Name: quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

Författarna vill tacka María Pilar Crespo och Paula Alejandra Abadie från CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) för hjälp med flödescytometri och Gabriela Furlan och Noelia Maldonado för cellodlingshjälp. Vi tackar också Victor Diaz (pro-secretary of institutional communication of FCQ) för videoproduktion och redigering.
Denna artikel finansierades av bidrag från Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) och Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alla till M.C.S.).

OBS: För buffertkompositioner se tabell 1.
1. Beredning av cellodling
OBS: Här beskrivs odlingsberedningen av MIO-M1-celler, en spontant odödliggjord mänsklig Müller-glialcellinje (Moorfields / Institute of Ophthalmology- Müller 1). Använd alltid korrekt aseptisk teknik och arbeta i en laminär flödeshuva.
<ol><li>Förbered Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) kompletta medium. Till DMEM innehållande 4,5 g/l D-gluk...

<ol>
	<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+retina:+Development+and+disease.">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+journey+into+the+retina:+M&#252;ller+glia+commanding+survival+and+death.">A journey into the retina: M&#252;ller glia commanding survival and death.</a> European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).</li><li>Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+and+diabetic+retinopathy.">M&#252;ller cells and diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 93-100 (2017).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Kamalden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+microRNA-15a+transfer+from+the+pancreas+augments+diabetic+complications+by+inducing+oxidative+stress.">Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress.</a> Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+inflammatory+cytokine+TNF&#945;+is+upregulated+in+retinal+angiogenesis+under+hyperoxia.">Transcription of inflammatory cytokine TNF&#945; is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia.</a> Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).</li><li>Rojas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX2-induced+activation+of+arginase+and+diabetes-induced+retinal+endothelial+cell+senescence.">NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence.</a> Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).</li><li>Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+nitric+oxide+synthase+mediates+retinal+apoptosis+in+ischemic+proliferative+retinopathy.">Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).</li><li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase,+NOX1,+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy.">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li><li>Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+triggered+by+oxidative+stress+that+mediate+features+of+severe+retinopathy+of+prematurity.">Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity.</a> JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M&#252;ller+glial+cells.">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal M&#252;ller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li><li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells:+The+role+of+M&#252;ller+glial+cells+and+NRF2.">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of M&#252;ller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M&#252;ller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc(-),+the+Na(+)-independent+glutamate-cystine+exchanger.">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal M&#252;ller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li><li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability.">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice.">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li><li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light.">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A.">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury.">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching.">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li><li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy.">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion.">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li><li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III.">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li><li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc&#947;R+cross-linking.">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to Fc&#947;R cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes:+challenges+and+limitations.">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li><li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems.">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV.">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li></ol>

Flera patologiska tillstånd, såsom cancer, inflammatoriska sjukdomar, ischemi / reperfusion, ischemisk hjärtsjukdom, diabetes och retinopatier, och även fysiologiska situationer som åldrande, leder till ROS-överproduktion 6,7,8,9,10,11. Därför är detektion, mätning och förståelse av vägen som är involverad i mod...

