Name: stereotaxic surgical approach to microinject the caudal brainstem and upper cervical spinal cord via the cisterna magna in mice
Uploaded: 2022-01-21T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par R01 NS079623, P01 HL149630 et P01 HL095491.

L’auteur déclare que le protocole suit les directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Préparation des instruments chirurgicaux et du cadre stéréotaxique
REMARQUE: La chirurgie est effectuée dans des conditions aseptiques. La stérilité est maintenue à l’aide de la technique de la pointe stérile.
<ol><li>Installez le bras stéréotaxique avec une micropipette ...

<ol>
	<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+Stereotaxic+Surgery.">Rodent Stereotaxic Surgery.</a> JoVE Science Education Database. , (2021).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Rangarajan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+in+vivo+assessment+of+targeting+accuracy+of+stereotactic+brain+surgery+in+experimental+rodent+models.">Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).</li><li>Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+retroambiguus-spinal+pathway+in+the+mouse:+Localization,+gender+differences,+and+effects+of+estrogen+treatment.">Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment.</a> The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).</li><li>Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connections+of+the+parabrachial+nucleus+with+the+nucleus+of+the+solitary+tract+and+the+medullary+reticular+formation+in+the+rat.">Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).</li><li>Vanderhorst, V. G., Holstege, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caudal+medullary+pathways+to+lumbosacral+motoneuronal+cell+groups+in+the+cat:+evidence+for+direct+projections+possibly+representing+the+final+common+pathway+for+lordosis.">Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis.</a> The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).</li><li>Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+projections+from+the+nucleus+retroambiguus+to+motoneurons+supplying+the+abdominal+wall,+axial,+hindlimb,+and+pelvic+floor+muscles+in+the+female+rhesus+monkey.">Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey.</a> The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).</li><li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus.">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).</li><li>Krashes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+reversible+activation+of+AgRP+neurons+drives+feeding+behavior+in+mice.">Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).</li><li>Ganchrow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+of+the+solitary+tract+in+the+C57BL/6J+mouse:+Subnuclear+parcellation,+chorda+tympani+nerve+projections,+and+brainstem+connections.">Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections.</a> The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).</li><li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue.">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).</li></ol>

La chirurgie stéréotaxique standard s’appuie généralement sur des repères crâniens pour calculer les coordonnées des sites cibles dans leSNC 1. Les sites cibles sont ensuite accessibles par des trous de bavure qui sont percés à travers le crâne1. Cette méthode n’est pas idéale pour le tronc cérébral caudal car les sites cibles sont situés loin des repères du crâne dans les plans antéropostérieur et dorsoventral2 et com...

