Name: quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

लेखकों को मारिया Pilar Crespo और पाउला Alejandra IBBICI के Abadie (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, अर्जेंटीना) प्रवाह cytometry और गैब्रिएला Furlan और Noelia Maldonado सेल संस्कृति सहायता के लिए सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम वीडियो उत्पादन और संपादन के लिए विक्टर डियाज़ (एफसीक्यू के संस्थागत संचार के प्रो-सेक्रेटरी) को भी धन्यवाद देते हैं।
इस लेख को Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), और Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (सभी के लिए M.C.S.) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

नोट:: बफ़र रचनाओं के लिए तालिका 1 देखें।
1. सेल संस्कृति तैयारी
नोट: यहां वर्णित एमआईओ-एम 1 कोशिकाओं की संस्कृति की तैयारी है, जो एक अनायास अमर मानव मुलर ग्लियाल सेल लाइन (मू...

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	<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+retina:+M&#252;ller+glia+commanding+survival+and+death.">A journey into the retina: M&#252;ller glia commanding survival and death.</a> European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).</li><li>Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+and+diabetic+retinopathy.">M&#252;ller cells and diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 93-100 (2017).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Kamalden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+microRNA-15a+transfer+from+the+pancreas+augments+diabetic+complications+by+inducing+oxidative+stress.">Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress.</a> Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+inflammatory+cytokine+TNF&#945;+is+upregulated+in+retinal+angiogenesis+under+hyperoxia.">Transcription of inflammatory cytokine TNF&#945; is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia.</a> Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).</li><li>Rojas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX2-induced+activation+of+arginase+and+diabetes-induced+retinal+endothelial+cell+senescence.">NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence.</a> Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).</li><li>Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+nitric+oxide+synthase+mediates+retinal+apoptosis+in+ischemic+proliferative+retinopathy.">Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).</li><li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase,+NOX1,+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy.">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li><li>Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+triggered+by+oxidative+stress+that+mediate+features+of+severe+retinopathy+of+prematurity.">Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity.</a> JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M&#252;ller+glial+cells.">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal M&#252;ller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells:+The+role+of+M&#252;ller+glial+cells+and+NRF2.">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of M&#252;ller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M&#252;ller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc(-),+the+Na(+)-independent+glutamate-cystine+exchanger.">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal M&#252;ller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li><li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability.">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice.">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li><li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light.">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A.">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury.">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching.">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li><li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy.">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion.">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li><li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III.">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li><li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc&#947;R+cross-linking.">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to Fc&#947;R cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems.">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV.">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li></ol>

कई रोग संबंधी स्थितियां, जैसे कि कैंसर, भड़काऊ रोग, इस्केमिया / reperfusion, इस्केमिक हृदय रोग, मधुमेह, और रेटिनोपैथी, और उम्र बढ़ने जैसी शारीरिक स्थितियां, आरओएस overproduction 6,7,8,9,10,11 का कार...

