Name: quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

המחברים רוצים להודות למריה פילאר קרספו ופאולה אלחנדרה עבאדי מ- CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, קורדובה, ארגנטינה) על הסיוע בציטומטריית זרימה וגבריאלה פורלן ונוליה מלדונאדו לסיוע בתרבות התא. אנו מודים גם לויקטור דיאז (פרו-מזכיר התקשורת המוסדית של FCQ) על הפקת הווידאו והעריכה.
מאמר זה מומן על ידי מענקים מ Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), and Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (all to M.C.S.).

הערה: עבור קומפוזיציות מאגר ראה טבלה 1.
1. הכנה לתרבות התא
הערה: מתואר כאן הכנה תרבית של תאי MIO-M1, קו תאי גליה של מולר אנושי שהונצח באופן ספונטני (Moorfield's/ המכון לרפואת עיניים - מולר 1). תמיד להשתמש בטכניקה אספטית נכונה ולעבוד במכסה המנוע זרימה למינא...

<ol>
	<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+retina:+M&#252;ller+glia+commanding+survival+and+death.">A journey into the retina: M&#252;ller glia commanding survival and death.</a> European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).</li><li>Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+and+diabetic+retinopathy.">M&#252;ller cells and diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 93-100 (2017).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Kamalden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+microRNA-15a+transfer+from+the+pancreas+augments+diabetic+complications+by+inducing+oxidative+stress.">Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress.</a> Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+inflammatory+cytokine+TNF&#945;+is+upregulated+in+retinal+angiogenesis+under+hyperoxia.">Transcription of inflammatory cytokine TNF&#945; is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia.</a> Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).</li><li>Rojas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX2-induced+activation+of+arginase+and+diabetes-induced+retinal+endothelial+cell+senescence.">NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence.</a> Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).</li><li>Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+nitric+oxide+synthase+mediates+retinal+apoptosis+in+ischemic+proliferative+retinopathy.">Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).</li><li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase,+NOX1,+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy.">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li><li>Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+triggered+by+oxidative+stress+that+mediate+features+of+severe+retinopathy+of+prematurity.">Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity.</a> JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M&#252;ller+glial+cells.">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal M&#252;ller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells:+The+role+of+M&#252;ller+glial+cells+and+NRF2.">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of M&#252;ller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M&#252;ller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc(-),+the+Na(+)-independent+glutamate-cystine+exchanger.">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal M&#252;ller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li><li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability.">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice.">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li><li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light.">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A.">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury.">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching.">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li><li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy.">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion.">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li><li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III.">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li><li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc&#947;R+cross-linking.">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to Fc&#947;R cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems.">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV.">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li></ol>

מספר מצבים פתולוגיים, כגון סרטן, מחלות דלקתיות, איסכמיה/רפרטפוזיה, מחלות לב איסכמיות, סוכרת ורטינופתיות, וגם מצבים פיזיולוגיים כמו הזדקנות, מובילים לייצור יתרשל ROS 6,7,8,9,10,111. לכן, אי?...