La chirurgie stéréotaxique standard pour cibler les sites cérébraux chez la souris1 implique généralement la fixation du crâne à l’aide d’un ensemble de barres auriculaires et d’une barre buccale. Les coordonnées sont ensuite estimées sur la base des atlas de référence 2,3 et des repères crâniens, à savoir bregma (le point où les sutures des os frontaux et pariétaux se rejoignent) ou lambda (le point où les sutures des os pariétaux et occipitaux se rejoignent; Figure 1A,B). Grâce à un trou de bavure dans le crâne au-dessus de la cible estimée, la région cible peut alors être atteinte, soit pour la livraison de microinjections, soit pour l’instrumentation avec des canules ou des fibres optiques. En raison de la variation de l’anatomie de ces sutures et des erreurs dans la localisation de bregma ou lambda 4,5, la position des points zéro par rapport au cerveau varie d’un animal à l’autre. Bien que les petites erreurs de ciblage, qui résultent de cette variabilité, ne soient pas un problème pour les cibles grandes ou proches, leur impact est plus important pour les petites zones d’intérêt éloignées des points zéro dans les plans antéropostérieur ou dorsoventral et / ou lors de l’étude d’animaux de taille variable en raison de l’âge, de la tension et / ou du sexe. Il existe plusieurs défis supplémentaires qui sont uniques pour la moelle oblongée et la moelle cervicale supérieure. Tout d’abord, de petits changements dans les coordonnées antéropostériennes sont associés à des changements significatifs des coordonnées dorsoventrales par rapport à la dure-mère, en raison de la position et de la forme du cervelet (Figure 1Bi)2,6,7. Deuxièmement, la moelle cervicale supérieure n’est pas contenue dans le crâne2. Troisièmement, la position inclinée de l’os occipital et la couche sus-jacente des muscles du cou2 rendent l’approche stéréotaxique standard encore plus difficile pour les structures situées près de la transition entre le tronc cérébral et la moelle épinière (Figure 1Bi). Enfin, de nombreuses cibles d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la corde cervicale sont petites2, nécessitant des injections précises et reproductibles 8,9.
Une approche alternative à travers la cisterna magna contourne ces problèmes. La cisterna magna est un grand espace qui s’étend de l’os occipital à l’atlas (Figure 1A, c’est-à-dire le deuxième os vertébral)10. Il est rempli de liquide céphalo-rachidien et recouvert dedure-mère 10. Cet espace entre l’os occipital et l’atlas s’ouvre lors de l’antéroflexion de la tête. On peut y accéder en naviguant entre les ventres appariés sus-jacents du muscle longus capitis, exposant la surface dorsale du tronc cérébral caudal. Les régions d’intérêt peuvent ensuite être ciblées en fonction des points de repère de ces régions elles-mêmes si elles sont situées près de la surface dorsale; ou en utilisant l’obex, le point où le canal central s’ouvre dans le ventricule IV, comme point zéro pour que les coordonnées atteignent des structures plus profondes. Cette approche a été utilisée avec succès chez une variété d’espèces, y compris le rat11, le chat12, la souris 8,9 et le primate non humain13 pour cibler le groupe respiratoire ventral, la formation réticulaire médiale médullaire, le noyau du tractus solitaire, la zone postrema ou le noyau hypoglosse. Cependant, cette approche n’est pas largement utilisée car elle nécessite des connaissances en anatomie, une boîte à outils spécialisée et des compétences chirurgicales plus avancées par rapport à l’approche stéréotaxique standard.
Nous décrivons ici une approche chirurgicale étape par étape pour atteindre le tronc cérébral et la moelle cervicale supérieure via la cisterna magna, visualiser les points de repère, définir le point zéro (Figure 2) et estimer et optimiser les coordonnées cibles pour l’administration stéréotaxique de microinjections dans les régions discrètes du tronc cérébral et de la moelle épinière d’intérêt (Figure 3). Nous discutons ensuite des avantages et des inconvénients liés à cette approche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alcohol pad</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>SKU: MDS090735Z</td>
			<td>skin preparation for the prevention of surgical site infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled forceps, Dumont #5/45</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>only to grab dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine pad</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>SKU:PVP-PAD</td>
			<td>skin preparation for the prevention of surgical site infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>488: C34775, 594: C22842</td>
			<td>Fluorescent tracer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>Model MC3, 28915-10</td>
			<td>for shaving fur at surgical site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder with corner clamp</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1770</td>
			<td>to hold glass pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmeter</td>
			<td>Gilmont instruments</td>
			<td>model # 65 MM</td>
			<td>to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microspheres, polystyrene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F13080</td>
			<td>Fluorescent tracer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53800M</td>
			<td>thermoregulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction chamber with port hook up kit</td>
			<td>Midmark Inc</td>
			<td>93805107 92800131</td>
			<td>chamber providing initial anasthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>26028</td>
			<td>to administer saline and analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>SKU:RXISO-250</td>
			<td>inhalant anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer</td>
			<td>Midmark Inc</td>
			<td>91305430</td>
			<td>apparatus for inhalant anesthetic delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminectomy forceps, Dumont #2</td>
			<td>FST</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>only to clean dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical air, compressed</td>
			<td>Linde</td>
			<td>UN 1002</td>
			<td>used with stimulator &#38; PicoPump for providing air for precision solution injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam SR</td>
			<td>Zoo Pharm LLC</td>
			<td>Lot # MSR2-211201</td>
			<td>analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube</td>
			<td>Globe Scientific Inc</td>
			<td>51628</td>
			<td>for transfection of material to designated co-ordinates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>0051625</td>
			<td>&#160;adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>91308-12</td>
			<td>for suturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Life Support Products</td>
			<td>S/N 909328, lot 092109</td>
			<td>regulate oxygen levels from oxygen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tank, compressed</td>
			<td>Linde</td>
			<td>USP UN 1072</td>
			<td>provided along with isoflurane anasthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic card</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump ( or similar)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>For precision solution injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, sterile</td>
			<td>Mountainside Medical Equipment</td>
			<td>H04888-10</td>
			<td>to replace body fluids lost during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, #3</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>to hold scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Wagner</td>
			<td>FST</td>
			<td>14070-12</td>
			<td>to cut polypropylene suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box</td>
			<td>FST</td>
			<td>15002-08</td>
			<td>scissors only to open dura, box to elevate body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic micromanipulator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1760-61</td>
			<td>attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic &#39;U&#39; frame assembly and intracellular base plate</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1730-B, 1711</td>
			<td>frame for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton tipped applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806 10WC</td>
			<td>absorbing blood from surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile non-fenestrated drapes</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9004686</td>
			<td>for sterile surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile opthalmic ointment</td>
			<td>Puralube</td>
			<td>P1490</td>
			<td>ocular lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator &#38; Tubing</td>
			<td>Grass Medical Instruments</td>
			<td>S44</td>
			<td>to provide controlled presurred air for precision solution injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade #10</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>SKU: 10SS</td>
			<td>for skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps, Extra fine Graefe</td>
			<td>FST</td>
			<td>11153-10</td>
			<td>to hold skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gloves</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>MSG2280Z</td>
			<td>for asceptic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model M320/ F12</td>
			<td>for 5X-40X magnification of surgical site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 polypropylene</td>
			<td>Oasis</td>
			<td>MV-8661</td>
			<td>to close the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm</td>
			<td>3M</td>
			<td>3M ID 70200749250</td>
			<td>provides sterile barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp and stand post</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1725</td>
			<td>attached to stereotactic U frame and intracellular base plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound hook with hartman hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09, 13003-10</td>
			<td>to separate muscles and provide surgical window</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic surgical approach to microinject the caudal brainstem and upper cervical spinal cord via the cisterna magna in mice

