Name: stereotaxic surgical approach to microinject the caudal brainstem and upper cervical spinal cord via the cisterna magna in mice
Uploaded: 2022-01-21T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por R01 NS079623, P01 HL149630 y P01 HL095491.

El autor declara que el protocolo sigue las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro Médico Beth Israel Deaconess.
1. Preparación de instrumentos quirúrgicos y marco estereotáxico
NOTA: La cirugía se realiza en condiciones asépticas. La esterilidad se mantiene mediante la técnica de punta estéril.
<ol><li>Instale el brazo estereotáxico con una micropipeta o jeringa llena de un inyectable de su elecci...

<ol>
	<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+Stereotaxic+Surgery.">Rodent Stereotaxic Surgery.</a> JoVE Science Education Database. , (2021).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Rangarajan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+in+vivo+assessment+of+targeting+accuracy+of+stereotactic+brain+surgery+in+experimental+rodent+models.">Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models.</a> Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).</li><li>Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+retroambiguus-spinal+pathway+in+the+mouse:+Localization,+gender+differences,+and+effects+of+estrogen+treatment.">Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment.</a> The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).</li><li>Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connections+of+the+parabrachial+nucleus+with+the+nucleus+of+the+solitary+tract+and+the+medullary+reticular+formation+in+the+rat.">Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).</li><li>Vanderhorst, V. G., Holstege, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caudal+medullary+pathways+to+lumbosacral+motoneuronal+cell+groups+in+the+cat:+evidence+for+direct+projections+possibly+representing+the+final+common+pathway+for+lordosis.">Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis.</a> The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).</li><li>Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+projections+from+the+nucleus+retroambiguus+to+motoneurons+supplying+the+abdominal+wall,+axial,+hindlimb,+and+pelvic+floor+muscles+in+the+female+rhesus+monkey.">Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey.</a> The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).</li><li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus.">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).</li><li>Krashes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+reversible+activation+of+AgRP+neurons+drives+feeding+behavior+in+mice.">Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).</li><li>Ganchrow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+of+the+solitary+tract+in+the+C57BL/6J+mouse:+Subnuclear+parcellation,+chorda+tympani+nerve+projections,+and+brainstem+connections.">Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections.</a> The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).</li><li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue.">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).</li></ol>

La cirugía estereotáxica estándar comúnmente se basa en puntos de referencia del cráneo para calcular las coordenadas de los sitios objetivo en el SNC1. Luego se accede a los sitios objetivo a través de orificios de rebaba que se perforan a través del cráneo1. Este método no es ideal para el tronco encefálico caudal, ya que los sitios objetivo se encuentran distantes de los puntos de referencia del cráneo en los planos anteroposterior y dorsoventral<sup ...

