Name: quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

Forfatterne vil takke María Pilar Crespo og Paula Alejandra Abadie fra CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) for hjelp i flytcytometri og Gabriela Furlan og Noelia Maldonado for hjelp til cellekultur. Vi takker også Victor Diaz (pro-sekretær for institusjonell kommunikasjon av FCQ) for videoproduksjon og redigering.
Denne artikkelen ble finansiert av tilskudd fra Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) og Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alle til M.C.S.).

MERK: For buffersammensetninger, se tabell 1.
1. Forberedelse av cellekultur
MERK: Her beskrives kulturforberedelsene av MIO-M1-celler, en spontant udødeliggjort human Müller glialcellelinje (Moorfields/Institutt for oftalmologi- Müller 1). Bruk alltid riktig aseptisk teknikk og arbeid i en laminær strømningshette.
<ol><li>Forbered Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) komplett medium. Til DMEM som inneholder 4,5 g/L D-g...

<ol>
	<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+retina:+M&#252;ller+glia+commanding+survival+and+death.">A journey into the retina: M&#252;ller glia commanding survival and death.</a> European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).</li><li>Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+and+diabetic+retinopathy.">M&#252;ller cells and diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 93-100 (2017).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Kamalden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+microRNA-15a+transfer+from+the+pancreas+augments+diabetic+complications+by+inducing+oxidative+stress.">Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress.</a> Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+inflammatory+cytokine+TNF&#945;+is+upregulated+in+retinal+angiogenesis+under+hyperoxia.">Transcription of inflammatory cytokine TNF&#945; is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia.</a> Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).</li><li>Rojas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX2-induced+activation+of+arginase+and+diabetes-induced+retinal+endothelial+cell+senescence.">NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence.</a> Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).</li><li>Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+nitric+oxide+synthase+mediates+retinal+apoptosis+in+ischemic+proliferative+retinopathy.">Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).</li><li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase,+NOX1,+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy.">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li><li>Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+triggered+by+oxidative+stress+that+mediate+features+of+severe+retinopathy+of+prematurity.">Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity.</a> JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M&#252;ller+glial+cells.">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal M&#252;ller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells:+The+role+of+M&#252;ller+glial+cells+and+NRF2.">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of M&#252;ller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M&#252;ller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc(-),+the+Na(+)-independent+glutamate-cystine+exchanger.">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal M&#252;ller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li><li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability.">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice.">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li><li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light.">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A.">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury.">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching.">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li><li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy.">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion.">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li><li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III.">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li><li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc&#947;R+cross-linking.">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to Fc&#947;R cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems.">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV.">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li></ol>

Flere patologiske tilstander, som kreft, inflammatoriske sykdommer, iskemi/reperfusjon, iskemisk hjertesykdom, diabetes og retinopatier, og også fysiologiske situasjoner som aldring, fører til ROS-overproduksjon 6,7,8,9,10,11. Derfor er deteksjon, måling og forståelse av banen som er involvert i modulering av ROS viktige ...