La chirurgie stéréotaxique pour cibler les sites cérébraux chez la souris est généralement guidée par des repères crâniens. L’accès est ensuite obtenu par des trous de bavure percés à travers le crâne. Cette approche standard peut être difficile pour les cibles du tronc cérébral caudal et de la moelle cervicale supérieure en raison de défis anatomiques spécifiques, car ces sites sont éloignés des points de repère du crâne, ce qui entraîne une imprécision. Nous décrivons ici une approche stéréotaxique alternative via la cisterna magna qui a été utilisée pour cibler des régions discrètes d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure. La cisterna magna s’étend de l’os occipital à l’atlas (c’est-à-dire le deuxième os vertébral), est remplie de liquide céphalo-rachidien et est recouverte de dure-mère. Cette approche fournit une voie d’accès reproductible à certaines structures du système nerveux central (SNC) qui sont autrement difficiles à atteindre en raison de barrières anatomiques. En outre, il permet une visualisation directe des repères du tronc cérébral à proximité des sites cibles, augmentant ainsi la précision lors de l’administration de petits volumes d’injection dans des régions restreintes d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure. Enfin, cette approche offre l’occasion d’éviter le cervelet, ce qui peut être important pour les études motrices et sensorimotrices.

L’approche cisterna magna permet de cibler les structures caudales du tronc cérébral et de la moelle cervicale supérieure qui sont autrement difficiles à atteindre par des approches stéréotaxiques standard ou qui sont sujettes à un ciblage incohérent. La chirurgie pour atteindre la cisterna magna nécessite des incisions de la peau, une fine couche de muscle trapèze et l’ouverture de la dure-mère et est donc bien tolérée par les souris. Il est particulièrement efficace et moins invasif lorsqu’...

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Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

La chirurgie stéréotaxique pour cibler les sites cérébraux chez la souris implique généralement un accès par les os du crâne et est guidée par des repères du crâne. Nous décrivons ici une approche stéréotaxique alternative pour cibler le tronc cérébral caudal et la moelle épinière cervicale supérieure via la cisterna magna qui repose sur la visualisation directe des repères du tronc cérébral.

Approche chirurgicale stéréotaxique pour microinjecter le tronc cérébral caudal et la moelle épinière cervicale supérieure via la Cisterna Magna chez la souris

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. ...