Den neurala näthinnan är en mycket organiserad vävnad som presenterar väldefinierade neuronala lager. I dessa är neuroner (ganglion, amakrin, bipolär, horisontell och fotoreceptorceller) sammankopplade med varandra och även med Müller-glialceller (MGC) och astrocyter, vilket leder till adekvat fototransduktion och bearbetning av visuell information 1,2. MGC är kända för att ha en viktig roll i underhållet av retinal homeostas eftersom de passerar hela retinalsektionen och därmed kan de interagera med alla celltyper som modulerar flera skyddsprocesser. Det har rapporterats att MGC har flera viktiga funktioner för underhåll och överlevnad av retinala neuroner, inklusive glykolys för att ge energi till neuroner, avlägsnande av neuronalt avfall, återvinning av neurotransmittorer och frisättning av neurotrofa faktorer, bland annat 3,4,5.
Å andra sidan är inflammation, oxidativ och nitrosativ stress involverad i patogenesen och utvecklingen av många mänskliga sjukdomar, inklusive retinopatier 6,7,8,9,10,11. Redoxbalansen i celler beror på tät reglering av ROS-nivåer. ROS genereras ständigt under fysiologiska förhållanden som ett resultat av aerob andning huvudsakligen. De viktigaste medlemmarna i ROS-familjen inkluderar reaktiva fria radikaler såsom superoxidanjonen (O2͘͘͘͘•−), hydroxylradikaler (•OH), olika peroxider (ROOR′), hydroperoxider (ROOH) och den icke-radikala väteperoxiden (H2O2)12,13. Under de senaste åren har det blivit uppenbart att ROS spelar en viktig signalroll i cellerna genom att styra väsentliga processer. MGC har ett starkt antioxidantförsvar genom aktivering av den transkriptionella kärnfaktorn erytroid-2-relaterad faktor 2 (Nrf2) och det efterföljande uttrycket av antioxidantproteiner för att eliminera överdriven produktion av ROS under patologiska förhållanden 14,15,16. När cellerna förlorar sin redoxbalans på grund av en överdriven produktion av ROS eller en defekt förmåga att ta bort ROS, främjar ackumuleringen av oxidativ stress skadliga modifieringar i proteiner, lipider och DNA, vilket leder till cellulär stress eller död. Ökningen av det retinala antioxidantförsvarssystemet förbättrar upplösningen och förebyggandet av retinopatier, såsom ROP och RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Därför är mätningen av ROS-produktion i realtid ett kraftfullt och användbart verktyg.
Det finns flera metoder för att mäta ROS-produktion eller oxidativ stress i celler. Bland dessa är 2′,7′-diklorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) sond en av de mest använda teknikerna för att direkt kvantifiera redoxtillståndet för en cell 25,26,27,28. Denna sond är lipofil och icke-fluorescerande. Diffusion av denna sond över cellmembranet möjliggör dess klyvning genom intracellulära esteraser vid de två esterbindningarna, vilket ger en relativt polär och cellmembranogenomtränglig produkt, 2′,7′-diklorfluorescein (H2DCF). Denna icke-fluorescerande molekyl ackumuleras intracellulärt, och efterföljande oxidation av ROS ger den högfluorescerande produkten DCF. Oxidationen av sonden är produkten av verkan av flera typer av ROS (peroxinitrit, hydroxylradikaler, kväveoxid eller peroxider), som kan detekteras genom flödescytometri eller konfokalmikroskopi (emission vid 530 nm och excitation vid 485 nm). Begränsningen av denna teknik är att superoxid och väteperoxid inte reagerar starkt medH2DCF 25,29. I den här artikeln använder vi DCFH-DA-sond för att mäta och kvantifiera ROS med flödescytometri. Av den anledningen inducerar vi ROS-produktion genom att stimulera MGC med ROS-inducerare, A eller B, innan vi laddar cellerna med den fluorescerande sonden. Dessutom använder vi en antioxidantförening. Slutligen visar vi representativa och tillförlitliga data som erhållits med hjälp av detta protokoll.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-DCFH-DA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 100x20 mm</td>
			<td>Cell Star- Greiner Bio-One</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Sorvall legend micro 17 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>CRYO.S - Greiner Bio-One</td>
			<td>126263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Internegocios</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer, Neubauer chamber</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-6E8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>A12860-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium-dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)</td>
			<td>Falcon - Corning</td>
			<td>BD-352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>822335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 6 well</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>111732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.5% 10X</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of reactive oxygen species using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe and flow-cytometry in m&#252;ller glial cells

