Name: quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

저자들은 CIBICI의 María Pilar Crespo와 Paula Alejandra Abadie (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina)에게 유세포 측정에 도움을 준 것과 세포 배양 지원을 위해 Gabriela Furlan과 Noelia Maldonado에게 감사하고 싶습니다. 또한 비디오 제작 및 편집에 대한 Victor Diaz (FCQ의 기관 커뮤니케이션 담당 장관)에게 감사드립니다.
이 기사는 Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) 및 Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (모두 M.C.S.)의 보조금으로 자금을 지원받았습니다.

참고: 버퍼 조성에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
1. 세포 배양 준비
참고: 여기에 기술된 것은 자발적으로 불멸화된 인간 뮐러 신경교세포 세포주인 MIO-M1 세포의 배양 준비이다(무어필드/안과 연구소- 뮐러 1). 항상 적절한 무균 기술을 사용하고 층류 후드에서 작업하십시오.
<ol><li>Dulbecco의 수정 된 Eagle 's medium (DMEM) 완전 매체를...

<ol>
	<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+retina:+M&#252;ller+glia+commanding+survival+and+death.">A journey into the retina: M&#252;ller glia commanding survival and death.</a> European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).</li><li>Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+and+diabetic+retinopathy.">M&#252;ller cells and diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 93-100 (2017).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Kamalden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+microRNA-15a+transfer+from+the+pancreas+augments+diabetic+complications+by+inducing+oxidative+stress.">Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress.</a> Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+inflammatory+cytokine+TNF&#945;+is+upregulated+in+retinal+angiogenesis+under+hyperoxia.">Transcription of inflammatory cytokine TNF&#945; is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia.</a> Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).</li><li>Rojas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX2-induced+activation+of+arginase+and+diabetes-induced+retinal+endothelial+cell+senescence.">NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence.</a> Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).</li><li>Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+nitric+oxide+synthase+mediates+retinal+apoptosis+in+ischemic+proliferative+retinopathy.">Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).</li><li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase,+NOX1,+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy.">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li><li>Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+triggered+by+oxidative+stress+that+mediate+features+of+severe+retinopathy+of+prematurity.">Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity.</a> JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M&#252;ller+glial+cells.">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal M&#252;ller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells:+The+role+of+M&#252;ller+glial+cells+and+NRF2.">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of M&#252;ller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M&#252;ller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc(-),+the+Na(+)-independent+glutamate-cystine+exchanger.">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal M&#252;ller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li><li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability.">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice.">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li><li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light.">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A.">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury.">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching.">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li><li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy.">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion.">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li><li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III.">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li><li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc&#947;R+cross-linking.">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to Fc&#947;R cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems.">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV.">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li></ol>

암, 염증성 질환, 허혈 / 재관류, 허혈성 심장 질환, 당뇨병 및 망막 병증과 같은 몇 가지 병리학 적 상태와 노화와 같은 생리적 상황은 ROS 과잉 생산 6,7,8,9,10,11로 이어집니다. 따라서, ROS의 조절에 관여하는 경로의 검출, 측정 및 이해는 많은 질병에 ...