तंत्रिका रेटिना एक बहुत ही संगठित ऊतक है जो अच्छी तरह से परिभाषित न्यूरोनल परतों को प्रस्तुत करता है। इनमें, न्यूरॉन्स (गैंग्लियन, एमेक्राइन, द्विध्रुवी, क्षैतिज और फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं) एक-दूसरे से जुड़े हुए हैं और मुलर ग्लियाल कोशिकाओं (एमजीसी) और एस्ट्रोसाइट्स के साथ भी, जिससे पर्याप्त फोटोट्रांसडक्शन और दृश्य जानकारी 1,2 का प्रसंस्करण होता है। एमजीसी को रेटिना होमोस्टैसिस के रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है क्योंकि वे पूरे रेटिना अनुभाग को पार करते हैं और इस प्रकार, वे सभी सेल प्रकारों के साथ बातचीत कर सकते हैं जो कई सुरक्षात्मक प्रक्रियाओं को संशोधित करते हैं। यह बताया गया है कि एमजीसी में रेटिना न्यूरॉन्स के रखरखाव और अस्तित्व के लिए कई महत्वपूर्ण कार्य हैं, जिनमें न्यूरॉन्स को ऊर्जा प्रदान करने के लिए ग्लाइकोलाइसिस, न्यूरोनल कचरे को हटाना, न्यूरोट्रांसमीटर का पुनर्चक्रण, और न्यूरोट्रॉफिक कारकों की रिहाई शामिल है, दूसरों के बीच 3,4,5।
दूसरी ओर, सूजन, ऑक्सीडेटिव और नाइट्रोसेटिव तनाव कई मानव बीमारियों के रोगजनन और प्रगति में शामिल हैं, जिसमें रेटिनोपैथी 6,7,8,9,10,11 शामिल हैं। कोशिकाओं में रेडॉक्स संतुलन आरओएस स्तरों के तंग विनियमन पर निर्भर करता है। आरओएस मुख्य रूप से एरोबिक श्वसन के परिणामस्वरूप शारीरिक परिस्थितियों में लगातार उत्पन्न होते हैं। ROS परिवार के प्रमुख सदस्यों में प्रतिक्रियाशील मुक्त कण जैसे सुपरऑक्साइड अनियन (O2π•−), हाइड्रॉक्सिल रेडिकल्स (•OH), विभिन्न पेरोक्साइड (ROOR'), हाइड्रोपेरोक्साइड (ROOH), और कोई कट्टरपंथी हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2)12,13 शामिल हैं। पिछले वर्षों में, यह स्पष्ट हो गया है कि आरओएस आवश्यक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करके कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण सिग्नलिंग भूमिका निभाता है। MGCs transcriptional परमाणु कारक के सक्रियण द्वारा एक मजबूत एंटीऑक्सिडेंट रक्षा है- 2 से संबंधित कारक 2 (Nrf2) और एंटीऑक्सीडेंट प्रोटीन के बाद की अभिव्यक्ति रोग की स्थिति 14,15,16 के तहत आरओएस के अत्यधिक उत्पादन को खत्म करने के लिए। जब कोशिकाएं आरओएस के अतिरंजित उत्पादन या आरओएस को हटाने की दोषपूर्ण क्षमता के कारण अपने रेडॉक्स संतुलन को खो देती हैं, तो ऑक्सीडेटिव तनाव का संचय प्रोटीन, लिपिड और डीएनए में हानिकारक संशोधनों को बढ़ावा देता है, जिससे सेलुलर तनाव या मृत्यु हो जाती है। रेटिना एंटीऑक्सिडेंट रक्षा प्रणाली की वृद्धि रेटिनोपैथी के संकल्प और रोकथाम में सुधार करती है, जैसे कि आरओपी और आरडी 17,18,19,20,21,22,23,24। इसलिए, वास्तविक समय में आरओएस उत्पादन का माप एक शक्तिशाली और उपयोगी उपकरण है।
कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन या ऑक्सीडेटिव तनाव को मापने के लिए कई तरीके हैं। इनमें से, 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) जांच सीधे सेल 25,26,27,28 के रेडॉक्स राज्य को मापने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीकों में से एक है। यह जांच लिपोफिलिक और गैर-फ्लोरोसेंट है। सेल झिल्ली के पार इस जांच का प्रसार दो एस्टर बांडों पर इंट्रासेल्युलर एस्टेरेस द्वारा अपनी दरार की अनुमति देता है, जो अपेक्षाकृत ध्रुवीय और सेल झिल्ली-अपारगम्य उत्पाद, 2′, 7′-डाइक्लोरोफ्लोरोरेससीन (एच2डीसीएफ) का उत्पादन करता है। यह गैर-फ्लोरोसेंट अणु इंट्रासेल्युलर रूप से जमा होता है, और आरओएस द्वारा बाद में ऑक्सीकरण अत्यधिक फ्लोरोसेंट उत्पाद डीसीएफ उत्पन्न करता है। जांच का ऑक्सीकरण कई प्रकार के आरओएस (पेरोक्सिनिट्रिटाइट, हाइड्रॉक्सिल रेडिकल्स, नाइट्रिक ऑक्साइड, या पेरोक्साइड) की कार्रवाई का उत्पाद है, जिसे फ्लो साइटोमेट्री या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (530 एनएम पर उत्सर्जन और 485 एनएम पर उत्तेजना) द्वारा पता लगाया जा सकता है। इस तकनीक की सीमा यह है कि सुपरऑक्साइड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड एच 2 डीसीएफ25,29 के साथ दृढ़ता से प्रतिक्रिया नहीं करते हैं। इस लेख में, हम प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा आरओएस को मापने और मापने के लिए डीसीएफएच-डीए जांच का उपयोग करते हैं। उस कारण से, हम ROS प्रेरक, ए या बी के साथ MGCs को उत्तेजित करके ROS उत्पादन को प्रेरित करते हैं, जो फ्लोरोसेंट जांच के साथ कोशिकाओं को लोड करने के लिए पिछले है। इसके अलावा, हम एक एंटीऑक्सिडेंट यौगिक का उपयोग करते हैं। अंत में, हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि और विश्वसनीय डेटा दिखाते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-DCFH-DA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 100x20 mm</td>
			<td>Cell Star- Greiner Bio-One</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Sorvall legend micro 17 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>CRYO.S - Greiner Bio-One</td>
			<td>126263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Internegocios</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer, Neubauer chamber</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-6E8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>A12860-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>BD-352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>822335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 6 well</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>111732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.5% 10X</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells

सेलुलर होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में रेडॉक्स संतुलन की एक महत्वपूर्ण भूमिका है। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की बढ़ी हुई पीढ़ी प्रोटीन, लिपिड और डीएनए के संशोधन को बढ़ावा देती है, जो अंततः सेलुलर फ़ंक्शन और सेल मृत्यु में परिवर्तन का कारण बन सकती है। इसलिए, हानिकारक अपमान के जवाब में कोशिकाओं के लिए अपने एंटीऑक्सिडेंट रक्षा को बढ़ाने के लिए फायदेमंद है, या तो Keap1 / Nrf2 जैसे एंटीऑक्सिडेंट मार्ग को सक्रिय करके या रेडॉक्स स्कैवेंजर्स (विटामिन ए, सी, और ई, β-कैरोटीन, और पॉलीफेनोल्स, दूसरों के बीच) में सुधार करके। सूजन और ऑक्सीडेटिव तनाव रोगजनन और रेटिनोपैथी की प्रगति में शामिल हैं, जैसे कि मधुमेह रेटिनोपैथी (डीआर) और रेटिनोपैथी ऑफ प्रीमेच्योरिटी (आरओपी)। चूंकि मुलर ग्लियाल कोशिकाएं (एमजीसी) तंत्रिका रेटिना ऊतक के होमोस्टैसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, इसलिए उन्हें इन सेलुलर सुरक्षात्मक तंत्रों का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल माना जाता है। इस अर्थ में, एक पुनरुत्पादक और सरल विधि के साथ आरओएस स्तरों को परिमाणित करना एंटीऑक्सिडेंट सेल रक्षा तंत्र में भाग लेने वाले मार्गों या अणुओं के योगदान का आकलन करने के लिए आवश्यक है। इस लेख में, हम MGCs में DCFH-DA जांच और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ ROS के माप के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का पूरा विवरण प्रदान करते हैं। सॉफ़्टवेयर के साथ प्रवाह साइटोमेट्री डेटा प्रोसेसिंग के लिए महत्वपूर्ण चरण यहां प्रदान किए गए हैं, इसलिए पाठक ROS स्तरों (FITC के ज्यामितीय साधन) को मापने और प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम का विश्लेषण करने में सक्षम होंगे। ये उपकरण न केवल एक सेलुलर अपमान के बाद आरओएस में वृद्धि का मूल्यांकन करने के लिए अत्यधिक सहायक हैं, बल्कि कुछ अणुओं के एंटीऑक्सिडेंट प्रभाव का अध्ययन करने के लिए भी हैं जो कोशिकाओं पर सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदान कर सकते हैं।

जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है, हमने प्रतिनिधि और मात्रात्मक डेटा दिखाया है जो आरओएस इनड्यूसर, ए या बी के साथ प्रेरित एमआईओ-एम 1 कोशिकाओं से प्रतिदीप्ति जांच डीसीएफएच-डीए के साथ आरओएस उत्पादन क?...

