Name: quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Марию Пилар Креспо и Паулу Алехандру Абади из CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Кордова, Аргентина) за помощь в проточной цитометрии и Габриэлу Фурлан и Ноэлию Мальдонадо за помощь в культивировании клеток. Мы также благодарим Виктора Диаса (просекретаря по институциональным коммуникациям FCQ) за производство и редактирование видео.
Эта статья финансировалась за счет грантов Секретариата по вопросам науки и технологии, Национального университета Кордовы (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Фонда научных исследований и технологий (FONCyT) и Проекта исследований в области науки и технологии (PICT) 2015 N° 1314 (все до M.C.S.).

ПРИМЕЧАНИЕ: Буферные композиции см. в таблице 1.
1. Подготовка клеточной культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описана культуральная подготовка клеток MIO-M1, спонтанно увековеченной глиальной клеточной линии Мюллера человека (Moorfield's/Institute of Ophthalmology- Mülle...

<ol>
	<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+retina:+M&#252;ller+glia+commanding+survival+and+death.">A journey into the retina: M&#252;ller glia commanding survival and death.</a> European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).</li><li>Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+and+diabetic+retinopathy.">M&#252;ller cells and diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 93-100 (2017).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Kamalden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+microRNA-15a+transfer+from+the+pancreas+augments+diabetic+complications+by+inducing+oxidative+stress.">Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress.</a> Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+inflammatory+cytokine+TNF&#945;+is+upregulated+in+retinal+angiogenesis+under+hyperoxia.">Transcription of inflammatory cytokine TNF&#945; is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia.</a> Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).</li><li>Rojas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX2-induced+activation+of+arginase+and+diabetes-induced+retinal+endothelial+cell+senescence.">NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence.</a> Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).</li><li>Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+nitric+oxide+synthase+mediates+retinal+apoptosis+in+ischemic+proliferative+retinopathy.">Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).</li><li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase,+NOX1,+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy.">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li><li>Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+triggered+by+oxidative+stress+that+mediate+features+of+severe+retinopathy+of+prematurity.">Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity.</a> JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M&#252;ller+glial+cells.">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal M&#252;ller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells:+The+role+of+M&#252;ller+glial+cells+and+NRF2.">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of M&#252;ller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M&#252;ller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc(-),+the+Na(+)-independent+glutamate-cystine+exchanger.">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal M&#252;ller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li><li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability.">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice.">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li><li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light.">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A.">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury.">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching.">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li><li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy.">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion.">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li><li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III.">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li><li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc&#947;R+cross-linking.">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to Fc&#947;R cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems.">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV.">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li></ol>

Некоторые патологические состояния, такие как рак, воспалительные заболевания, ишемия / реперфузия, ишемическая болезнь сердца, диабет и ретинопатии, а также физиологические ситуации, такие как старение, приводят к перепроизводству АФК 6,7,8,9,10,11<sup cla...

