Name: modeling neonatal intraventricular hemorrhage through intraventricular injection of hemoglobin
Uploaded: 2022-08-25T12:45:00
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JMS recibió fondos de NIH/NINDS R01 NS110793 y K12 (Programa de Desarrollo de Carrera de Investigación de Neurocirujanos). BAM recibió fondos de NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, Premio al Área Prioritaria de Investigación de Neurociencia de la Universidad de Kentucky y un Premio al Innovador de la Asociación de Hidrocefalia .

NOTA: Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de las instituciones. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.
1. Preparación de soluciones de hemoglobina y LCR
<ol><li>Prepare una solución artificial estéril de LCR (aCSF) agregando 500 μL de la solución de aCSF a un microtubo de 1,5 ml y guárdela en ...

<ol>
	<li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+posthemorrhagic+hydrocephalus+from+prematurity:+Pathophysiology+and+current+treatment+concepts:+A+review.">Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).</li><li>Hasselager, A. B., B&#248;rch, K., Pryds, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+perinatal+care+for+extremely+premature+infants+in+Denmark+from.">Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from.</a> Danish Medical Journal. 63 (1), (1994).</li><li>Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-Based+Use+of+Indomethacin+and+Ibuprofen+in+the+Neonatal+Intensive+Care+Unit.">Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit.</a> Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).</li><li>Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraventricular+Hemorrhage+Clearance+in+Human+Neonatal+Cerebrospinal+Fluid:+Associations+with+Hydrocephalus.">Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus.</a> Stroke. , (2020).</li><li>Strahle, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+CSF+Iron+Pathway+Proteins+in+Posthemorrhagic+Hydrocephalus:+Associations+with+Ventricle+Size+and+Neurodevelopmental+Outcomes.">Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes.</a> Annals of Neurology. 90 (2), (2021).</li><li>Strahle, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hemoglobin+and+Iron+in+hydrocephalus+after+neonatal+intraventricular+hemorrhage.">Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Neurosurgery. 75 (6), (2014).</li><li>Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemoglobin-induced+neuronal+degeneration+in+the+hippocampus+after+neonatal+intraventricular+hemorrhage.">Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Brain Research. 1635, (2016).</li><li>Goulding, D. S., Caleb Vogel, ., Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+inflammation,+white+matter+oxidative+stress,+and+myelin+deficiency+in+a+model+of+neonatal+intraventricular+hemorrhage.">Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).</li><li>Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Hydrocephalus+After+Neonatal+and+Adult+Intraventricular+Hemorrhage.">Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage.</a> Translational Stroke Research. 3, (2012).</li><li>Jinnai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Model+of+Germinal+Matrix+Hemorrhage+in+Preterm+Rat+Pups.">A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).</li><li>Georgiadis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+acute+brain+injuries+and+neurobehavioral+profiles+in+a+rabbit+model+of+germinal+matrix+hemorrhage.">Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage.</a> Stroke. 39 (12), (2008).</li><li>Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posthemorrhagic+ventricular+dilation+in+the+neonate:+Development+and+characterization+of+a+rat+model.">Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).</li><li>Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio, ., R, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+motor+deficit+following+infusion+of+autologous+blood+into+the+periventricular+region+of+neonatal+rats.">Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats.</a> Experimental Neurology. (1), (2006).</li><li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+injury+in+premature+infants:+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances.">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).</li><li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+the+brain+growth+spurt.">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), (1979).</li><li>Craig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Experimental Neurology. 181 (2), (2003).</li><li>Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko, ., H&#252;ppi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+of+cortical+development+and+brain+connectivity+in+human+newborns+and+animal+models.">Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models.</a> Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).</li><li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-brain+barrier.">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314 (1), (2003).</li><li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+required+for+blood&#285;&#8364;&amp;#34;brain+barrier+integrity+during+embryogenesis.">Pericytes are required for blood&#285;&#8364;&amp;#34;brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), (2010).</li><li>Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+preclinical+rodent+model+of+collagenase-induced+germinal+matrix/intraventricular+hemorrhage.">A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage.</a> Brain Research. 1356, (2010).</li><li>Christian, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+hospitalization+of+preterm+infants+with+intraventricular+hemorrhage+and+hydrocephalus+in+the+United+States.">Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).</li></ol>

Este modelo de Hiv que utiliza inyección de hemoglobina permite el estudio de la patología de la Hiv específicamente mediada por la hemoglobina. Para estudios complementarios, la hemoglobina también se puede administrar fácilmente in vitro y no confunde los ensayos bioquímicos para proteínas producidas por microglia / macrófagos que están presentes en la sangre total.
Las principales teorías de IVH-PHH incluyen la obstrucción mecánica de la circulación del LCR, la interru...