Ce protocole fournit des lignes directrices étape par étape pour une voie d’accès reproductible aux régions d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure. Cette technique augmente la précision lors de l’administration de petits volumes d’injection à des régions restreintes d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure. Cette technique a été et peut être appliquée à d’autres modèles animaux.La Dre Veronique VanderHorst, professeure agrégée de neurologie et chercheuse principale du laboratoire VanderHorst, fera la démonstration de cette procédure. Assurez-vous que le flux d’oxygène est dirigé vers le cône du nez. Déplacez la souris sur le cadre stéréotaxique et placez le nez dans un cône de nez flexible.Placez la souris dans le cadre stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille uniquement. Placez du lubrifiant sur les yeux. Antéroflex la tête de la souris à un angle de 90 degrés en guidant manuellement le nez.Pour sécuriser cette position, placez une barrière en plastique entre les piliers de la barre d’oreille de l’adaptateur de souris parallèlement aux piliers avec la partie plate du crâne servant de référence. Placez le coussin chauffant sous la souris et assurez-vous que le cou et le reste du corps sont positionnés parallèlement à la table en élevant le corps avec une petite boîte. Placez un drapé sous le corps.Injecter une dose unique de quatre milligrammes par kilogramme de Méloxicam à libération lente par voie sous-cutanée à un volume de deux microlitres par gramme de poids corporel. Nettoyez d’abord le site d’incision chirurgicale avec un tampon de préparation à 70% d’alcool, puis avec un tampon de préparation à la bétaïne, puis à nouveau avec un tampon de préparation à l’alcool et laissez-le sécher. Désinfectez les mains et mettez des gants stériles, puis placez un drapé sur le site chirurgical.Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée en pinçant les orteils ou en vérifiant le réflexe cornéen. Réduire l’isoflurane pour maintenir les niveaux à 2,0. Faites une incision d’un à 1,2 centimètre avec une lame chirurgicale de 10 du bord de l’os occipital vers les épaules en un seul mouvement lisse.Faites soigneusement une incision dans le raphé médian du muscle trapèze, exposant les muscles longus capitis appariés. Placez les deux crochets d’enrouleur entre les muscles appariés de longus capitis, l’un orienté vers la gauche et l’autre vers la droite. Utilisez les pinces à laminectomie émoussée pour séparer les ventres gauche et droit du muscle longus capitis apparié, en commençant par l’occiput où la ligne médiane est facilement visible.Guidez la pince émoussée à travers l’os de l’occiput dans la ligne médiane jusqu’à l’endroit où elle rencontre la dure-mère cisternale, puis continuez à travers la dure-mère jusqu’à l’atlas. Repositionnez les rétracteurs et ajustez la tension en repositionnant les hémostats. Utilisez les pinces à laminectomie contondantes pour séparer davantage les muscles dans la ligne médiane afin d’obtenir une bonne vue du tronc cérébral et du cervelet.Répétez la procédure ci-dessus au besoin jusqu’à ce que le cervelet et le tronc cérébral apparaissent sous la dure-mère. À l’aide de pinces à laminectomie contondantes, dégagez la dure-mère des petits brins de tissu conjonctif en déplaçant la pince de la ligne médiane dans une direction latérale jusqu’à ce qu’il y ait une vue claire du tronc cérébral, créant ainsi plus d’espace latéral. Visualisez la surface dorsale du tronc cérébral avec des repères détaillés à travers la dure-mère ouverte.Utilisez la pince inclinée pour saisir la dure-mère s’étendant de l’os occipital à l’atlas, puis utilisez les ciseaux à ressort pour faire une petite ouverture d’environ 0,5 à 1,5 millimètre dans la dure-mère. Une fois la dure-mère ouverte, drainez l’excès de liquide céphalo-rachidien avec un Q-tip stérile. L’obex, le point où le canal central s’ouvre dans le quatrième ventricule, est le point zéro standard antérieur-postérieur et médiolatéral.Placez la pipette ou la seringue sur la cible à l’aide du bras stéréotaxique. Abaissez le bras de la dorsale sur la surface dorsale qui se forme à partir du point zéro dorsoventral. Ensuite, abaissez la pipette sur le tronc cérébral et injectez la solution.Laissez l’aiguille en place pendant une à cinq minutes après l’injection pour éviter une trace d’aiguille lorsque vous utilisez des volumes compris entre trois et 50 nanolitres. Soulevez ensuite la pipette ou la seringue à l’aide du bras stéréotaxique et répétez cette opération pour plusieurs cibles. Retirez soigneusement les crochets du champ chirurgical.Les muscles de longus capitis appariés retomberont dans une position neutre couvrant entièrement la cisterna magna. Ne fermez pas le muscle trapèze et la dure-mère dans la ligne médiane car ils sont trop fragiles pour tenir les sutures. Fermez la peau avec 3 sutures en nylon ou en polypropylène.L’approche cisterna magna permet de cibler le tronc cérébral caudal et les structures de la moelle cervicale supérieure qui sont autrement difficiles à atteindre par des approches stéréotaxiques standard ou qui sont sujettes à un ciblage incohérent. Chez la souris, des structures telles que le noyau hypoglosse, le groupe respiratoire ventral et la formation réticulaire adjacente dans le tronc cérébral caudal ont été systématiquement ciblées à l’aide de l’approche cisterna magna comme illustré ici pour le noyau hypoglosse et la médulla ventromédiale. Afin de déterminer la précision de l’approche cisterna magna par rapport à l’approche standard, la distance entre les sites cibles prévus et réels dans les plans antéropostérieur, médiolatéral et dorsoventral pour les régions ventrale et dorsale a été mesurée.Les résultats montrent des erreurs significativement plus faibles dans les plans antéropostérieur, médiolatéral et dorsoventral par rapport à l’approche standard, ce qui souligne la précision accrue de l’approche cisterna magna pour ces cibles. Lors de la tentative de ce protocole, il est essentiel de s’assurer que l’antéroflexion de la tête et l’élévation du corps sont effectuées comme décrit. Ensuite, il est important de reconnaître les points de repère clés avant de manipuler le muscle ou la dure-mère.Si ces repères ne sont pas reconnus ou s’ils sont perdus, il sera difficile de rester orienté et d’exécuter la procédure comme prévu. Cette technique a permis de répondre à des questions conceptuelles liées à l’organisation anatomique fonctionnelle dans le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Recherche

Neurosciences

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