La cirugía estereotáxica estándar para atacar los sitios cerebrales en ratones1 comúnmente implica la fijación del cráneo utilizando un conjunto de barras para los oídos y una barra bucal. Las coordenadas se estiman entonces en función de los atlas de referencia 2,3 y los puntos de referencia del cráneo, a saber, bregma (el punto donde se unen las suturas de los huesos frontal y parietal) o lambda (el punto donde se unen las suturas de los huesos parietal y occipital; Figura 1A,B). A través de un orificio de rebaba en el cráneo por encima del objetivo estimado, se puede llegar a la región objetivo, ya sea para la entrega de microinyecciones o instrumentación con cánulas o fibras ópticas. Debido a la variación en la anatomía de estas suturas y errores en la localización de bregma o lambda 4,5, la posición de los puntos cero en relación con el cerebro varía de un animal a otro. Si bien los pequeños errores en la focalización, que resultan de esta variabilidad, no son un problema para objetivos grandes o cercanos, su impacto es mayor para áreas de interés más pequeñas que están alejadas de los puntos cero en los planos anteroposterior o dorsoventral y / o cuando se estudian animales de tamaño variable debido a la edad, la tensión y / o el sexo. Hay varios desafíos adicionales que son únicos para la médula oblonga y el cordón cervical superior. En primer lugar, pequeños cambios en las coordenadas anteroposteriores se asocian con cambios significativos en las coordenadas dorsoventrales en relación con la duramadre, debido a la posición y forma del cerebelo (Figura 1Bi)2,6,7. En segundo lugar, el cordón cervical superior no está contenido dentro del cráneo2. En tercer lugar, la posición inclinada del hueso occipital y la capa suprayacente de los músculos del cuello2 hace que el enfoque estereotáxico estándar sea aún más desafiante para las estructuras ubicadas cerca de la transición entre el tronco encefálico y la médula espinal (Figura 1Bi). Finalmente, muchas dianas de interés en el tronco encefálico caudal y la médula cervical son pequeñas2, requiriendo inyecciones precisas y reproducibles 8,9.
Un enfoque alternativo a través de la cisterna magna elude estos problemas. La cisterna magna es un gran espacio que se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas (Figura 1A, es decir, el segundo hueso vertebral)10. Está lleno de líquido cefalorraquídeo y cubierto por la duramadre10. Este espacio entre el hueso occipital y el atlas se abre al anteroflexionar la cabeza. Se puede acceder navegando entre los vientres pareados suprayacentes del músculo longus capitis, exponiendo la superficie dorsal del tronco encefálico caudal. Las regiones de interés pueden ser atacadas en función de los puntos de referencia de estas regiones si se encuentran cerca de la superficie dorsal; o mediante el uso del obex, el punto donde el canal central se abre en el ventrículo IV, como un punto cero para que las coordenadas alcancen estructuras más profundas. Este enfoque se ha utilizado con éxito en una variedad de especies, incluidas la rata11, el gato12, el ratón 8,9 y el primate no humano13 para atacar el grupo respiratorio ventral, la formación reticular medial medular, el núcleo del tracto solitario, el área postrema o el núcleo hipogloso. Sin embargo, este enfoque no se utiliza ampliamente, ya que requiere conocimientos de anatomía, un conjunto de herramientas especializado y habilidades quirúrgicas más avanzadas en comparación con el enfoque estereotáxico estándar.
Aquí describimos un enfoque quirúrgico paso a paso para llegar al tronco encefálico y la médula cervical superior a través de la cisterna magna, visualizar puntos de referencia, establecer el punto cero (Figura 2) y estimar y optimizar las coordenadas objetivo para la entrega estereotáxica de microinyecciones en las regiones discretas del tronco encefálico y la médula espinal de interés (Figura 3). A continuación, discutimos las ventajas y desventajas relacionadas con este enfoque.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alcohol pad</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>SKU: MDS090735Z</td>
			<td>skin preparation for the prevention of surgical site infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled forceps, Dumont #5/45</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>only to grab dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine pad</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>SKU:PVP-PAD</td>
			<td>skin preparation for the prevention of surgical site infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>488: C34775, 594: C22842</td>
			<td>Fluorescent tracer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>Model MC3, 28915-10</td>
			<td>for shaving fur at surgical site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder with corner clamp</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1770</td>
			<td>to hold glass pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmeter</td>
			<td>Gilmont instruments</td>
			<td>model # 65 MM</td>
			<td>to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microspheres, polystyrene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F13080</td>
			<td>Fluorescent tracer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53800M</td>
			<td>thermoregulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction chamber with port hook up kit</td>
			<td>Midmark Inc</td>
			<td>93805107 92800131</td>
			<td>chamber providing initial anasthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>26028</td>
			<td>to administer saline and analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>SKU:RXISO-250</td>
			<td>inhalant anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer</td>
			<td>Midmark Inc</td>
			<td>91305430</td>
			<td>apparatus for inhalant anesthetic delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminectomy forceps, Dumont #2</td>
			<td>FST</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>only to clean dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical air, compressed</td>
			<td>Linde</td>
			<td>UN 1002</td>
			<td>used with stimulator &#38; PicoPump for providing air for precision solution injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam SR</td>
			<td>Zoo Pharm LLC</td>
			<td>Lot # MSR2-211201</td>
			<td>analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube</td>
			<td>Globe Scientific Inc</td>
			<td>51628</td>
			<td>for transfection of material to designated co-ordinates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>0051625</td>
			<td>&#160;adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>91308-12</td>
			<td>for suturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Life Support Products</td>
			<td>S/N 909328, lot 092109</td>
			<td>regulate oxygen levels from oxygen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tank, compressed</td>
			<td>Linde</td>
			<td>USP UN 1072</td>
			<td>provided along with isoflurane anasthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic card</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump ( or similar)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>For precision solution injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, sterile</td>
			<td>Mountainside Medical Equipment</td>
			<td>H04888-10</td>
			<td>to replace body fluids lost during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, #3</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>to hold scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Wagner</td>
			<td>FST</td>
			<td>14070-12</td>
			<td>to cut polypropylene suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box</td>
			<td>FST</td>
			<td>15002-08</td>
			<td>scissors only to open dura, box to elevate body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic micromanipulator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1760-61</td>
			<td>attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic &#39;U&#39; frame assembly and intracellular base plate</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1730-B, 1711</td>
			<td>frame for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton tipped applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806 10WC</td>
			<td>absorbing blood from surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile non-fenestrated drapes</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9004686</td>
			<td>for sterile surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile opthalmic ointment</td>
			<td>Puralube</td>
			<td>P1490</td>
			<td>ocular lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator &#38; Tubing</td>
			<td>Grass Medical Instruments</td>
			<td>S44</td>
			<td>to provide controlled presurred air for precision solution injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade #10</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>SKU: 10SS</td>
			<td>for skin incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps, Extra fine Graefe</td>
			<td>FST</td>
			<td>11153-10</td>
			<td>to hold skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gloves</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>MSG2280Z</td>
			<td>for asceptic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model M320/ F12</td>
			<td>for 5X-40X magnification of surgical site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 polypropylene</td>
			<td>Oasis</td>
			<td>MV-8661</td>
			<td>to close the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm</td>
			<td>3M</td>
			<td>3M ID 70200749250</td>
			<td>provides sterile barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp and stand post</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1725</td>
			<td>attached to stereotactic U frame and intracellular base plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound hook with hartman hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09, 13003-10</td>
			<td>to separate muscles and provide surgical window</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic surgical approach to microinject the caudal brainstem and upper cervical spinal cord via the cisterna magna in mice