Den nevrale netthinnen er et veldig organisert vev som presenterer veldefinerte nevronale lag. I disse er nevroner (ganglion, amacrine, bipolare, horisontale og fotoreseptorceller) koblet sammen med hverandre og også med Müller glialceller (MGCer) og astrocytter, noe som fører til tilstrekkelig fototransduksjon og behandling av visuell informasjon 1,2. MGCer er kjent for å ha en viktig rolle i vedlikehold av retinal homeostase fordi de krysser hele netthinnedelen, og dermed kan de samhandle med alle celletyper som modulerer flere beskyttende prosesser. Det har blitt rapportert at MGCer har flere viktige funksjoner for vedlikehold og overlevelse av retinal nevroner, inkludert glykolyse for å gi energi til nevroner, fjerning av nevronalt avfall, resirkulering av nevrotransmittere og frigjøring av nevrotrofiske faktorer, blant annet 3,4,5.
På den annen side er betennelse, oksidativt og nitrosativt stress involvert i patogenese og progresjon av mange menneskelige sykdommer, inkludert retinopatier 6,7,8,9,10,11. Redoksbalansen i celler avhenger av stram regulering av ROS-nivåer. ROS genereres stadig under fysiologiske forhold som følge av aerob åndedrett hovedsakelig. De viktigste medlemmene av ROS-familien inkluderer reaktive frie radikaler som superoksid-anionen (O2͘͘͘͘•−), hydroksylradikaler (•OH), ulike peroksider (ROOR′), hydroperoksider (ROOH) og ingen radikal hydrogenperoksid (H2O2)12,13. De siste årene har det blitt tydelig at ROS spiller en viktig signalrolle i cellene ved å kontrollere viktige prosesser. MGC har et sterkt antioksidantforsvar ved aktivering av transkripsjonell kjernefysisk faktor erythroid-2-relatert faktor 2 (Nrf2) og det påfølgende uttrykket av antioksidantproteiner for å eliminere overdreven produksjon av ROS under patologiske forhold 14,15,16. Når cellene mister sin redoksbalanse på grunn av en overdrevet produksjon av ROS eller en defekt evne til å fjerne ROS, fremmer opphopning av oksidativt stress skadelige modifikasjoner i proteiner, lipider og DNA, noe som fører til cellulær stress eller død. Økningen av retinal antioksidantforsvaret forbedrer oppløsningen og forebyggingen av retinopatier, som ROP og RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Derfor er måling av ROS-produksjon i sanntid et kraftig og nyttig verktøy.
Det finnes flere metoder for måling av ROS-produksjon eller oksidativt stress i celler. Blant disse er 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) sonde en av de mest brukte teknikkene for direkte kvantifisering av redokstilstanden til en celle 25,26,27,28. Denne sonden er lipofil og ikke-fluorescerende. Diffusjon av denne sonden over cellemembranen tillater spalting av intracellulære esteraser ved de to esterbindingene, og produserer et relativt polart og cellemembran-ugjennomtrengelig produkt, 2′,7′-dichlorofluorescein (H2DCF). Dette ikke-fluorescerende molekylet akkumuleres intracellulært, og etterfølgende oksidasjon av ROS gir det svært fluorescerende produktet DCF. Oksidasjonen av sonden er produktet av virkningen av flere typer ROS (peroksynitritt, hydroksylradikaler, nitrogenoksid eller peroksider), som kan påvises ved strømningscytometri eller konfokal mikroskopi (utslipp ved 530 nm og eksitasjon ved 485 nm). Begrensningen av denne teknikken er at superoksid og hydrogenperoksid ikke reagerer sterkt med H2DCF25,29. I denne artikkelen bruker vi DCFH-DA-sonde for å måle og kvantifisere ROS ved strømningscytometri. Av den grunn induserer vi ROS-produksjon ved å stimulere MGCer med ROS-induser, A eller B, før vi laster cellene med fluorescerende sonde. I tillegg bruker vi en antioksidantforbindelse. Til slutt viser vi representative og pålitelige data innhentet ved hjelp av denne protokollen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-DCFH-DA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 100x20 mm</td>
			<td>Cell Star- Greiner Bio-One</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Sorvall legend micro 17 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>CRYO.S - Greiner Bio-One</td>
			<td>126263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Internegocios</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer, Neubauer chamber</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-6E8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>A12860-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>BD-352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>822335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 6 well</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>111732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.5% 10X</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells

Redoksbalansen har en viktig rolle i å opprettholde cellulær homeostase. Den økte generasjonen reaktive oksygenarter (ROS) fremmer modifikasjon av proteiner, lipider og DNA, noe som til slutt kan føre til endring i cellulær funksjon og celledød. Derfor er det gunstig for celler å øke sitt antioksidantforsvar som svar på skadelige fornærmelser, enten ved å aktivere en antioksidantvei som Keap1 / Nrf2 eller ved å forbedre redoks scavengers (vitamin A, C og E, β-karoten og polyfenoler, blant andre). Betennelse og oksidativt stress er involvert i patogenese og progresjon av retinopatier, som diabetisk retinopati (DR) og retinopati av prematuritet (ROP). Siden Müller glialceller (MGCer) spiller en nøkkelrolle i homeostase av nevralt netthinnevev, anses de som en ideell modell for å studere disse cellulære beskyttelsesmekanismene. I denne forstand er kvantifisering av ROS-nivåer med en reproduserbar og enkel metode viktig for å vurdere bidraget av veier eller molekyler som deltar i antioksidantcelleforsvarsmekanismen. I denne artikkelen gir vi en fullstendig beskrivelse av prosedyrene som kreves for måling av ROS med DCFH-DA-sonde og strømningscytometri i MGCer. Viktige trinn for strømningscytometridatabehandling med programvaren er gitt her, slik at leserne vil kunne måle ROS-nivåer (geometriske midler til FITC) og analysere fluorescens histogrammer. Disse verktøyene er svært nyttige for å evaluere ikke bare økningen i ROS etter en cellulær fornærmelse, men også for å studere antioksidanteffekten av visse molekyler som kan gi en beskyttende effekt på cellene.

Som beskrevet i protokollseksjonen har vi vist representative og kvantitative data som demonstrerer strømningscytometrideteksjon av ROS-produksjon med fluorescenssonden DCFH-DA fra MIO-M1-celler stimulert med ROS-induser, A eller B. Som forventet observerte vi endringer i FITC-fluorescens i ustimulerte celler over autofluorescensnivåer (figur 1A, sammenlign "basal control" vs. "autofluorescence control", dot plots graph). Dette skjedde på grunn av en basal produksjon av ROS i MIO-M1-celle...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²,7ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÆ’Ã‚Â¼ller Glial Cells

Her foreslår vi en systematisert, tilgjengelig og reproduserbar protokoll for å oppdage cellulære reaktive oksygenarter (ROS) ved hjelp av 2′,7′-diklorfluorescein diacetat sonde (DCFH-DA) i Müller glialceller (MGCs). Denne metoden kvantifiserer totale cellulære ROS-nivåer med et strømningscytometer. Denne protokollen er veldig enkel å bruke, egnet og reproduserbar.

