Name: stereotaxic surgical approach to microinject the caudal brainstem and upper cervical spinal cord via the cisterna magna in mice
Uploaded: 2022-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי R01 NS079623, P01 HL149630 ו- P01 HL095491.

המחבר מצהיר כי הפרוטוקול תואם את הנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז הרפואי בית ישראל.
1. הכנת כלי ניתוח ומסגרת סטריאוטקסית
הערה: הניתוח מבוצע בתנאים אספטיים. הסטריליות נשמרת באמצעות טכניקת הקצה הסטרילית.
<ol><li>התקינו את הזרוע הסטרי...

<ol>
	<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+Stereotaxic+Surgery.">Rodent Stereotaxic Surgery.</a> JoVE Science Education Database. , (2021).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Rangarajan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+in+vivo+assessment+of+targeting+accuracy+of+stereotactic+brain+surgery+in+experimental+rodent+models.">Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).</li><li>Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+detection+of+the+bregma+point+on+the+rat+skull.">A new approach to detection of the bregma point on the rat skull.</a> Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).</li><li>Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, (1992).</li><li>Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science Available from: <a target="_blank" href="https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas">https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas</a> (2004)</li><li>Vanderhorst, V. G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+retroambiguus-spinal+pathway+in+the+mouse:+Localization,+gender+differences,+and+effects+of+estrogen+treatment.">Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment.</a> The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).</li><li>Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory-related+outputs+of+glutamatergic,+hypercapnia-responsive+parabrachial+neurons+in+mice.">Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).</li><li>Anselmi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonographic+anatomy+of+the+atlanto-occipital+region+and+ultrasound-guided+cerebrospinal+fluid+collection+in+rabbits+(Oryctolagus+cuniculus).">Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus).</a> Veterinary Radiology &amp; Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).</li><li>Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connections+of+the+parabrachial+nucleus+with+the+nucleus+of+the+solitary+tract+and+the+medullary+reticular+formation+in+the+rat.">Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).</li><li>Vanderhorst, V. G., Holstege, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caudal+medullary+pathways+to+lumbosacral+motoneuronal+cell+groups+in+the+cat:+evidence+for+direct+projections+possibly+representing+the+final+common+pathway+for+lordosis.">Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis.</a> The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).</li><li>Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+projections+from+the+nucleus+retroambiguus+to+motoneurons+supplying+the+abdominal+wall,+axial,+hindlimb,+and+pelvic+floor+muscles+in+the+female+rhesus+monkey.">Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey.</a> The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).</li><li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus.">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).</li><li>Krashes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+reversible+activation+of+AgRP+neurons+drives+feeding+behavior+in+mice.">Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).</li><li>Ganchrow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+of+the+solitary+tract+in+the+C57BL/6J+mouse:+Subnuclear+parcellation,+chorda+tympani+nerve+projections,+and+brainstem+connections.">Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections.</a> The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).</li><li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue.">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).</li></ol>

ניתוח סטריאוטקסי סטנדרטי מסתמך בדרך כלל על ציוני דרך של גולגולת כדי לחשב את הקואורדינטות של אתרי המטרה ב- CNS1. לאחר מכן ניגשים לאתרי המטרה דרך חורי בור שנקדחים דרך הגולגולת1. שיטה זו אינה אידיאלית לגזע המוח הקאודלי, שכן אתרי המטרה ממוקמים הרחק מציוני הדרך של הג...