La cirugía estereotáxica para atacar los sitios cerebrales en ratones es comúnmente guiada por puntos de referencia del cráneo. El acceso se obtiene a través de agujeros de rebaba perforados a través del cráneo. Este enfoque estándar puede ser un desafío para los objetivos en el tronco encefálico caudal y la médula cervical superior debido a desafíos anatómicos específicos, ya que estos sitios están alejados de los puntos de referencia del cráneo, lo que lleva a la imprecisión. Aquí describimos un enfoque estereotáxico alternativo a través de la cisterna magna que se ha utilizado para apuntar a regiones discretas de interés en el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. La cisterna magna se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas (es decir, el segundo hueso vertebral), está llena de líquido cefalorraquídeo y está cubierta por duramadre. Este enfoque proporciona una ruta de acceso reproducible a estructuras seleccionadas del sistema nervioso central (SNC) que de otro modo serían difíciles de alcanzar debido a las barreras anatómicas. Además, permite la visualización directa de puntos de referencia del tronco encefálico muy cerca de los sitios objetivo, lo que aumenta la precisión al administrar pequeños volúmenes de inyección a regiones restringidas de interés en el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. Finalmente, este enfoque brinda la oportunidad de evitar el cerebelo, que puede ser importante para los estudios motores y sensoriomotores.