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Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²,7ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÆ’Ã‚Â¼ller Glial Cells

यहां, हम सेलुलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का पता लगाने के लिए एक व्यवस्थित, सुलभ और पुन: प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं, जो मुलर ग्लियाल कोशिकाओं (एमजीसी) में 2', 7'-डाइक्लोरोफ्लोरोरेसीन डायसीटेट प्रोब (डीसीएफएच-डीए) का उपयोग करते हैं। यह विधि एक प्रवाह साइटोमीटर के साथ कुल सेलुलर आरओएस स्तरों को निर्धारित करती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए बहुत आसान है, उपयुक्त है, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य.

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का परिमाणीकरण 2', 7′-Dichlorofluorescein Diacetate Probe और Müller Glial कोशिकाओं में फ्लो-साइटोमेट्री का उपयोग करके

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

आरओएस उत्पादन, या कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव को मापने के लिए कई तरीके हैं। इनमें से, 2'7'dichlorofluorescein diacetate जांच रेडॉक्स राज्य के सीधे मापने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीकों में से एक है। यह जांच लिपोफिलिक और गैर-फ्लोरोसेंट है। सेल झिल्ली के पार इस जांच का प्रसार इंट्रासेल्युलर एस्टेरेस दरार को दो एस्टर बांडों पर दरार की अनुमति देता है, जो अपेक्षाकृत ध्रुवीय और सेल झिल्ली-अपारगम्य उत्पाद का उत्पादन करता है। ये गैर-फ्लोरोसेंट अणु इंट्रासेल्युलर रूप से जमा होते हैं, और आरओएस द्वारा बाद में ऑक्सीकरण अत्यधिक फ्लोरोसेंट उत्पाद डाइक्लोरोफ्लोरोरिसीन उत्पन्न करता है। जांच का ऑक्सीकरण आरओएस के कई प्रकार की कार्रवाई का उत्पाद है। जिसका पता फ्लो साइटोमेट्री या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा लगाया जा सकता है। इस लेख में, हमने प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा आरओएस को मापने और मापने के लिए एक डाइक्लोरोफ्लोरोरेसीन डायसीटेट जांच का उपयोग किया है। इनक्यूबेटर से एक लैमिनर प्रवाह हुड में 6-अच्छी तरह से प्लेटों को स्थानांतरित करें। Supernatant aspirate. और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें। अच्छी तरह से प्रति कम सीरम DMEM के 2 मिलीलीटर जोड़ें. और इनक्यूबेटर में दो घंटे के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट को इनक्यूबेट करें। छह घंटे के लिए एंटीऑक्सिडेंट के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। 30 मिनट के लिए आरओएस प्रेरक, ए या बी के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। Supernatant aspirate. और सभी उत्तेजनाओं को हटाने के लिए पीबीएस के साथ सेल को तीन बार धोएं। लैमिनर प्रवाह हुड की रोशनी को बंद कर दें और अंधेरे में काम करें। फिनोल लाल के बिना DMEM में dichlorofluorescein diacetate जांच के 1 mL जोड़ें। नियंत्रण autofluorescence नियंत्रण कोशिकाओं के लिए फिनोल लाल के बिना DMEM के 1 mL जोड़ें। इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट को इनक्यूबेट करें। बर्फ पर प्लेटों को प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर ठंडे पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ठंडा detaching बफर के 0.5 mL जोड़ें। धीरे से एक P1000 पिपेट का उपयोग कर ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं फसल. उन्हें लेबल 1.5 mL ट्यूब में ले लीजिए. और उन्हें 4 C.Discard पर पांच मिनट के लिए 600 x g पर centrifuge supernatant ध्यान से छोड़ें, और धीरे से दोहन के साथ गोली को अलग. प्रत्येक लेबल ट्यूब के लिए कोशिकाओं को धोने के लिए FACS बफर के 1 mL जोड़ें। यदि यह आवश्यक है, तो गोली के पूर्ण पृथक्करण के लिए सबसे कम तीव्रता में भंवर का उपयोग करें। उन्हें 4 C.Repeat पर पांच मिनट के लिए 600 x g पर centrifuge इस चरण को दो गुना अधिक दोहराएं। कुल मिलाकर तीन धोते हैं। FACS बफर के 200 एल में सेल छर्रों Resuspend. धीरे से भंवर का उपयोग करके प्रत्येक ट्यूब में गोली को पूरी तरह से अलग करें। और प्रवाह साइटोमीटर ट्यूबों के लिए लेबल 5 एमएल करने के लिए स्थानांतरण। ट्यूबों को बर्फ पर रखें जब तक कि प्रवाह साइटोमीटर पर विश्लेषण न हो। प्रवाह cytometry सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, एक नया प्रयोग बनाएँ. नमूना पर क्लिक करें और ट्यूबों की एक सूची खोल देगा। डबल-क्लिक करें और उनका नाम बदलें. एस्पिरेटर बांह पर ऑटोफ्लोरेसेंस कंट्रोल ट्यूब रखें, आधार को ध्यान से केवल बाईं ओर ले जाएं। डेटा प्राप्त करें क्लिक करें और फिर डेटा रिकॉर्ड करें, और इच्छित रोक शर्त का चयन करें. मृत कोशिकाओं और मलबे को छोड़कर, ब्याज की कोशिकाओं के चारों ओर एक गेट खींचें। ट्यूब को हटा दें। अगला ट्यूब क्लिक करें और बेसल नियंत्रण नमूना चलाएँ। डेटा प्राप्त करें क्लिक करें और फिर रिकॉर्ड Data.Open सॉफ़्टवेयर में. नमूने जोड़ें क्रिया बटन का उपयोग कर नमूने जोड़ें। Sample जोड़ें.प्रयोगात्मक दिनांक फ़ोल्डर का चयन करें क्लिक करें और Choose.Double-क्लिक करें अपने कार्यस्थान में पहला नमूना क्लिक करें, इस मामले में autofluorescence नियंत्रण। मृत कोशिकाओं और मलबे को छोड़कर, ब्याज की कोशिका को अलग करने के लिए एक बहुभुज गेट खींचें। प्लॉट को हिस्टोग्राम में बदलें. M में डबल-क्लिक करें