신경 망막은 잘 정의 된 신경 층을 제시하는 매우 조직 된 조직입니다. 이들에서, 뉴런 (신경절, amacrine, 양극성, 수평 및 광수용체 세포)은 서로 상호 연결되고 또한 뮐러 아교 세포 (MGCs) 및 성상 세포와 상호 연결되어 시각 정보의 적절한 광전달 및 처리로 이어진다 1,2. MGCs는 전체 망막 절편을 횡단하기 때문에 망막 항상성의 유지에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 여러 보호 과정을 조절하는 모든 세포 유형과 상호 작용할 수 있습니다. MGC는 뉴런에 에너지를 공급하는 당분해, 신경 노폐물의 제거, 신경 전달 물질의 재활용 및 신경 영양 인자의 방출을 포함하여 망막 뉴런의 유지 및 생존을위한 몇 가지 중요한 기능을 가지고 있음이보고되었습니다 3,4,5.
한편, 염증, 산화 및 니트로성 스트레스는 망막병증 6,7,8,9,10,11을 포함한 많은 인간 질환의 발병기전 및 진행에 관여한다. 세포의 산화 환원 균형은 ROS 수준의 엄격한 조절에 달려 있습니다. ROS는 주로 호기성 호흡의 결과로서 생리학적 조건 하에서 지속적으로 생성된다. ROS 패밀리의 주요 구성원은 수퍼옥사이드 음이온(O2͘͘͘͘•-), 히드록실 라디칼(•OH), 다양한 과산화물(ROOR'), 하이드로퍼옥사이드(ROOH), 및 라디칼 없는 과산화수소(H2O2)12,13과 같은 반응성 자유 라디칼을 포함한다. 지난 몇 년 동안, ROS가 필수적인 과정을 조절함으로써 세포에서 중요한 신호 전달 역할을 한다는 것이 명백해졌다. MGCs는 병리학적 조건 하에서 ROS의 과도한 생산을 제거하는 전사 핵 인자 에리스로이드-2 관련 인자 2 (Nrf2) 및 후속 항산화 단백질의 발현의 활성화에 의해 강력한 항산화 방어력을 갖는다14,15,16. ROS의 과장된 생산 또는 ROS를 제거하는 결함이있는 능력으로 인해 세포가 산화 환원 균형을 잃으면 산화 스트레스의 축적은 단백질, 지질 및 DNA의 유해한 변형을 촉진하여 세포 스트레스 또는 사망으로 이어집니다. 망막 항산화 방어 시스템의 증가는 ROP 및 RD17,18,19,20,21,22,23,24와 같은 망막 병증의 해결 및 예방을 향상시킨다. 따라서 ROS 생산을 실시간으로 측정하는 것은 강력하고 유용한 도구입니다.
세포에서 ROS 생산 또는 산화 스트레스를 측정하는 몇 가지 방법이 있습니다. 이 중 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 프로브는 세포 25,26,27,28의 산화환원 상태를 직접 정량화하는 데 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. 이 프로브는 친유성 및 비형광성이다. 세포막을 가로지르는 이 프로브의 확산은 두 개의 에스테르 결합에서 세포내 에스테라제에 의한 절단을 허용하여, 비교적 극성 및 세포막 불투과성 생성물인 2',7'-디클로로플루오레세인(H2DCF)을 생성한다. 이러한 비형광성 분자는 세포내 축적되고, ROS에 의한 후속 산화는 고도로 형광성 생성물인 DCF를 산출한다. 프로브의 산화는 여러 유형의 ROS (퍼옥시니트라이트, 하이드록실 라디칼, 산화 질소 또는 과산화물)의 작용의 산물이며, 이는 유세포 분석기 또는 공초점 현미경 (530nm에서의 방출 및 485nm에서의 여기)에 의해 검출 될 수 있습니다. 이 기술의 한계는 수퍼옥사이드와 과산화수소가H2 DCF 25,29와 강하게 반응하지 않는다는 것이다. 이 기사에서는 DCFH-DA 프로브를 사용하여 유세포 분석기에 의해 ROS를 측정하고 정량화합니다. 이러한 이유로, 우리는 형광 프로브로 세포를 로딩하기 전에 ROS 유도제 A 또는 B로 MGCs를 자극함으로써 ROS 생산을 유도한다. 또한, 우리는 항산화 화합물을 사용합니다. 마지막으로, 우리는이 프로토콜을 사용하여 얻은 대표적이고 신뢰할 수있는 데이터를 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-DCFH-DA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 100x20 mm</td>
			<td>Cell Star- Greiner Bio-One</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Sorvall legend micro 17 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>CRYO.S - Greiner Bio-One</td>
			<td>126263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Internegocios</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer, Neubauer chamber</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-6E8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>A12860-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>BD-352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>822335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 6 well</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>111732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.5% 10X</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells

산화 환원 균형은 세포 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을합니다. 반응성 산소 종 (ROS)의 증가된 생성은 단백질, 지질 및 DNA의 변형을 촉진하며, 이는 최종적으로 세포 기능 및 세포 사멸의 변화를 초래할 수 있다. 따라서 세포는 Keap1 / Nrf2와 같은 항산화 경로를 활성화하거나 산화 환원 제거제 (비타민 A, C 및 E, β 카로틴 및 폴리 페놀 등)를 개선함으로써 해로운 모욕에 대한 반응으로 항산화 방어력을 높이는 것이 유익합니다. 염증 및 산화 스트레스는 당뇨병성 망막병증(DR) 및 미숙아 망막병증(ROP)과 같은 망막병증의 병인 및 진행에 관여한다. 뮐러 신경교세포(MGCs)는 신경 망막 조직의 항상성에 중요한 역할을 하기 때문에, 이들은 이러한 세포 보호 메커니즘을 연구하기에 이상적인 모델로 간주됩니다. 이러한 의미에서, 재현 가능하고 간단한 방법으로 ROS 수준을 정량화하는 것은 항산화 세포 방어 메카니즘에 참여하는 경로 또는 분자의 기여도를 평가하는 데 필수적이다. 이 기사에서는 DCFH-DA 프로브를 사용한 ROS 측정 및 MGC의 유세포 분석기를 사용하는 데 필요한 절차에 대한 완전한 설명을 제공합니다. 소프트웨어를 사용한 유세포 분석 데이터 처리를 위한 주요 단계가 여기에 제공되므로 독자는 ROS 수준(FITC의 기하학적 수단)을 측정하고 형광 히스토그램을 분석할 수 있습니다. 이러한 도구는 세포 모욕 후 ROS의 증가뿐만 아니라 세포에 대한 보호 효과를 제공 할 수있는 특정 분자의 항산화 효과를 연구하는 데 매우 유용합니다.

프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이, 우리는 ROS 유도제, A 또는 B로 자극된 MIO-M1 세포로부터의 형광 프로브 DCFH-DA를 사용한 ROS 생산의 유세포 분석 검출을 입증하는 대표적이고 정량적인 데이터를 나타내었다. 예상대로, 우리는 자가형광 수준 이상의 자극되지 않은 세포에서 FITC 형광의 변화를 관찰하였다(도 1A, "기저 대조군" 대 "자가형광 대조군"을 비교, 점도표 그래프). 이?...

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Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²,7ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÆ’Ã‚Â¼ller Glial Cells

여기에서는 뮐러 아교 세포 (MGC)에서 2',7'-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA)를 사용하여 세포 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기위한 체계화되고 접근 가능하며 재현 가능한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 유세포 분석기로 총 세포 ROS 수준을 정량화합니다. 이 프로토콜은 사용하기 매우 쉽고 적합하며 재현 가능합니다.

뮐러 신경교 세포에서 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 및 유세포 분석기를 사용한 반응성 산소 종의 정량화