El enfoque cisterna magna permite apuntar a las estructuras del tronco encefálico caudal y del cordón cervical superior que de otro modo serían difíciles de alcanzar a través de enfoques estereotáxicos estándar o que son propensas a una orientación inconsistente. La cirugía para llegar a la cisterna magna requiere incisiones de la piel, una capa delgada de músculo trapecio y la abertura de la duramadre y, por lo tanto, es bien tolerada por los ratones. Es especialmente eficiente y menos invasivo cuando...

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Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

La cirugía estereotáxica para atacar los sitios cerebrales en ratones comúnmente implica el acceso a través de los huesos del cráneo y es guiada por puntos de referencia del cráneo. Aquí describimos un enfoque estereotáxico alternativo para apuntar al tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la cisterna magna que se basa en la visualización directa de los puntos de referencia del tronco encefálico.

Abordaje quirúrgico estereotáxico para microinyectar el tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la Cisterna Magna en ratones

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. ...

Este protocolo proporciona pautas paso a paso para una ruta reproducible de acceso a regiones de interés en el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. Esta técnica aumenta la precisión cuando se administran pequeños volúmenes de inyección a regiones restringidas de interés en el tronco encefálico caudal y la médula cervical superior. Esta técnica ha sido y puede ser aplicada a otros modelos animales.Veronique VanderHorst, profesora asociada de neurología e investigadora principal del Laboratorio VanderHorst, demostrará este procedimiento. Asegúrese de que el flujo de oxígeno se dirija al cono de la nariz. Mueva el ratón al marco estereotáxico y coloque la nariz en un cono nasal flexible.Coloque el ratón en el marco estereotáxico utilizando únicamente las barras para los oídos. Coloque lubricante en los ojos. Anteroflex la cabeza del ratón a un ángulo de 90 grados guiando manualmente la nariz.Para asegurar esta posición, coloque una barrera de plástico entre los pilares de la barra auditiva del adaptador del mouse paralelo a los pilares con la parte plana del cráneo que sirve como referencia. Coloque la almohadilla térmica debajo del mouse y asegúrese de que el cuello y el resto del cuerpo estén colocados paralelos a la mesa elevando el cuerpo con una caja pequeña. Coloque una cortina debajo del cuerpo.Inyecte una dosis única de cuatro miligramos por kilogramo Meloxicam de liberación lenta por vía subcutánea a un volumen de dos microlitros por gramo de peso corporal. Limpie el sitio de la incisión quirúrgica primero con una almohadilla de preparación de alcohol al 70%, luego con una almohadilla de preparación de betaína y luego nuevamente con una almohadilla de preparación de alcohol y déjela secar. Desinfecte las manos y póngase guantes estériles, luego coloque una cortina en el sitio quirúrgico.Asegúrese de que el ratón esté anestesiado adecuadamente pellizcando los dedos de los pies o revisando el reflejo corneal. Reducir el isoflurano para mantener los niveles en 2.0. Haga una incisión de uno a 1,2 centímetros con una cuchilla quirúrgica de 10 desde el borde del hueso occipital hacia los hombros en un movimiento suave.Haga cuidadosamente una incisión en el rafe de la línea media del músculo trapecio, exponiendo los músculos pareados de longus capitis. Coloque ambos ganchos retractores entre los músculos de longus capitis emparejados, uno orientado a la izquierda y el otro a la derecha. Use las pinzas de laminectomía roma para separar los vientres izquierdo y derecho del músculo longus capitis emparejado, comenzando desde el occipucio donde la línea media es fácilmente visible.Guíe las pinzas romas a través del hueso del occipucio en la línea media hasta donde se encuentra con la duramadre cisternal y luego continúe a través de la duramadre hasta el atlas. Reposicione los retractores y ajuste la tensión reposicionando los hemostáticos. Use las pinzas de laminectomía roma para separar los músculos más en la línea media para obtener una buena vista del tronco encefálico y el cerebelo.Repita el procedimiento anterior