Redoxbalansen har en viktig roll för att upprätthålla cellulär homeostas. Den ökade generationen av reaktiva syrearter (ROS) främjar modifieringen av proteiner, lipider och DNA, vilket slutligen kan leda till förändring i cellulär funktion och celldöd. Därför är det fördelaktigt för celler att öka sitt antioxidantförsvar som svar på skadliga förolämpningar, antingen genom att aktivera en antioxidantväg som Keap1 / Nrf2 eller genom att förbättra redoxrensare (vitaminerna A, C och E, β-karoten och polyfenoler, bland andra). Inflammation och oxidativ stress är involverade i patogenesen och progressionen av retinopatier, såsom diabetisk retinopati (DR) och retinopati av prematuritet (ROP). Eftersom Müller glialceller (MFC) spelar en nyckelroll i homeostasen av neural retinal vävnad, anses de vara en idealisk modell för att studera dessa cellulära skyddsmekanismer. I den meningen är kvantifiering av ROS-nivåer med en reproducerbar och enkel metod avgörande för att bedöma bidraget från vägar eller molekyler som deltar i antioxidantcellförsvarsmekanismen. I den här artikeln ger vi en fullständig beskrivning av de procedurer som krävs för mätning av ROS med DCFH-DA-sond och flödescytometri i MGC. Viktiga steg för flödescytometridatabehandling med programvaran finns här, så läsarna kommer att kunna mäta ROS-nivåer (geometriska medel för FITC) och analysera fluorescens histogram. Dessa verktyg är till stor hjälp för att utvärdera inte bara ökningen av ROS efter en cellulär förolämpning utan också för att studera antioxidanteffekten av vissa molekyler som kan ge en skyddande effekt på cellerna.

Som beskrivs i protokollavsnittet har vi visat representativa och kvantitativa data som visar flödescytometridetektering av ROS-produktion med fluorescenssonden DCFH-DA från MIO-M1-celler stimulerade med ROS-inducerare, A eller B. Som förväntat observerade vi förändringar i FITC-fluorescens i ostimulerade celler över autofluorescensnivåerna (Figur 1A, jämför "basal kontroll" kontra "autofluorescenskontroll", dot plots graph). Detta inträffade på grund av en basal produktion av RO...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2Ã¢â‚¬Â²,7Ã¢â‚¬Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÂ¼ller Glial Cells at JoVE.com

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²,7ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in MÃƒÆ’Ã‚Â¼ller Glial Cells

Här föreslår vi ett systematiserat, tillgängligt och reproducerbart protokoll för att detektera cellulära reaktiva syrearter (ROS) med användning av 2′,7′-diklorfluoresceindiacetatsond (DCFH-DA) i Müller glialceller (MGC). Denna metod kvantifierar totala cellulära ROS-nivåer med en flödescytometer. Detta protokoll är mycket lätt att använda, lämpligt och reproducerbart.

Kvantifiering av reaktiva syrearter med användning av 2′,7′-diklorfluoresceindiacetatsond och flödescytometri i Müller glialceller