הרשתית העצבית היא רקמה מאורגנת מאוד המציגה שכבות עצביות מוגדרות היטב. באלה, נוירונים (גנגליון, amacrine, דו קוטבי, אופקי, ותאי photoreceptor) מחוברים זה לזה וגם עם תאי גליה מולר (MGCs) ואסטרוציטים, מה שמוביל פוטו-טרנסדוקציה נאותה ועיבוד של מידע חזותי 1,2. MGCs ידועים יש תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס רשתית כי הם חוצים את כל קטע הרשתית, ולכן, הם יכולים לקיים אינטראקציה עם כל סוגי התאים כי לווסת תהליכי הגנה מרובים. דווח כי MGCs יש מספר פונקציות חשובות לשמירה והישרדות של נוירונים ברשתית, כולל גליקוליזה כדי לספק אנרגיה נוירונים, הסרת פסולת עצבית, מיחזור של נוירוטרנסמיטורים, ושחרור של גורמים נוירוטרופיים, בין היתר 3,4,5.
מצד שני, דלקת, עקה חמצונית וניטרוסיבית מעורבים בפתוגנזה ובהתקדמות של מחלות אנושיות רבות, כולל רטינופתיות 6,7,8,8,9,10,11. מאזן redox בתאים תלוי רגולציה הדוקה של רמות ROS. ROS נוצרים כל הזמן בתנאים פיזיולוגיים כתוצאה של נשימה אירובית בעיקר. החברים העיקריים במשפחת ROS כוללים רדיקלים חופשיים תגובתיים כגון אניון סופראוקסיד (O2͘͘͘͘•−), רדיקלים הידרוקסיל (•OH), מי חמצן שונים (ROOR′), הידרופרוקסידים (ROOH), ומי חמצן ללא רדיקלי (H2O2)12,13. בשנים האחרונות, התברר כי ROS ממלא תפקיד איתות חשוב בתאים על ידי שליטה בתהליכים חיוניים. MGCs יש הגנה נוגדת חמצון חזקה על ידי הפעלת גורם גרעיני תמלול אריתרויד-2 הקשורים גורם גורם 2 (Nrf2) ואת הביטוי הבא של חלבונים נוגדי חמצון כדי לחסל את הייצור המופרז של ROS בתנאים פתולוגיים 14,15,16. כאשר התאים מאבדים את שיווי המשקל שלהם עקב ייצור מוגזם של ROS או יכולת פגומה להסיר ROS, הצטברות של עקה חמצונית מקדמת שינויים מזיקים בחלבונים, שומנים, ו- DNA, המובילים ללחץ תאי או למוות. הגידול של מערכת ההגנה נוגדת החמצון ברשתית משפר את הרזולוציה ומניעה של רטינופתיות, כגון ROP ו RD 17,18,19,20,20,21,22,23,24. לכן, המדידה של ייצור ROS בזמן אמת היא כלי רב עוצמה ושימושי.
ישנן מספר שיטות למדידת ייצור ROS או עקה חמצונית בתאים. בין אלה, 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) בדיקה היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר לכימות ישיר של מצב redox של תא 25,26,27,28. בדיקה זו היא ליפופילית ולא פלואורסצנטית. דיפוזיה של בדיקה זו על פני קרום התא מאפשרת את המחשוף שלה על ידי אסטראזות תאיות בשני קשרים אסתר, לייצר מוצר קוטבי יחסית קרום התא אטום, 2 ′,7′-dichlorofluorescein (H2DCF). מולקולה לא פלואורסצנטית זו מצטברת באופן תאי, והחמצון שלאחר מכן על ידי ROS מניב את DCF המוצר הפלואורסצנטי ביותר. החמצון של הגשושית הוא תוצר של פעולה של סוגים מרובים של ROS (peroxynitrite, רדיקלים הידרוקסיל, תחמוצת החנקן, או מי חמצן), אשר ניתן לזהות על ידי cytometry זרימה או מיקרוסקופיה קונפוקלי (פליטה ב 530 ננומטר עירור ב 485 ננומטר). המגבלה של טכניקה זו היא כי סופראוקסיד ומי חמצן אינם מגיבים בעוצמה עם H2DCF25,29. במאמר זה, אנו משתמשים בדיקה DCFH-DA כדי למדוד ולכמת ROS על ידי cytometry זרימה. מסיבה זו, אנו גורמים לייצור ROS על ידי גירוי MGCs עם ממריץ ROS, A או B, לפני טעינת התאים עם בדיקה פלואורסצנטית. בנוסף, אנו משתמשים בתרכובת נוגדת חמצון. לבסוף, אנו מציגים נתונים מייצגים ואמינים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-DCFH-DA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 100x20 mm</td>
			<td>Cell Star- Greiner Bio-One</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Sorvall legend micro 17 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>CRYO.S - Greiner Bio-One</td>
			<td>126263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Internegocios</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer, Neubauer chamber</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-6E8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>A12860-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>BD-352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>822335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 6 well</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>111732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.5% 10X</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells

לאיזון Redox יש תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס תאי. הדור המוגבר של מינים חמצן תגובתי (ROS) מקדם את השינוי של חלבונים, שומנים, ו- DNA, אשר בסופו של דבר עשוי להוביל לשינוי בתפקוד התאים ומוות התא. לכן, זה מועיל לתאים כדי להגדיל את ההגנה נוגדת החמצון שלהם בתגובה על עלבונות מזיקים, או על ידי הפעלת מסלול נוגד חמצון כמו Keap1 / Nrf2 או על ידי שיפור אוכלי נבלות redox (ויטמינים A, C, ו- E, β קרוטן, פוליפנולים, בין היתר). דלקת ומתח חמצוני מעורבים בפתוגנזה ובהתקדמות של רטינופתיות, כגון רטינופתיה סוכרתית (DR) ורטינופתיה של פגות (ROP). מאז תאי גליה מולר (MGCs) לשחק תפקיד מפתח הומאוסטזיס של רקמת רשתית עצבית, הם נחשבים מודל אידיאלי ללמוד מנגנוני הגנה תאיים אלה. במובן זה, כימות רמות ROS עם שיטה לשחזור ופשוט הוא חיוני כדי להעריך את התרומה של מסלולים או מולקולות המשתתפים במנגנון ההגנה על תאים נוגדי חמצון. במאמר זה, אנו מספקים תיאור מלא של ההליכים הנדרשים למדידת ROS עם DCFH-DA בדיקה וציטומטריית זרימה ב- MGCs. שלבי מפתח לעיבוד נתונים cytometry זרימה עם התוכנה מסופקים כאן, כך הקוראים יוכלו למדוד רמות ROS (אמצעים גיאומטריים של FITC) ולנתח היסטוגרמה פלואורסצנטית. כלים אלה מועילים מאוד כדי להעריך לא רק את הגידול ROS לאחר עלבון תאי, אלא גם כדי ללמוד את ההשפעה נוגדת החמצון של מולקולות מסוימות שיכולות לספק אפקט מגן על התאים.

כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול, הראינו נתונים מייצגים וכמותיים המדגימים זיהוי ציטומטריית זרימה של ייצור ROS עם בדיקת פלואורסצנטיות DCFH-DA מתאי MIO-M1 מגורה עם ממריץ ROS, A או B. כצפוי, ראינו שינויים בפלואורסצנטיות FITC בתאים לא מגורים מעל רמות ההפלורציה האוטומטית (איור 1A, השווה בין "שליטה...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²,7ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÆ’Ã‚Â¼ller Glial Cells

כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.

כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

ישנן מספר שיטות למדידת ייצור ROS, או עקה חמצונית בתאים. בין אלה, 2'7'dichlorofluorescein דיאקאט בדיקה היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר למדידה ישירה של מצב redox. בדיקה זו היא ליפופילית ולא פלואורסצנטית. דיפוזיה של בדיקה זו על פני קרום התא מאפשרת את מחשוף אסטראזות תאיות בשני קשרי אסתר, לייצר מוצר קוטבי יחסית קרום התא אטום. מולקולות לא פלואורסצנטיות אלה מצטברות באופן תאי, והחמצון שלאחר מכן על ידי ROS מניב את המוצר הפלואורסצנטי ביותר דיכלורופלואורסצ'ין. החמצון של הגשוש הוא תוצר של פעולה של סוגים מרובים של ROS. אשר ניתן לזהות על ידי ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה קונפוקלית. במאמר זה, השתמשנו בדיקה dichlorofluorescein diacetate כדי למדוד ולכמת ROS על ידי cytometry זרימה. מעבירים צלחות של 6 בארות למכסה מנוע לזרימה למינארית מהחממה. שאפו את הסופר-נאנט. ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. יש להוסיף 2 מ"ל של DMEM בסרום נמוך לבאר. ולדגור את צלחת 6-well במשך שעתיים באינקובטור. לטפל בתאים עם נוגד חמצון במשך שש שעות. לטפל בתאים עם ממריץ ROS, A או B, במשך 30 דקות. שאפו את הסופר-נאנט. ולשטוף את התא שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את כל הגירויים. כבה את האור של מכסה המנוע לזרימה למינארית ועבוד בחושך. הוסף 1 מ"ל של dichlorofluorescein דיאקטט בדיקה ב DMEM ללא אדום פנול. הוסף 1 מ"ל של DMEM ללא אדום פנול לתאי בקרת בקרת הזרימה האוטומטית של הבקרה. לדגור על צלחת 6-well במשך 30 דקות באינקובטור. העבר את הצלחות על קרח למעבדה. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של PBS קר לכל באר. הוסיפו 0.5 מ"ל של חיץ ניתוק קר לכל באר. לקצור את התאים על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה P1000. לאסוף אותם בצינור 1.5 מ"ל שכותרתו. וצנטריפוגה אותם ב 600 x g במשך חמש דקות ב 4 C. להשליך את supernatant בזהירות, בעדינות לנתק את הכדור עם הקשה. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS כדי לשטוף את התאים לכל צינור שכותרתו. אם יש צורך, להשתמש במערבולת בעוצמה הנמוכה ביותר עבור ניתוק מלא של הכדור. צנטריפוגה אותם ב 600 x g במשך חמש דקות ב 4 C.חזור על שלב זה פעמיים יותר. שלוש כביסות בסך הכל. Resuspend כדורי תאים ב 200 L של מאגר FACS. בעדינות לנתק לחלוטין את הכדור בכל צינור באמצעות מערבולת. ולהעביר ל-5 מ"ל מסומנים לצינורות ציטומטר זרימה. שמור את הצינורות על קרח עד לנתח על cytometer זרימה. באמצעות תוכנת ציטומטריית הזרימה, צור ניסוי חדש. לחץ על הדגימה ויפתח רשימה של צינורות. לחץ פעמיים ושנה את שמם. מניחים את צינור בקרת הזרימה האוטומטית על זרוע השאיפה, ומזיזים את הבסיס בזהירות רק שמאלה. לחץ על רכש נתונים ולאחר מכן רשום נתונים ובחר את תנאי העצירה הרצוי. צייר שער סביב התאים המעניינים, למעט תאים מתים ופסולת. הסר את הצינור. לחץ על הצינור הבא והפעל את דוגמת הבקרה הבסיסית. לחץ על רכש נתונים ולאחר מכן ב- Record Data.Open את התוכנה. הוסף את הדוגמאות באמצעות לחצן הפעולה הוסף דוגמאות. לחץ על הוסף דוגמה.בחר את התיקיה תאריך ניסיוני ולחץ על Choose.Double לחץ פעמיים על המדגם הראשון בסביבת העבודה שלך, פקד זרימה אוטומטית במקרה זה. צייר שער מצולע כדי לבודד את תא העניין, למעט תאים מתים ופסולת. שנה את העלילה להיסטוגרמה. לחץ פעמיים בתוך ה- M

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

קביעת מיטוכונדריאלי המינים ממברנה פוטנציאליים הריאקטיבי חמצן בנוירונים חולדה חיה קליפתיים

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

ניתוח של תאים חיסוניים העצבים ממוגלה יחיד, גנגליון העזוב השורש של עכבר אחת באמצעות Cytometry זרימה

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית ותגובה Optokinetic כמו המפרט מבנית ופונקציונליים מערכת הראייה של עכברים וחולדות

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

שיטה לניתוח שחזור תלת מימד ומציאות וירטואלית של תאים גליאל ונוירוונאליות

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...