según sea necesario hasta que el cerebelo y el tronco encefálico aparezcan debajo de la duramadre. Usando fórceps de laminectomía contundentes, limpie la duramadre de las pequeñas hebras de tejido conectivo moviendo las pinzas desde la línea media en dirección lateral hasta que haya una vista clara del tronco encefálico, creando más espacio lateral. Vea la superficie dorsal del tronco encefálico con puntos de referencia detallados a través de la duramadre abierta.Use las pinzas en ángulo para agarrar la duramadre que se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas, luego use las tijeras de resorte para hacer una pequeña abertura de aproximadamente 0.5 a 1.5 milímetros en la duramadre. Una vez que se abre la duramadre, drene el exceso de líquido cefalorraquídeo con una punta Q estéril. El obex, el punto donde el canal central se abre en el cuarto ventrículo, es el punto cero estándar anterior-posterior y mediolateral.Coloque la pipeta o jeringa en el objetivo con el brazo estereotáxico. Bajar el brazo de la dorsal sobre la superficie dorsal que se forma a partir del punto cero dorsoventral. Luego baje la pipeta sobre el tronco encefálico e inyecte la solución.Deje la aguja en su lugar durante uno a cinco minutos después de la inyección para evitar una pista de aguja cuando use volúmenes entre tres y 50 nanolitros. Luego levante la pipeta o jeringa con el brazo estereotáxico y repita esto para múltiples objetivos. Retire los ganchos con cuidado del campo quirúrgico.Los músculos pareados del longus capitis volverán a caer en una posición neutral cubriendo completamente la cisterna magna. No cierre el músculo trapecio y la duramadre en la línea media, ya que son demasiado frágiles para sostener las suturas. Cierre la piel con 3 suturas de nylon o polipropileno.El enfoque cisterna magna permite apuntar al tronco encefálico caudal y a las estructuras del cordón cervical superior que de otro modo serían difíciles de alcanzar a través de enfoques estereotáxicos estándar o que son propensas a una orientación inconsistente. En ratones, estructuras como el núcleo hipogloso, el grupo respiratorio ventral y la formación reticular adyacente en el tronco encefálico caudal se han dirigido rutinariamente utilizando el enfoque cisterna magna como se ilustra aquí para el núcleo hipogloso y la médula ventromedial. Para determinar la precisión del enfoque cisterna magna versus el enfoque estándar, se midió la distancia entre los sitios objetivo previstos y reales en los planos anteroposterior, mediolateral y dorsoventral para las regiones ventral y dorsal.Los resultados muestran errores significativamente menores en los planos anteroposterior, mediolateral y dorsoventral en comparación con el enfoque estándar, destacando la mayor precisión del enfoque cisterna magna para estos objetivos. Al intentar este protocolo, es fundamental asegurarse de que la anteroflexión de la cabeza y la elevación del cuerpo se realicen como se describe. A continuación, es importante reconocer los puntos de referencia clave antes de manipular el músculo o la duramadre.Si estos puntos de referencia no se reconocen o si se pierden, será un desafío mantenerse orientado y ejecutar el procedimiento según lo previsto. Esta técnica ayudó a abordar cuestiones conceptuales relacionadas con la organización anatómica funcional dentro del tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Médula Espinal Electrofisiología II: Fabricación de electrodos de aspiración extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Investigación

Neurociencias

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Imágenes de difusión en la médula espinal de rata Cervical

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Implantación de la cánula en la Cisterna Magna de roedores

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Preparación de rítmicamente activa en Vitro Neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

A Revised Surgical Approach to Induce Endolymphatic Hydrops in the Guinea Pig

Un enfoque quirúrgico revisado para inducir hidrops endoifáticos en el cerdo de Guinea

Endolymphatic hydrops is an enlargement of scala media that is most often associated with Meniere&#39;s disease, though the pathophysiologic mechanism(s) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...