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

Det finns flera metoder för att mäta ROS-produktion, eller oxidativ stress i celler. Bland dessa är 2'7'diklorfluoresceindiacetatsond en av de mest använda teknikerna för direkt mätning av redoxtillstånd. Denna sond är lipofil och icke-fluorescerande. Diffusion av denna sond över cellmembranet tillåter de intracellulära esteraserna att klyvas vid de två esterbindningarna, vilket ger en relativt polär och cellmembranogenomtränglig produkt. Dessa icke-fluorescerande molekyler ackumuleras intracellulärt, och efterföljande oxidation av ROS ger den högfluorescerande produkten diklorfluorescein. Oxidationen av sonden är produkten av verkan av flera typer av ROS. Vilket kan detekteras genom flödescytometri eller konfokalmikroskopi. I den här artikeln har vi använt en diklorfluoresceindiacetatsond för att mäta och kvantifiera ROS genom flödescytometri. Överför 6-brunnsplattor till en laminär flödeshuva från inkubatorn. Aspirera supernatanten. Och tvätta cellerna en gång med PBS. Tillsätt 2 ml DMEM med lågt serum per brunn. Och inkubera 6-brunnsplattan i två timmar i inkubatorn. Behandla cellerna med antioxidanten i sex timmar. Behandla cellerna med ROS-induceraren, A eller B, i 30 minuter. Aspirera supernatanten. Och tvätta cellen tre gånger med PBS för att ta bort alla stimuli. Stäng av ljuset på den laminära flödeshuven och arbeta i mörker. Tillsätt 1 ml diklorfluoresceindiacetatsond i DMEM utan fenolrött. Tillsätt 1 ml DMEM utan fenolrött till kontrollcellerna för autofluorescens. Inkubera 6-brunnsplattan i 30 minuter i inkubatorn. Överför plattorna på is till laboratoriet. Tvätta cellerna tre gånger med 2 ml kall PBS per brunn. Tillsätt 0,5 ml kallavlastande buffert till varje brunn. Skörda cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ner med en P1000-pipett. Samla dem i märkt 1,5 ml rör. Och centrifugera dem vid 600 x g i fem minuter vid 4 C.Kassera supernatanten försiktigt och försiktigt dissociera pelletsen med tappning. Tillsätt 1 ml FACS-buffert för att tvätta cellerna till varje märkt rör. Om det är nödvändigt, använd virvel i lägsta intensitet för fullständig dissociation av pelletsen. Centrifugera dem vid 600 x g i fem minuter vid 4 C.Upprepa detta steg två gånger mer. Tre tvättar totalt. Resuspend cellpellets i 200 liter FACS-buffert. Dissociera försiktigt pelletsen i varje rör helt med hjälp av virvel. Och överför till märkt 5 ml för flödescytometerrör. Håll rören på is tills de analyseras på flödescytometer. Använd flödescytometriprogramvaran och skapa ett nytt experiment. Klicka på provet och öppna en lista med rör. Dubbelklicka och byt namn på dem. Placera autofluorescenskontrollröret på andningsarmen och flytta basen försiktigt endast åt vänster. Klicka på Hämta data och sedan på Spela in data och välj önskat stoppvillkor. Rita en grind runt cellerna av intresse, exklusive döda celler och skräp. Ta bort röret. Klicka på Nästa rör och kör basalkontrollprovet. Klicka på Hämta data och sedan på Spela in data.Öppna programvaran. Lägg till exemplen med åtgärdsknappen Lägg till exempel. Klicka på Lägg till exempel.Välj mappen Experimentellt datum och klicka på Välj.Dubbelklicka på det första exemplet på din arbetsyta, autofluorescenskontroll i det här fallet. Rita en polygonport för att isolera cellen av intresse, exklusive döda celler och skräp. Ändra diagram till ett histogram. Dubbelklicka i M

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Fastställande av mitokondriell membranpotential och reaktiva syreradikaler i Live Rat kortikala Neuroner

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolera LacZ-uttryckande celler från mus Inre öronvävnader med flödescytometri

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Den Neuroblast Analys: En analys för generering och anrikning av neuronala progenitorceller från Skilja Neural Stem Cell Progeny med hjälp av flödescytometri

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion Plasticitet hos astrocytiska Receptorer genom manipulering av neuron priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Bedömning av neuronal livskraft med användning av fluoresceindiacetat-propidiumjodid dubbelfärgning i cerebellal granulär neurokultur

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kvantifiering av endosom och lysosommotiliteter i odlade neuroner med användning av fluorescerande probar

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analys av immunceller i enda höftnerver och dorsalrotsganglier Ganglion från ett enda musklick med hjälp av flödescytometri

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Med optisk koherenstomografi och Optokinetic svar som strukturella och funktionella visuella systemet avläsning på möss och råttor

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

En metod för 3D-rekonstruktion och virtuell verklighet analys av Glial och neuronala celler

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...