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

세포에서 ROS 생산 또는 산화 스트레스를 측정하기 위한 몇 가지 방법이 있다. 이 중 2'7'디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브는 산화환원 상태를 직접 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. 이 프로브는 친유성 및 비형광성이다. 세포막을 가로지르는 이 프로브의 확산은 두 개의 에스테르 결합에서 세포내 에스테라제 절단을 허용하여, 비교적 극성 및 세포막-불투과성 생성물을 생성한다. 이들 비형광성 분자는 세포내 축적되고, ROS에 의한 후속 산화는 고도로 형광성 생성물인 디클로로플루오레세인을 산출한다. 프로브의 산화는 다중 유형의 ROS의 작용의 산물이다. 이는 유세포 분석기 또는 공초점 현미경에 의해 검출될 수 있다. 이 기사에서는 디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브를 사용하여 유세포 분석기에 의해 ROS를 측정하고 정량화했습니다. 6웰 플레이트를 인큐베이터에서 층류 후드로 옮깁니다. 상층액을 흡인하십시오. 세포를 PBS로 한 번 세척한다. 웰 당 2 mL의 저혈청 DMEM을 첨가하십시오. 6-웰 플레이트를 인큐베이터에서 두 시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 여섯 시간 동안 항산화 제로 치료하십시오. 세포를 30분 동안 ROS 유도인자 A 또는 B로 치료한다. 상층액을 흡인하십시오. 세포를 PBS로 세 번 세척하여 모든 자극을 제거하였다. 층류 후드의 빛을 끄고 어둠 속에서 일하십시오. 페놀 레드가 없는 DMEM에 디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 1 mL를 첨가한다. 페놀 레드가 없는 DMEM 1 mL를 대조군 자가형광 대조군 세포에 첨가한다. 6-웰 플레이트를 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션한다. 얼음 위의 접시를 실험실로 옮기십시오. 웰 당 2 mL의 차가운 PBS로 세포를 세 번 세척한다. 0.5 mL의 콜드 디테이칭 버퍼를 각 웰에 첨가하십시오. P1000 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 수확하십시오. 이들을 라벨이 붙은 1.5 mL 튜브에 모으십시오. 이들을 600 x g에서 5분 동안 4 C.Dis.Dis에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 조심스럽게 버리고, 펠렛을 태핑으로 부드럽게 해리시킨다. FACS 완충액 1 mL를 첨가하여 세포를 각각의 표지된 튜브로 세척한다. 필요한 경우 펠릿을 완전히 해리시키기 위해 가장 낮은 강도의 와류를 사용하십시오. 4 C에서 5분 동안 600 x g에서 원심분리하십시오.이 단계를 두 번 더 반복하십시오. 총 세 번의 세척. 세포 펠릿을 200 L의 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 와류를 사용하여 각 튜브의 펠렛을 부드럽게 완전히 해리시킵니다. 표지된 5 mL를 유동 세포계 튜브로 옮긴다. 유세포 분석기에서 분석 할 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 새로운 실험을 만듭니다. 표본을 클릭하면 튜브 목록이 열립니다. 두 번 클릭하고 이름을 바꿉니다. 자기 형광 제어 튜브를 흡인기기 암에 놓고 조심스럽게 왼쪽으로만 이동하십시오. 데이터 가져오기를 클릭한 다음 데이터 기록을 클릭하고 원하는 중지 조건을 선택합니다. 죽은 세포와 파편을 제외하고 관심있는 세포 주위에 문을 그립니다. 튜브를 분리합니다. 다음 튜브를 클릭하고 기본 제어 샘플을 실행합니다. 데이터 가져오기를 클릭한 다음 데이터 기록에서 소프트웨어를 엽니다. 샘플 추가 작업 단추를 사용하여 샘플을 추가합니다. 샘플 추가를 클릭합니다.실험 날짜 폴더를 선택하고 선택을 클릭합니다.작업공간에서 첫 번째 샘플인 자동 형광 컨트롤을 두 번 누릅니다. 다각형 게이트를 그려 죽은 세포와 파편을 제외한 관심있는 세포를 분리하십시오. 플롯을 히스토그램으로 변경합니다. M 내에서 두 번 클릭

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

라이브 랫 두피 뉴런에서 Mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

연구

신경과학

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

분리 LacZ를 표현 유동세포계측법를 사용하여 마우스 내이 (内耳) 조직의 세포를

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력의 평가

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

단일 좌 골 신경 및 Cytometry 사용 하 여 단일 마우스에서 지 루트 신경 절에 면역 세포의 분석

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

쥐와 쥐에 구조와 기능적 시각 시스템 판독으로 광학 일관성 단층 촬영 및 Optokinetic 응답을 사용 하 여

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...