Нервная сетчатка представляет собой очень организованную ткань, которая представляет собой четко определенные нейронные слои. В них нейроны (ганглиозные, амакриновые, биполярные, горизонтальные и фоторецепторные клетки) взаимосвязаны друг с другом, а также с глиальными клетками Мюллера (MGC) и астроцитами, что приводит к адекватной фототрансдукции и обработке визуальной информации 1,2. Известно, что MMC играют важную роль в поддержании гомеостаза сетчатки, потому что они пересекают весь отдел сетчатки и, таким образом, могут взаимодействовать со всеми типами клеток, которые модулируют несколько защитных процессов. Сообщалось, что MMC имеют несколько важных функций для поддержания и выживания нейронов сетчатки, включая гликолиз для обеспечения энергией нейронов, удаление нейронных отходов, рециркуляцию нейротрансмиттеров и высвобождение нейротрофических факторов, среди прочих 3,4,5.
С другой стороны, воспаление, окислительный и нитрозативный стресс участвуют в патогенезе и прогрессировании многих заболеваний человека, включая ретинопатии 6,7,8,9,10,11. Окислительно-восстановительный баланс в клетках зависит от жесткой регуляции уровней АФК. АФК постоянно вырабатываются в физиологических условиях в результате в основном аэробного дыхания. Основные члены семейства АФК включают реакционноспособные свободные радикалы, такие как супероксидный анион (O2͘͘͘͘•-), гидроксильные радикалы (•OH), различные пероксиды (ROOR'), гидропероксиды (ROOH) и безрадикальный перекись водорода (H2O2)12,13. В последние годы стало очевидно, что АФК играет важную сигнальную роль в клетках, контролируя основные процессы. МГК обладают сильной антиоксидантной защитой за счет активации транскрипционного ядерного фактора эритроид-2, связанного с фактором 2 (Nrf2) и последующей экспрессии антиоксидантных белков для устранения избыточной продукции АФК при патологических состояниях 14,15,16. Когда клетки теряют свой окислительно-восстановительный баланс из-за преувеличенной выработки АФК или дефектной способности удалять АФК, накопление окислительного стресса способствует вредным модификациям в белках, липидах и ДНК, что приводит к клеточному стрессу или смерти. Увеличение системы антиоксидантной защиты сетчатки улучшает разрешение и профилактику ретинопатий, таких как РН и РД 17,18,19,20,21,22,23,24. Поэтому измерение производства АФК в режиме реального времени является мощным и полезным инструментом.
Существует несколько методов измерения продукции АФК или окислительного стресса в клетках. Среди них зонд 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетата (DCFH-DA) является одним из наиболее широко используемых методов прямой количественной оценки окислительно-восстановительного состояния клетки 25,26,27,28. Этот зонд является липофильным и нефлуоресцентным. Диффузия этого зонда через клеточную мембрану позволяет его расщепляться внутриклеточными эстеразами на двух эфирных связях, производя относительно полярный и непроницаемый клеточной мембраной продукт, 2',7'-дихлорфлуоресцеин (H2DCF). Эта нефлуоресцентная молекула накапливается внутриклеточным путем, и последующее окисление АФК дает высокофлуоресцентный продукт DCF. Окисление зонда является продуктом действия нескольких типов АФК (пероксинитрит, гидроксильные радикалы, оксид азота или пероксиды), которые могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии или конфокальной микроскопии (эмиссия при 530 нм и возбуждение при 485 нм). Ограничение этого метода заключается в том, что супероксид и перекись водорода не сильно реагируют с H2DCF25,29. В этой статье мы используем зонд DCFH-DA для измерения и количественной оценки АФК с помощью проточной цитометрии. По этой причине мы индуцируем производство АФК, стимулируя MMC индуктором АФК, А или В, перед загрузкой ячеек флуоресцентным зондом. Кроме того, мы используем антиоксидантное соединение. Наконец, мы показываем репрезентативные и достоверные данные, полученные с помощью этого протокола.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-DCFH-DA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 100x20 mm</td>
			<td>Cell Star- Greiner Bio-One</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Sorvall legend micro 17 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>CRYO.S - Greiner Bio-One</td>
			<td>126263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Internegocios</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer, Neubauer chamber</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-6E8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>A12860-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>BD-352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>822335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 6 well</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>111732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.5% 10X</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells

Окислительно-восстановительный баланс играет важную роль в поддержании клеточного гомеостаза. Увеличение генерации активных форм кислорода (АФК) способствует модификации белков, липидов и ДНК, что, в конечном итоге, может привести к изменению клеточной функции и гибели клеток. Поэтому клеткам полезно повышать свою антиоксидантную защиту в ответ на вредные оскорбления, либо активируя антиоксидантный путь, такой как Keap1 / Nrf2, либо улучшая окислительно-восстановительные поглотители (витамины A, C и E, β-каротин и полифенолы, среди прочих). Воспаление и окислительный стресс участвуют в патогенезе и прогрессировании ретинопатий, таких как диабетическая ретинопатия (ДР) и ретинопатия недоношенных (РН). Поскольку глиальные клетки Мюллера (MMC) играют ключевую роль в гомеостазе нервной ткани сетчатки, они считаются идеальной моделью для изучения этих клеточных защитных механизмов. В этом смысле количественная оценка уровней АФК с помощью воспроизводимого и простого метода имеет важное значение для оценки вклада путей или молекул, которые участвуют в механизме защиты антиоксидантных клеток. В этой статье мы приводим полное описание процедур, необходимых для измерения АФК с помощью зонда DCFH-DA и проточной цитометрии в МГК. Ключевые этапы обработки данных проточной цитометрии с помощью программного обеспечения приведены здесь, поэтому читатели смогут измерять уровни АФК (геометрические средства FITC) и анализировать флуоресцентные гистограммы. Эти инструменты очень полезны для оценки не только увеличения АФК после клеточного инсульта, но и для изучения антиоксидантного эффекта определенных молекул, которые могут обеспечить защитный эффект на клетки.

Как описано в разделе протокола, мы показали репрезентативные и количественные данные, демонстрирующие обнаружение продуцирования АФК с помощью флуоресцентного зонда DCFH-DA из клеток MIO-M1, стимулируемых индуктором АФК, А или В. Как и ожидалось, мы наблюдали изменения флуоресценции FITC в н?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²,7ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÆ’Ã‚Â¼ller Glial Cells

Здесь мы предлагаем систематизированный, доступный и воспроизводимый протокол для обнаружения клеточных активных форм кислорода (АФК) с использованием 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетатного зонда (DCFH-DA) в глиальных клетках Мюллера (MMC). Этот метод количественно оценивает общие клеточные уровни АФК с помощью проточного цитометра. Этот протокол очень прост в использовании, подходит и воспроизводим.