ניתוח סטריאוטקסי סטנדרטי לאיתור אתרי מוח בעכברים1 כולל בדרך כלל קיבוע של הגולגולת באמצעות סט של מוטות אוזניים ומוט פה. הקואורדינטות נאמדות לאחר מכן על סמך אטלסים ייחוס 2,3, ונקודות ציון של הגולגולת, כלומר, bregma (הנקודה שבה התפרים של העצמות המצחיות והקודקודיות מתאחדות) או למבדה (הנקודה שבה התפרים של העצמות הקודקודיות והאוציפיטליות מתאחדות; איור 1א,ב). דרך חור בור לתוך הגולגולת שמעל המטרה המשוערת, ניתן להגיע לאזור המטרה, בין אם לצורך אספקת מיקרו-אינטגרציות או מכשור עם צינוריות או סיבים אופטיים. בשל שונות באנטומיה של תפרים אלה וטעויות בלוקליזציה של bregma או lambda 4,5, המיקום של נקודות אפס ביחס למוח משתנה מחיה לחיה. בעוד שטעויות קטנות במיקוד, הנובעות מהשתנות זו, אינן מהוות בעיה עבור מטרות גדולות או קרובות, השפעתן גדולה יותר עבור אזורי עניין קטנים יותר המרוחקים מנקודות האפס במישורים האנטרופוסטריוריים או הגביים ו/או כאשר חוקרים בעלי חיים בגדלים משתנים בשל גיל, מתח ו/או מין. ישנם מספר אתגרים נוספים שהם ייחודיים למדולה אובלונגטה ולחוט הצוואר העליון. ראשית, שינויים קטנים בקואורדינטות אנטרופוסטריות קשורים לשינויים משמעותיים בקואורדינטות הגב-ונטרליות ביחס לדורה, בשל המיקום והצורה של המוח הקטן (איור 1Bi)2,6,7. שנית, חוט הצוואר העליון אינו כלול בתוך הגולגולת2. שלישית, תנוחת ההטיה של העצם העורפית והשכבה העליונה של שרירי הצוואר2 הופכת את הגישה הסטריאוטקסית הסטנדרטית למאתגרת עוד יותר עבור מבנים הממוקמים בסמוך למעבר בין גזע המוח לחוט השדרה (איור 1Bi). לבסוף, מטרות רבות של עניין בגזע המוח הקאודלי ובחובר צוואר הרחם הן קטנות2, הדורשות זריקות מדויקות וניתנות לשחזור 8,9.
גישה חלופית באמצעות הציסטרנה מגנה עוקפת את הבעיות הללו. הציסטרנה מגנה היא חלל גדול המשתרע מהעצם העורפית ועד האטלס (איור 1A, כלומר עצם החוליה השנייה)10. הוא מלא בנוזל שדרתי ומכוסה על ידי דורה מאטר10. רווח זה בין העצם העורפית לבין האטלס נפתח בעת אנטרופלקסינג של הראש. ניתן לגשת אליו על ידי ניווט בין הבטן הזוגית העליונה של שריר הלונגוס קפיטיס, וחושף את פני השטח הגביים של גזע המוח הקאודלי. לאחר מכן ניתן להתמקד באזורים מעניינים על סמך ציוני הדרך של אזורים אלה עצמם אם הם ממוקמים בסמוך לפני השטח הגביים; או על ידי שימוש ב-obex, הנקודה שבה התעלה המרכזית נפתחת לחדר IV, כנקודת אפס לקואורדינטות כדי להגיע למבנים עמוקים יותר. גישה זו שימשה בהצלחה במגוון מינים, כולל חולדה11, חתול12, עכבר 8,9, ופרימט לא אנושי13 כדי להתמקד בקבוצת הנשימה הגחונית, היווצרות רשתית מדיאלית מדולרית, גרעין דרכי הבודדות, אזור פוסטרמה או גרעין היפוגלוסלי. עם זאת, גישה זו אינה נמצאת בשימוש נרחב מכיוון שהיא דורשת ידע באנטומיה, ערכת כלים מיוחדת וכישורים כירורגיים מתקדמים יותר בהשוואה לגישה הסטריאוטקסית הסטנדרטית.
כאן אנו מתארים גישה כירורגית שלב אחר שלב כדי להגיע לגזע המוח ולחוט הצוואר העליון דרך הציסטרנה מגנה, לדמיין ציוני דרך, להגדיר את נקודת האפס (איור 2), ולהעריך ולמטב את קואורדינטות המטרה להעברה סטריאוטקסית של מיקרו-איניג'מנטים לתוך גזע המוח הבדיד ואזורי העניין של חוט השדרה (איור 3). לאחר מכן נדון ביתרונות ובחסרונות הקשורים לגישה זו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alcohol pad</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>SKU: MDS090735Z</td>
			<td>skin preparation for the prevention of surgical site infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled forceps, Dumont #5/45</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>only to grab dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine pad</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>SKU:PVP-PAD</td>
			<td>skin preparation for the prevention of surgical site infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>488: C34775, 594: C22842</td>
			<td>Fluorescent tracer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>Model MC3, 28915-10</td>
			<td>for shaving fur at surgical site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder with corner clamp</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1770</td>
			<td>to hold glass pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmeter</td>
			<td>Gilmont instruments</td>
			<td>model # 65 MM</td>
			<td>to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microspheres, polystyrene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F13080</td>
			<td>Fluorescent tracer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53800M</td>
			<td>thermoregulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction chamber with port hook up kit</td>
			<td>Midmark Inc</td>
			<td>93805107 92800131</td>
			<td>chamber providing initial anasthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>26028</td>
			<td>to administer saline and analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>SKU:RXISO-250</td>
			<td>inhalant anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer</td>
			<td>Midmark Inc</td>
			<td>91305430</td>
			<td>apparatus for inhalant anesthetic delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminectomy forceps, Dumont #2</td>
			<td>FST</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>only to clean dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical air, compressed</td>
			<td>Linde</td>
			<td>UN 1002</td>
			<td>used with stimulator &#38; PicoPump for providing air for precision solution injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam SR</td>
			<td>Zoo Pharm LLC</td>
			<td>Lot # MSR2-211201</td>
			<td>analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube</td>
			<td>Globe Scientific Inc</td>
			<td>51628</td>
			<td>for transfection of material to designated co-ordinates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>0051625</td>
			<td>&#160;adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>91308-12</td>
			<td>for suturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Life Support Products</td>
			<td>S/N 909328, lot 092109</td>
			<td>regulate oxygen levels from oxygen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tank, compressed</td>
			<td>Linde</td>
			<td>USP UN 1072</td>
			<td>provided along with isoflurane anasthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic card</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump ( or similar)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>For precision solution injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, sterile</td>
			<td>Mountainside Medical Equipment</td>
			<td>H04888-10</td>
			<td>to replace body fluids lost during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, #3</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>to hold scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Wagner</td>
			<td>FST</td>
			<td>14070-12</td>
			<td>to cut polypropylene suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box</td>
			<td>FST</td>
			<td>15002-08</td>
			<td>scissors only to open dura, box to elevate body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic micromanipulator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1760-61</td>
			<td>attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic &#39;U&#39; frame assembly and intracellular base plate</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1730-B, 1711</td>
			<td>frame for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton tipped applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806 10WC</td>
			<td>absorbing blood from surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile non-fenestrated drapes</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9004686</td>
			<td>for sterile surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile opthalmic ointment</td>
			<td>Puralube</td>
			<td>P1490</td>
			<td>ocular lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator &#38; Tubing</td>
			<td>Grass Medical Instruments</td>
			<td>S44</td>
			<td>to provide controlled presurred air for precision solution injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade #10</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>SKU: 10SS</td>
			<td>for skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps, Extra fine Graefe</td>
			<td>FST</td>
			<td>11153-10</td>
			<td>to hold skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gloves</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>MSG2280Z</td>
			<td>for asceptic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model M320/ F12</td>
			<td>for 5X-40X magnification of surgical site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 polypropylene</td>
			<td>Oasis</td>
			<td>MV-8661</td>
			<td>to close the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm</td>
			<td>3M</td>
			<td>3M ID 70200749250</td>
			<td>provides sterile barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp and stand post</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1725</td>
			<td>attached to stereotactic U frame and intracellular base plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound hook with hartman hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09, 13003-10</td>
			<td>to separate muscles and provide surgical window</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic surgical approach to microinject the caudal brainstem and upper cervical spinal cord via the cisterna magna in mice

