Name: quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

Gli autori ringraziano María Pilar Crespo e Paula Alejandra Abadie del CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) per l'assistenza nella citometria a flusso e Gabriela Furlan e Noelia Maldonado per l'assistenza alle colture cellulari. Ringraziamo anche Victor Diaz (Pro-Segretario della Comunicazione Istituzionale di FCQ) per la produzione e il montaggio video.
Questo articolo è stato finanziato da sovvenzioni di Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) e Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (all to M.C.S.).

NOTA: per le composizioni tampone vedere tabella 1.
1. Preparazione della coltura cellulare
NOTA: Qui è descritta la preparazione della coltura delle cellule MIO-M1, una linea cellulare gliale umana Müller spontaneamente immortalata (Moorfield's/Institute of Ophthalmology- Müller 1). Utilizzare sempre una tecnica asettica adeguata e lavorare in una cappa a flusso laminare.
<ol><li>Prepara il mezzo completo dell'Eagle (DMEM) mod...

<ol>
	<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+retina:+M&#252;ller+glia+commanding+survival+and+death.">A journey into the retina: M&#252;ller glia commanding survival and death.</a> European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).</li><li>Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+and+diabetic+retinopathy.">M&#252;ller cells and diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 93-100 (2017).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Kamalden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+microRNA-15a+transfer+from+the+pancreas+augments+diabetic+complications+by+inducing+oxidative+stress.">Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress.</a> Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+inflammatory+cytokine+TNF&#945;+is+upregulated+in+retinal+angiogenesis+under+hyperoxia.">Transcription of inflammatory cytokine TNF&#945; is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia.</a> Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).</li><li>Rojas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX2-induced+activation+of+arginase+and+diabetes-induced+retinal+endothelial+cell+senescence.">NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence.</a> Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).</li><li>Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+nitric+oxide+synthase+mediates+retinal+apoptosis+in+ischemic+proliferative+retinopathy.">Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).</li><li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase,+NOX1,+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy.">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li><li>Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+triggered+by+oxidative+stress+that+mediate+features+of+severe+retinopathy+of+prematurity.">Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity.</a> JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M&#252;ller+glial+cells.">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal M&#252;ller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells:+The+role+of+M&#252;ller+glial+cells+and+NRF2.">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of M&#252;ller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M&#252;ller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc(-),+the+Na(+)-independent+glutamate-cystine+exchanger.">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal M&#252;ller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li><li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability.">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice.">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li><li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light.">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A.">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury.">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching.">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li><li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy.">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion.">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li><li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III.">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li><li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc&#947;R+cross-linking.">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to Fc&#947;R cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems.">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV.">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li></ol>

Diverse condizioni patologiche, come il cancro, le malattie infiammatorie, l'ischemia / riperfusione, la cardiopatia ischemica, il diabete e le retinopatie, e anche situazioni fisiologiche come l'invecchiamento, portano alla sovrapproduzione di ROS 6,7,8,9,10,11. Pertanto, il rilevamento, la misurazione e la comprensione del ...