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

लाइव चूहा cortical न्यूरॉन्स में mitochondrial झिल्ली संभावित और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के निर्धारण

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

संवेदी अंग अग्रदूत साबित कोशिकाओं के बरकरार में लाइव सेल इमेजिंग ड्रोसोफिला Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

अलग LacZ व्यक्त माउस इनर कान प्रवाह cytometry का उपयोग ऊतकों से कक्ष

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neuroblast परख: पीढ़ी और neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का संवर्धन फर्क तंत्रिका स्टेम सेल संतान से फ्लो का प्रयोग के लिए एक परख

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Neuronal फायरिंग दरों के हेरफेर से astrocytic रिसेप्टर्स की Plasticity उत्प्रेरण

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

संतृप्त ग्रेन्युल न्यूरॉन संस्कृति में फ्लोरोससेन डिसासेट-प्रोविडियम आइडॉड डबल स्टीनिंग का प्रयोग न्यूरॉनल व्हबिलिटी का आकलन

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग के संवर्धित न्यूरॉन्स में एंडोसोम और लियोसोम की क्षमताओं का मात्रा

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

एकल Sciatic नसों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण और एक एकल माउस से पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि प्रवाह का उपयोग कर Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

चूहों और चूहों में संरचनात्मक और कार्यात्मक दृश्य प्रणाली Readouts के रूप में ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी और Optokinetic प्रतिक्रिया का उपयोग

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

3 डी पुनर्निर्माण और Glial और न्यूरोनल कोशिकाओं के आभासी वास्तविकता विश्लेषण के लिए एक विधि

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...