ניתוח סטריאוטקסי למיקוד אתרי מוח בעכברים מונחה בדרך כלל על ידי ציוני דרך של גולגולת. לאחר מכן מתקבלת הגישה באמצעות חורי בור שנקדחו דרך הגולגולת. גישה סטנדרטית זו יכולה להיות מאתגרת עבור מטרות בגזע המוח הקאודלי ובחוט הצוואר העליון בשל אתגרים אנטומיים ספציפיים מכיוון שאתרים אלה מרוחקים מציוני דרך של גולגולת, מה שמוביל לחוסר דיוק. כאן אנו מתארים גישה סטריאוטקסית חלופית באמצעות ה-cisterna magna ששימשה כדי להתמקד באזורים בדידים בעלי עניין בגזע המוח הקאודלי ובחוט הצוואר העליון. הציסטרנה מגנה משתרעת מהעצם העורפית ועד האטלס (כלומר, עצם החוליה השנייה), מלאה בנוזל מוחי, ומכוסה על ידי דורה מאטר. גישה זו מספקת נתיב גישה ניתן לשחזור למבנים נבחרים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) שאחרת קשה להגיע אליהם בשל מחסומים אנטומיים. יתר על כן, הוא מאפשר הדמיה ישירה של ציוני דרך בגזע המוח בסמיכות לאתרי המטרה, מה שמגדיל את הדיוק בעת אספקת נפחי הזרקה קטנים לאזורי עניין מוגבלים בגזע המוח הקאודלי ובחובר הצוואר העליון. לבסוף, גישה זו מספקת הזדמנות להימנע המוח הקטן, אשר יכול להיות חשוב עבור מחקרים מוטוריים וסנסו-מוטוריים.