La retina neurale è un tessuto molto organizzato che presenta strati neuronali ben definiti. In questi, i neuroni (cellule gangliari, amacrine, bipolari, orizzontali e fotorecettori) sono interconnessi tra loro e anche con cellule gliali di Müller (MMC) e astrociti, portando a un'adeguata fototrasduzione ed elaborazione delle informazioni visive 1,2. Le MGC sono note per avere un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi retinica perché attraversano l'intera sezione retinica e, quindi, possono interagire con tutti i tipi di cellule che modulano molteplici processi protettivi. È stato riportato che le MGC hanno diverse funzioni importanti per il mantenimento e la sopravvivenza dei neuroni retinici, tra cui la glicolisi per fornire energia ai neuroni, la rimozione dei rifiuti neuronali, il riciclaggio dei neurotrasmettitori e il rilascio di fattori neurotrofici, tra gli altri 3,4,5.
D'altra parte, l'infiammazione, lo stress ossidativo e nitrosativo sono coinvolti nella patogenesi e nella progressione di molte malattie umane, comprese le retinopatie 6,7,8,9,10,11. L'equilibrio redox nelle cellule dipende da una stretta regolazione dei livelli di ROS. I ROS sono costantemente generati in condizioni fisiologiche come risultato della respirazione aerobica principalmente. I principali membri della famiglia ROS includono radicali liberi reattivi come l'anione superossido (O2͘͘͘͘•−), radicali idrossilici (•OH), vari perossidi (ROOR′), idroperossidi (ROOH) e il perossido di idrogeno senza radicali (H2O2)12,13. Negli ultimi anni, è diventato evidente che i ROS svolgono un importante ruolo di segnalazione nelle cellule controllando i processi essenziali. Le MGC hanno una forte difesa antiossidante mediante l'attivazione del fattore nucleare trascrizionale eritroide-2-correlato al fattore 2 (Nrf2) e la successiva espressione di proteine antiossidanti per eliminare l'eccessiva produzione di ROS in condizioni patologiche 14,15,16. Quando le cellule perdono il loro equilibrio redox a causa di una produzione esagerata di ROS o di una capacità difettosa di rimuovere ROS, l'accumulo di stress ossidativo promuove modifiche dannose in proteine, lipidi e DNA, portando a stress cellulare o morte. L'aumento del sistema di difesa antiossidante retinico migliora la risoluzione e la prevenzione delle retinopatie, come ROP e RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Pertanto, la misurazione della produzione ros in tempo reale è uno strumento potente e utile.
Esistono diversi metodi per misurare la produzione di ROS o lo stress ossidativo nelle cellule. Tra queste, la sonda 2′,7′-diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) è una delle tecniche più utilizzate per quantificare direttamente lo stato redox di una cellula 25,26,27,28. Questa sonda è lipofila e non fluorescente. La diffusione di questa sonda attraverso la membrana cellulare consente la sua scissione da parte delle esterasi intracellulari ai due legami estere, producendo un prodotto relativamente polare e impermeabile alla membrana cellulare, la 2′,7′-diclorofluoresceina (H2DCF). Questa molecola non fluorescente si accumula intracellulare e la successiva ossidazione da parte di ROS produce il prodotto altamente fluorescente DCF. L'ossidazione della sonda è il prodotto dell'azione di più tipi di ROS (perossinitrito, radicali idrossilici, ossido nitrico o perossidi), che possono essere rilevati mediante citometria a flusso o microscopia confocale (emissione a 530 nm ed eccitazione a 485 nm). Il limite di questa tecnica è che il superossido e il perossido di idrogeno non reagiscono fortemente con H2DCF25,29. In questo articolo, utilizziamo la sonda DCFH-DA per misurare e quantificare i ROS mediante citometria a flusso. Per questo motivo, induciamo la produzione di ROS stimolando mgC con induttore ROS, A o B, prima di caricare le cellule con la sonda fluorescente. Inoltre, utilizziamo un composto antiossidante. Infine, mostriamo dati rappresentativi e affidabili ottenuti utilizzando questo protocollo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-DCFH-DA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 100x20 mm</td>
			<td>Cell Star- Greiner Bio-One</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Sorvall legend micro 17 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>CRYO.S - Greiner Bio-One</td>
			<td>126263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Internegocios</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer, Neubauer chamber</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-6E8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>A12860-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>BD-352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>822335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 6 well</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>111732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.5% 10X</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells

L'equilibrio redox ha un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi cellulare. L'aumento della generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) promuove la modificazione di proteine, lipidi e DNA, che alla fine può portare ad alterazione della funzione cellulare e alla morte cellulare. Pertanto, è utile per le cellule aumentare la loro difesa antiossidante in risposta a insulti dannosi, attivando un percorso antiossidante come Keap1 / Nrf2 o migliorando gli spazzini redox (vitamine A, C ed E, β-carotene e polifenoli, tra gli altri). L'infiammazione e lo stress ossidativo sono coinvolti nella patogenesi e nella progressione delle retinopatie, come la retinopatia diabetica (DR) e la retinopatia della prematurità (ROP). Poiché le cellule gliali di Müller (MMC) svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi del tessuto retinico neurale, sono considerate un modello ideale per studiare questi meccanismi di protezione cellulare. In questo senso, quantificare i livelli di ROS con un metodo riproducibile e semplice è essenziale per valutare il contributo di percorsi o molecole che partecipano al meccanismo di difesa cellulare antiossidante. In questo articolo, forniamo una descrizione completa delle procedure necessarie per la misurazione di ROS con sonda DCFH-DA e citometria a flusso in MMC. I passaggi chiave per l'elaborazione dei dati di citometria a flusso con il software sono forniti qui, in modo che i lettori saranno in grado di misurare i livelli di ROS (mezzi geometrici di FITC) e analizzare gli istogrammi di fluorescenza. Questi strumenti sono molto utili per valutare non solo l'aumento dei ROS dopo un insulto cellulare, ma anche per studiare l'effetto antiossidante di alcune molecole che possono fornire un effetto protettivo sulle cellule.

Come descritto nella sezione protocollo, abbiamo mostrato dati rappresentativi e quantitativi che dimostrano la rilevazione della citometria a flusso della produzione di ROS con la sonda di fluorescenza DCFH-DA da cellule MIO-M1 stimolate con induttore ROS, A o B. Come previsto, abbiamo osservato cambiamenti nella fluorescenza FITC in cellule non stimolate al di sopra dei livelli di autofluorescenza (Figura 1A, confronta "controllo basale" vs "controllo autofluorescenza", grafico a punti). C...

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Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²,7ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÆ’Ã‚Â¼ller Glial Cells

Qui, proponiamo un protocollo sistematizzato, accessibile e riproducibile per rilevare le specie reattive dell'ossigeno cellulare (ROS) utilizzando la sonda di diacetato 2′,7′-diclorofluoresceina (DCFH-DA) nelle cellule gliali di Müller (MMC). Questo metodo quantifica i livelli totali di ROS cellulare con un citometro a flusso. Questo protocollo è molto facile da usare, adatto e riproducibile.