Количественная оценка активных форм кислорода с использованием 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетатного зонда и проточной цитометрии в глиальных клетках Мюллера

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

Существует несколько методов измерения производства АФК или окислительного стресса в клетках. Среди них 2'7'дихлорфлуоресцеин диацетатный зонд является одним из наиболее широко используемых методов для непосредственного измерения окислительно-восстановительного состояния. Этот зонд является липофильным и нефлуоресцентным. Диффузия этого зонда через клеточную мембрану позволяет внутриклеточным эстеразам расщепляться на двух эфирных связях, производя относительно полярный и непроницаемый клеточной мембраной продукт. Эти нефлуоресцентные молекулы накапливаются внутриклеточным образом, и последующее окисление АФК дает высокофлуоресцентный продукт дихлорфлуоресцеин. Окисление зонда является продуктом действия нескольких типов АФК. Которые могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии или конфокальной микроскопии. В этой статье мы использовали дихлорфлуоресцеин диацетатный зонд для измерения и количественной оценки АФК с помощью проточной цитометрии. Переложите 6-луночные плиты в ламинарный проточный вытяжной из инкубатора. Аспирировать супернатанта. И вымойте клетки один раз с помощью PBS. Добавьте 2 мл низкого сывороточного DMEM на лунку. И инкубировать 6-луночную пластину в течение двух часов в инкубаторе. Обрабатывайте клетки антиоксидантом в течение шести часов. Обработайте клетки индуктором АФК, А или В, в течение 30 минут. Аспирировать супернатанта. И промыть клетку три раза PBS, чтобы удалить все раздражители. Выключите свет ламинарного вытяжки и работайте в темноте. Добавьте 1 мл дихлорфлуоресцеина диацетатного зонда в DMEM без фенолового красного цвета. Добавьте 1 мл DMEM без фенольного красного цвета в контрольные ячейки управления автофлуоресценцией. Инкубируйте 6-луночную пластину в течение 30 минут в инкубаторе. Переложите пластины на льду в лабораторию. Промыть клетки три раза 2 мл холодного PBS на лунку. Добавьте 0,5 мл буфера холодного отсоединения в каждую скважину. Соберите клетки, аккуратно пипетируя вверх и вниз с помощью пипетки P1000. Соберите их в маркированную пробирку объемом 1,5 мл. И центрифугируйте их при 600 х г в течение пяти минут при 4 С. Осторожно выбросьте надосадочный материал и аккуратно отделите гранулу постукиванием. Добавьте 1 мл буфера FACS для промывки клеток к каждой маркированной трубке. При необходимости используйте вихрь наименьшей интенсивности для полной диссоциации гранулы. Центрифугируйте их при 600 х г в течение пяти минут при 4 С.Повторите этот шаг еще два раза. Всего три стирки. Повторное суспендирование клеточных гранул в 200 л буфера FACS. Аккуратно полностью диссоциировать гранулу в каждой трубке с помощью вихря. И переложить на маркированные 5 мл для проточных цитометрических трубок. Держите трубки на льду до анализа на проточном цитометре. Используя программное обеспечение для проточной цитометрии, создайте новый эксперимент. Нажмите на образец и откроется список трубок. Дважды щелкните и переименуйте их. Поместите трубку управления автофлуоресценцией на рычаг аспиратора, осторожно перемещая основание только влево. Щелкните Получить данные, а затем Записать данные и выберите нужное условие остановки. Нарисуйте ворота вокруг интересующих клеток, исключив мертвые клетки и мусор. Извлеките трубку. Нажмите кнопку Next Tube и запустите базовый контрольный образец. Щелкните Получить данные, а затем в поле Запись данных.Откройте программное обеспечение. Добавьте образцы с помощью кнопки действия Добавить образцы. Нажмите кнопку Добавить образец.Выберите папку Экспериментальная дата и нажмите кнопку Выбрать.Дважды щелкните первый образец в рабочей области, в данном случае элемент управления автофлуоресценцией. Нарисуйте полигональные ворота, чтобы изолировать интересующую ячейку, исключив мертвые клетки и мусор. Изменение графика на гистограмму. Двойной щелчок внутри M

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Определение Митохондриальная мембранного потенциала и активных форм кислорода в Живом Крыса корковых нейронов

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Изоляция LacZ экспрессирующие клетки из тканей мышей Внутреннее ухо использованием проточной цитометрии

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Нейробластов Анализ: Анализ для создания и обогащения нейронов клетки-предшественники из Дифференцируя нейронных потомков стволовых клеток методом проточной цитометрии

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Склонение пластичности астроцитов рецепторов манипуляциями нейронных уровней расхода топлива

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Оценка жизнеспособности нейронов с помощью двойного окрашивания флуоресцеина диацетат-пропидиум в культуре нейробных гранул мозжечка

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Количественная оценка подвижности эндосомы и лизосом в культивируемых нейронах с помощью флуоресцентных зондов

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Анализ иммунокомпетентных клеток в одном седалищного нервов и спинной корень ганглия от одной мыши с помощью проточной цитометрии

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Использование оптическая когерентная томография и оптокинетический ответ как структурная и функциональная зрительная система отсчетов в мышей и крыс

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Метод 3D-реконструкции и анализа виртуальной реальности глиальных и нейрональных клеток

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...