גישת ה-cisterna magna מאפשרת למקד את גזע המוח הקאודלי ואת המבנים של חוטי הצוואר העליונים שקשה להגיע אליהם בדרך אחרת באמצעות גישות סטריאוטקסיות סטנדרטיות או שהם מועדים למיקוד לא עקבי. הניתוח כדי להגיע לציסטרנה מגנה דורש חתכים של העור, שכבה דקה של שריר טרפז, ופתיחת הדורה מאטר ולכן הוא נסבל היט...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice at JoVE.com

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

ניתוח סטריאוטקסי למיקוד אתרי מוח בעכברים כולל בדרך כלל גישה דרך עצמות הגולגולת ומונחה על ידי ציוני דרך בגולגולת. כאן אנו מתווים גישה סטריאוטקסית חלופית כדי להתמקד בגזע המוח הקאודלי ובחוט השדרה הצווארי העליון באמצעות ה-cisterna magna המסתמך על הדמיה ישירה של ציוני דרך של גזע המוח.

גישה כירורגית סטריאוטקסית למיקרו-איניג'קט גזע המוח הקאודלי וחוט השדרה הצווארי העליון באמצעות ציסטרנה מגנה בעכברים

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. ...

פרוטוקול זה מספק קווים מנחים שלב אחר שלב לנתיב גישה הניתן לשחזור לאזורי עניין בגזע המוח הקאודלי ובחוט הצוואר העליון. טכניקה זו מגבירה את הדיוק בעת אספקת נפחי הזרקה קטנים לאזורי עניין מוגבלים בגזע המוח הקאודלי ובחוט הצוואר העליון. טכניקה זו הייתה וניתן ליישם על מודלים אחרים של בעלי חיים.ד"ר ורוניק ונדרהורסט, פרופסור לנוירולוגיה והחוקרת הראשית של מעבדת ואנדרהורסט, תדגים את ההליך הזה. ודא שזרימת החמצן מופנית לחרוט האף. הזיזו את העכבר למסגרת הסטריאוטקסית והניחו את האף בחרוט אף גמיש.מקם את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית באמצעות סרגלי אוזניים בלבד. מניחים חומר סיכה על העיניים. Anteroflex את ראש העכבר לזווית של 90 מעלות על ידי הנחיה ידנית של האף.כדי לאבטח מיקום זה, הניחו מחסום פלסטיק בין עמודי מוט האוזן של מתאם העכבר במקביל לעמודים כאשר החלק השטוח של הגולגולת משמש כהפניה. מניחים את כרית החימום מתחת לעכבר ומוודאים שהצוואר ושאר הגוף ממוקמים במקביל לשולחן על ידי הגבהת הגוף עם קופסה קטנה. מניחים וילון מתחת לגוף.הזריקו מנה אחת של ארבעה מיליגרם לקילוגרם לקילוגרם Meloxicam בשחרור איטי תת עורית בנפח של שני מיקרוליטרים לגרם של משקל הגוף. נקו את אתר החתך הניתוחי תחילה עם כרית הכנה של 70% אלכוהול, אחר כך עם כרית הכנה של בטאין, ואז שוב עם כרית הכנה לאלכוהול ותנו לו להתייבש. יש לחטא את הידיים ולשים כפפות סטריליות, ולאחר מכן להניח וילון באתר הניתוח.ודא שהעכבר מורדם כראוי על ידי צביטה של הבהונות או בדיקת רפלקס הקרנית. הפחיתו את האיזופלורן כדי לשמור על הרמות של 2.0. בצע חתך של סנטימטר אחד עד 1.2 ס"מ עם להב כירורגי של 10 מקצה העצם העורפית לכיוון הכתפיים בתנועה חלקה אחת.בזהירות לבצע חתך בקו האמצע של שריר הטרפז, וחושף את שרירי הלוגוס קפיטיס הזוגיים. מניחים את שני הווים החוזרים בין שרירי הלוגוס קאפיטיס הזוגיים, אחד מכוון שמאלה והשני ימינה. השתמש במלקחיים הלמינקטומיים הבוטים כדי להפריד בין הבטן השמאלית והימנית של שריר הלוגוס קפיטיס הזוגי, החל מהאוקסיפוט שבו קו האמצע נראה בקלות.הנחה את המלקחיים הבוטים על פני עצם האוקסיפוט בקו האמצע עד למקום שבו הוא פוגש את הדורה מאטר הציסטרינלית ואז המשך על פני הדורה מאטר אל האטלס. מקם מחדש את הנסיגים והתאים את המתח על ידי מיקום מחדש של ההמוסטאטים. השתמש במלקחיים למינכטומיה קהה כדי להפריד את השרירים עוד יותר בקו האמצע כדי לקבל תצוגה טובה של גזע המוח והמוח הקטן.