Kvantifisering av reaktive oksygenarter ved bruk av 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate Probe og Flow-Cytometry i Müller Glial Cells

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

Det finnes flere metoder for måling av ROS-produksjon, eller oksidativt stress i celler. Blant disse er 2'7'dichlorofluorescein diacetate sonde en av de mest brukte teknikkene for direkte mål på redokstilstand. Denne sonden er lipofil og ikke-fluorescerende. Diffusjon av denne sonden over cellemembranen tillater intracellulære esteraser spalting ved de to esterbindingene, og produserer et relativt polart og cellemembran-ugjennomtrengelig produkt. Disse ikke-fluorescerende molekylene akkumuleres intracellulært, og etterfølgende oksidasjon av ROS gir det svært fluorescerende produktet dichlorofluorescein. Oksidasjonen av sonden er et produkt av virkning av flere typer ROS. Som kan oppdages ved strømningscytometri eller konfiskert mikroskopi. I denne artikkelen har vi brukt en diklorfluorescein diacetat sonde for å måle og kvantifisere ROS ved strømningscytometri. Overfør 6-brønns plater til en laminær strømningshette fra inkubatoren. Aspirer supernatanten. Og vask cellene en gang med PBS. Tilsett 2 ml lav serum DMEM per brønn. Og inkuber 6-brønnsplaten i to timer i inkubatoren. Behandle cellene med antioksidanten i seks timer. Behandle cellene med ROS-induseren, A eller B, i 30 minutter. Aspirer supernatanten. Og vask cellen tre ganger med PBS for å fjerne alle stimuliene. Slå av lyset på laminær strømningshette og arbeid i mørket. Tilsett 1 ml diklorfluorescein diacetat sonde i DMEM uten fenolrød. Tilsett 1 ml DMEM uten fenolrød i kontrollcellene for autofluorescens. Inkuber 6-brønnsplaten i 30 minutter i inkubatoren. Overfør platene på is til laboratoriet. Vask cellene tre ganger med 2 ml kald PBS per brønn. Tilsett 0,5 ml kald avløsningsbuffer til hver brønn. Høst cellene ved å pipette forsiktig opp og ned ved hjelp av en P1000 pipette. Samle dem i merket 1,5 ml rør. Og sentrifuger dem ved 600 x g i fem minutter ved 4 C.Kast supernatanten forsiktig, og fjern forsiktig pelletsen med tapping. Tilsett 1 ml FACS-buffer for å vaske cellene i hvert merket rør. Hvis det er nødvendig, bruk virvel i laveste intensitet for fullstendig dissosiasjon av pellets. Sentrifuger dem på 600 x g i fem minutter ved 4 C.Repeat dette trinnet to ganger mer. Tre vasker totalt. Resuspendcellepellets i 200 L FACS-buffer. Fjern pelletsen forsiktig i hvert rør ved hjelp av virvel. Og overfør til merket 5 ml for strømningscytometerrør. Hold rørene på is til de analyseres på strømningscytometeret. Bruk flytcytometriprogramvaren til å lage et nytt eksperiment. Klikk på prøven og åpne en liste over rør. Dobbeltklikk og gi dem nytt navn. Plasser autofluorescence kontrollrøret på aspiratorarmen, og flytt basen forsiktig bare til venstre. Klikk Hent data og deretter Registrer data, og velg ønsket stoppbetingelse. Tegn en port rundt cellene av interesse, unntatt døde celler og rusk. Fjern røret. Klikk Neste rør og kjør eksemplet med basalkontroll. Klikk Hent data, og klikk deretter i Record Data.Open programvaren. Legg til eksemplene ved hjelp av handlingsknappen Legg til eksempler. Klikk Legg til eksempel.Velg mappen Eksperimentell dato, og klikk Velg.Dobbeltklikk det første eksemplet i arbeidsområdet, autofluorescence-kontrollen i dette tilfellet. Tegn en polygonport for å isolere cellen av interesse, unntatt døde celler og rusk. Endre plott til et histogram. Dobbeltklikk i tabellen M

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolere LacZ-uttrykke Celler fra Mouse Inner Ear Vev bruker flowcytometrisystemer

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Den Neuroblast analysen: en analyse for generering og berikelse av neuronal stamceller fra Skille Neural Stem Cell familie Bruke flowcytometrisystemer

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducing Plasticity av astrocytic Reseptorer av Manipulering av nevronal utløsning priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Vurdering av neuronal levedyktighet ved bruk av fluoresceindiacetat-propidiumjodid-dobbeltfarvning i cerebellar granulærneuronkultur

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kvantifisering av endosom og lysosommotiliteter i dyrkede neuroner ved bruk av fluorescerende prober

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse av immunceller i enkelt Sciatic nerver og Dorsal Root Ganglion fra en enkelt mus med flowcytometri

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Bruke Optical Coherence tomografi og Optokinetic respons som strukturelle og funksjonelle visuelle systemet Readouts i mus og rotter

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

En metode for 3D rekonstruksjon og Virtual Reality analyse av gliacellene og neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...