messen. Unter diesen ist die 2'7'Dichlorfluorescein-Diacetatsonde eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur direkten Messung des Redoxzustands. Diese Sonde ist lipophil und nicht fluoreszierend. Die Diffusion dieser Sonde über die Zellmembran ermöglicht der intrazellulären Esterase eine Spaltung an den beiden Esterbindungen, wodurch ein relativ polares und zellmembranundurchlässiges Produkt entsteht. Diese nicht-fluoreszierenden Moleküle reichern sich intrazellulär an, und die anschließende Oxidation durch ROS ergibt das hochfluoreszierende Produkt Dichlorfluorescein. Die Oxidation der Sonde ist das Produkt der Wirkung mehrerer Arten von ROS. Die durch Durchflusszytometrie oder konfokale Mikroskopie nachgewiesen werden kann. In diesem Artikel haben wir eine Dichlorfluorescein-Diacetatsonde verwendet, um ROS durch Durchflusszytometrie zu messen und zu quantifizieren. Übertragen Sie 6-Well-Platten aus dem Inkubator in eine Laminar-Flow-Haube. Aspirieren Sie den Überstand. Und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Fügen Sie 2 ml niedriges Serum-DMEM pro Vertiefung hinzu. Und inkubieren Sie die 6-Well-Platte für zwei Stunden im Inkubator. Behandeln Sie die Zellen sechs Stunden lang mit dem Antioxidans. Behandeln Sie die Zellen 30 Minuten lang mit dem ROS-Induktor, A oder B. Aspirieren Sie den Überstand. Und waschen Sie die Zelle dreimal mit PBS, um alle Reize zu entfernen. Schalten Sie das Licht der Laminar-Flow-Haube aus und arbeiten Sie in der Dunkelheit. Fügen Sie 1 ml Dichlorfluorescein-Diacetatsonde in DMEM ohne Phenolrot hinzu. Fügen Sie 1 ml DMEM ohne Phenolrot zu den Kontroll-Autofluoreszenz-Kontrollzellen hinzu. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte für 30 Minuten im Inkubator. Überführen Sie die Platten auf Eis ins Labor. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 2 ml kaltem PBS pro Well. Fügen Sie jedem Bohrloch 0,5 ml kalt ablösenden Puffer hinzu. Ernten Sie die Zellen, indem Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren. Sammeln Sie sie in einem beschrifteten 1,5-ml-Röhrchen. Und zentrifugieren Sie sie bei 600 x g für fünf Minuten bei 4 ° C.Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und dissoziieren Sie das Pellet vorsichtig mit Klopfen. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu, um die Zellen zu jedem markierten Röhrchen zu waschen. Wenn es notwendig ist, verwenden Sie Wirbel in der niedrigsten Intensität für die vollständige Dissoziation des Pellets. Zentrifugieren Sie sie bei 600 x g für fünf Minuten bei 4 C.Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Insgesamt drei Wäschen. Resuspendieren Sie Zellpellets in 200 l FACS-Puffer. Dissoziieren Sie das Pellet in jedem Rohr vorsichtig vollständig, indem Sie einen Wirbel verwenden. Und auf beschriftete 5 ml für Durchflusszytometerröhren übertragen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis, bis sie auf dem Durchflusszytometer analysiert werden. Erstellen Sie mit der Durchflusszytometrie-Software ein neues Experiment. Klicken Sie auf das Exemplar und es wird eine Liste der Röhrchen geöffnet. Doppelklicken Sie auf sie und benennen Sie sie um. Legen Sie die Autofluoreszenz-Kontrollröhre auf den Aspiratorarm und bewegen Sie die Basis vorsichtig nur nach links. Klicken Sie auf Daten erfassen und dann auf Daten aufzeichnen, und wählen Sie die gewünschte Stoppbedingung aus. Zeichnen Sie ein Tor um die Zellen von Interesse, ohne tote Zellen und Ablagerungen. Entfernen Sie die Röhre. Klicken Sie auf Nächste Röhre und führen Sie die Basalkontrollprobe aus. Klicken Sie auf Daten erfassen und dann unter Daten aufzeichnen.Öffnen Sie die Software. Fügen Sie die Beispiele mithilfe der Aktionsschaltfläche "Beispiele hinzufügen" hinzu. Klicken Sie auf Beispiel hinzufügen.Wählen Sie den Ordner Experimentelles Datum aus, und klicken Sie auf Auswählen.Doppelklicken Sie auf die erste Probe in Ihrem Arbeitsbereich, in diesem Fall auf die Autofluoreszenzsteuerung. Zeichnen Sie ein Polygon-Tor, um die Zelle von Interesse zu isolieren, ohne tote Zellen und Ablagerungen. Ändern Sie das Diagramm in ein Histogramm. Doppelklicken Sie innerhalb des M

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischias Nerven und Dorsal Root Ganglion aus einem einzigen Mausklick mit Durchflusszytometrie

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Mit optischen Kohärenztomographie und optokinetischen Antwort als strukturelle und funktionelle visuelles System auslesen bei Mäusen und Ratten

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Eine Methode zur 3D-Rekonstruktion und Virtual Reality-Analyse von Glia- und Neuronalzellen

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...