Quantificazione di specie reattive dell'ossigeno utilizzando la sonda di diacetato di 2′,7′-diclorofluoresceina e la citometria a flusso nelle cellule gliali di Müller

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

Esistono diversi metodi per misurare la produzione di ROS o lo stress ossidativo nelle cellule. Tra queste, la sonda 2'7'diclorofluoresceina diacetato è una delle tecniche più utilizzate per misurare direttamente lo stato redox. Questa sonda è lipofila e non fluorescente. La diffusione di questa sonda attraverso la membrana cellulare consente alle esterasi intracellulari di scindersi ai due legami estere, producendo un prodotto relativamente polare e impermeabile alla membrana cellulare. Queste molecole non fluorescenti si accumulano intracellulari e la successiva ossidazione da parte dei ROS produce il prodotto altamente fluorescente diclorofluoresceina. L'ossidazione della sonda è il prodotto dell'azione di più tipi di ROS. Che può essere rilevato mediante citometria a flusso o microscopia confocale. In questo articolo, abbiamo utilizzato una sonda di diacetato di diclorofluoresceina per misurare e quantificare ROS mediante citometria a flusso. Trasferire le piastre a 6 pozzetti in una cappa a flusso laminare dall'incubatore. Aspirare il surnatante. E lavare le cellule una volta con PBS. Aggiungere 2 ml di DMEM sierico basso per pozzetto. E incubare la piastra a 6 pozzetti per due ore nell'incubatrice. Trattare le cellule con l'antiossidante per sei ore. Trattare le cellule con l'induttore ROS, A o B, per 30 minuti. Aspirare il surnatante. E lavare la cellula tre volte con PBS per rimuovere tutti gli stimoli. Spegni la luce della cappa a flusso laminare e lavora al buio. Aggiungere 1 mL di sonda diclorofluoresceina diacetato in DMEM senza rosso fenolo. Aggiungere 1 mL di DMEM senza rosso fenolo alle celle di controllo dell'autofluorescenza di controllo. Incubare la piastra a 6 pozzetti per 30 minuti nell'incubatrice. Trasferire le piastre sul ghiaccio in laboratorio. Lavare le cellule tre volte con 2 ml di PBS freddo per pozzetto. Aggiungere 0,5 ml di tampone di distacco a freddo a ciascun pozzetto. Raccogliere le cellule tubando delicatamente su e giù usando una pipetta P1000. Raccoglieteli in un tubo da 1,5 ml etichettato. E centrifugarli a 600 x g per cinque minuti a 4 C.Scartare accuratamente il surnatante e dissociare delicatamente il pellet con la spillatura. Aggiungere 1 mL di tampone FACS per lavare le celle su ciascun tubo etichettato. Se necessario, utilizzare vortex nella più bassa intensità per la completa dissociazione del pellet. Centrifugarli a 600 x g per cinque minuti a 4 C.Ripetere questo passaggio due volte di più. Tre lavaggi in totale. Resuspend cell pellets in 200 L di tampone FACS. Dissociare delicatamente completamente il pellet in ogni tubo utilizzando vortex. E trasferire a 5 ml etichettati per provette citometriche a flusso. Tenere i tubi sul ghiaccio fino ad analizzarli sul citometro a flusso. Utilizzando il software di citometria a flusso, creare un nuovo esperimento. Fare clic sul campione e si aprirà un elenco di tubi. Fare doppio clic e rinominarli. Posizionare il tubo di controllo dell'autofluorescenza sul braccio dell'aspiratore, spostando attentamente la base solo a sinistra. Fare clic su Acquisisci dati, quindi su Registra dati e selezionare la condizione di arresto desiderata. Disegna un cancello attorno alle celle di interesse, escludendo cellule morte e detriti. Rimuovere il tubo. Fare clic su Tubo successivo ed eseguire il campione di controllo basale. Fare clic su Acquisisci dati e quindi in Registra dati.Aprire il software. Aggiungere gli esempi utilizzando il pulsante di azione Aggiungi campioni. Fare clic su Aggiungi campione.Selezionare la cartella Data sperimentale e fare clic su Scegli.Fare doppio clic sul primo campione nell'area di lavoro, in questo caso controllo di autofluorescenza. Disegna un cancello poligonale per isolare la cella di interesse, escludendo cellule morte e detriti. Cambia il grafico in un istogramma. Fare doppio clic all'interno della M

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Determinazione della mitocondriale Oxygen Species potenziale di membrana e reattiva in neuroni corticali di ratto dal vivo

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Ricerca

Neuroscienze

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolando LacZ cellule che esprimono da tessuti dell&#39;orecchio interno del mouse in citometria a flusso

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Il saggio neuroblasti: un test per la generazione e arricchimento delle cellule progenitrici neuronali di differenziare i Progeny cellule staminali neurali in citometria a flusso

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

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Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture

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Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

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