חזור על ההליך הנ"ל לפי הצורך עד שהמוח הקטן וגזע המוח יופיעו מתחת לדורה. באמצעות מלקחיים למינכטומיה קהים, נקו את הדורה מהחוטים הקטנים של רקמת החיבור על ידי הזזת המלקחיים מקו האמצע בכיוון רוחבי עד שתהיה תצוגה ברורה של גזע המוח, תוך יצירת מרחב רוחבי יותר. צפו במשטח הגבי של גזע המוח עם ציוני דרך מפורטים דרך הדורה הפתוחה.השתמש במלקחיים הזוויתיים כדי לתפוס את הדורה המשתרעת מהעצם העורפית ועד האטלס, ולאחר מכן השתמש במספריים הקפיץ כדי ליצור פתח קטן של כ-0.5 עד 1.5 מילימטרים בדורה. לאחר פתיחת הדורה, יש לנקז עודפי נוזל מוחי עם קצה Q סטרילי. האובקס, הנקודה שבה התעלה המרכזית נפתחת לחדר הרביעי, היא נקודת האפס הקדמית-אחורית והמדיולטרלית הסטנדרטית.מקם את הפיפטה או המזרק למטרה באמצעות הזרוע הסטריאוטקסית. הורידו את הזרוע של הגב אל המשטח הגבי שנוצר מנקודת האפס הגבית. לאחר מכן הורידו את הפיפטה לגזע המוח והזריקו את התמיסה.השאירו את המחט במקומה למשך דקה עד חמש דקות לאחר ההזרקה כדי להימנע ממסלול מחט בעת שימוש בנפחים שבין שלושה ל-50 ננו-ליטרים. לאחר מכן הרימו את הפיפטה או המזרק באמצעות הזרוע הסטריאוטקסית וחזור על כך עבור מטרות מרובות. הסר את הווים בזהירות משדה הניתוח.שרירי הלוגוס קאפיטיס הזוגיים ייפלו בחזרה לתנוחה נייטרלית המכסה באופן מלא את הציסטרנה מגנה. אין לסגור את שריר הטרפז ואת דורה מאטר בקו האמצע מכיוון שהם שבירים מכדי להחזיק תפרים. סגור את העור עם 3 תפרים ניילון או פוליפרופילן.גישת cisterna magna מאפשרת למקד את גזע המוח הקאודלי ואת המבנים של חוטי הצוואר העליונים שקשה להגיע אליהם בדרך אחרת באמצעות גישות סטריאוטקסיות סטנדרטיות או שהם מועדים למיקוד לא עקבי. בעכברים, מבנים כגון הגרעין ההיפוגלוסלי, קבוצת הנשימה הגחונית והיווצרות רשתית סמוכה בגזע המוח הקאודלי הותקפו באופן שגרתי באמצעות גישת cisterna magna כפי שהודגם כאן עבור הגרעין ההיפוגלוסלי והמדולה הגחונית. על מנת לקבוע את הדיוק של גישת הציסטרנה מגנה לעומת הגישה הסטנדרטית, נמדד המרחק בין אתרי המטרה המיועדים והממשיים במישורים האנטרופוסטריים, הבינוניים והדורסו-ונטרליים לאזורי הגחון והגב.התוצאות מראות טעויות קטנות משמעותית במישורים האנטרופוסטריים, הבינוניים והדורסו-וונטרליים בהשוואה לגישה הסטנדרטית, מה שמדגיש את הדיוק המשופר של גישת cisterna magna עבור מטרות אלה. כאשר מנסים פרוטוקול זה, חשוב לוודא כי anteroflexion של הראש ואת הגובה של הגוף מבוצעת כמתואר. לאחר מכן, חשוב לזהות ציוני דרך מרכזיים לפני מניפולציה של השריר או הדורה מאטר.אם ציוני דרך אלה לא יוכרו או אם הם אבדו, יהיה מאתגר להישאר מכוונים ולבצע את ההליך כמתוכנן. טכניקה זו סייעה להתמודד עם שאלות מושגיות הקשורות לארגון האנטומי התפקודי בתוך גזע המוח הקאודל וחבל הצוואר העליון.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

ההדמיה דיפוזיה בחוט השדרה עכברוש צוואר הרחם

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

השרשה בצינורית לתוך המלון Cisterna של מכרסמים

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

A Revised Surgical Approach to Induce Endolymphatic Hydrops in the Guinea Pig

גישה כירורגית מתוקן כדי לגרום הידרופס הידרו בשפן גינאה

Endolymphatic hydrops is an enlargement of scala media that is most often associated with Meniere&#39;s disease, though the pathophysiologic mechanism(s) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...