La hemorragia intraventricular neonatal se origina en la matriz germinal, un sitio de división celular rápida que se encuentra adyacente a los ventrículos laterales del cerebro en desarrollo. Esta estructura altamente vascular es vulnerable a la inestabilidad hemodinámica relacionada con el nacimiento prematuro. La sangre se libera en los ventrículos laterales en la hemorragia de la matriz germinal (GMH)-FIV cuando los vasos sanguíneos frágiles dentro de la matriz germinal se rompen. En el caso de la Hiv de grado IV, el infarto hemorrágico periventricular también puede contribuir a la liberación de productos sanguíneos dentro del cerebro. 1 La combinación de GMH-IVH puede causar PHH, particularmente después de hemorragia de alto grado (grados III y IV)1. La PHH se puede tratar con la colocación de una derivación ventriculoperitoneal, pero la colocación de la derivación no revierte la lesión cerebral que puede ocurrir por la IVH. Aunque los cuidados intensivos neonatales modernos han reducido las tasas de Hiv2, 3, no existen tratamientos específicos para la lesión cerebral o hidrocefalia causada por la Hiv una vez que ha ocurrido. Una limitación significativa en el desarrollo de tratamientos preventivos para la lesión cerebral inducida por IVH y PHH es la comprensión incompleta de la fisiopatología de la IVH.
Recientemente, se ha demostrado que los niveles tempranos de LCR del producto clave de degradación sanguínea hemoglobina están asociados con el desarrollo posterior de PHH en neonatos con HVI4 de alto grado. Además, los niveles de LCR de proteínas de la vía de manipulación del hierro (hemoglobina, ferritina y bilirrubina) se asocian con el tamaño del ventrículo en la Hiv neonatal. Esto también se demostró en una cohorte multicéntrica de lactantes con PHH prematura, donde los niveles más altos de ferritina en el LCR ventricular se asociaron con un tamaño de ventrículo5 más grande.
En este estudio, desarrollamos un modelo clínicamente relevante de lesión cerebral inducida por IVH e hidrocefalia utilizando inyección de hemoglobina en los ventrículos cerebrales, lo que permite la cuantificación de la lesión cerebral y la PHH y la prueba de nuevas estrategias terapéuticas (Figura 1)6, 7. Este modelo de IVH utiliza cachorros de rata neonatal, que se colocan bajo anestesia general durante la duración del procedimiento. Se realiza una incisión en la línea media en el cuero cabelludo y se utilizan coordenadas derivadas de los puntos de referencia del cráneo, el bregma o lambda, para apuntar a los ventrículos laterales para la inyección. La inyección lenta con una bomba de infusión libera hemoglobina en el ventrículo. Este protocolo es fácil de usar, versátil y puede modelar diferentes componentes de IVH que resultan en PHH.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.3 mL insulin syringe</td>
			<td >BD Microfine + Insulin Syringe</td>
			<td >230-4533</td>
			<td >0.3-0.5 mL synringes will work</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL microtube</td>
			<td >USA Scientific</td>
			<td >1615-5500</td>
			<td>Lot No. K194642H -3 511</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4.7T MRI</td>
			<td >Agilent/Varian</td>
			<td >4.7T/33 cm</td>
			<td>Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 monofilament suture</td>
			<td >ETHICON</td>
			<td >667G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >9.4T MRI</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >BioSpec 94/20</td>
			<td>Used in this protocol without the cryoprobe</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Analytical balance</td>
			<td >CCURIS Instruments</td>
			<td >W3200-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Artificial CSF (aCSF)</td>
			<td >Tocris Bioscience</td>
			<td >3525</td>
			<td>Batch No: 72A</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Betadine</td>
			<td >Purdue Products L.P.</td>
			<td >301005-00</td>
			<td >NDC 67618-150-09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carprofen (injectable)</td>
			<td >Zoetis Inc.&#160;</td>
			<td>PI 4019448</td>
			<td>Rimadyl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Laboratories</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td >Sunbeam</td>
			<td >E12107-819</td>
			<td>UL 612A, Z-1228-001</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemoglobin</td>
			<td >MP Biomedicals</td>
			<td >100714</td>
			<td>LOT NO. SR02321</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane</td>
			<td >Piramal Critical Care</td>
			<td >NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane vaporizer</td>
			<td >VETEQUIP</td>
			<td >911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Light for stereotactic insturment</td>
			<td >Dolan-Jenner industries</td>
			<td >Fiber-Lite MI-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microinjection syringe pump</td>
			<td >World Precision Instruments</td>
			<td >MICRO21</td>
			<td>Serial 184034 T08K</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MRI software</td>
			<td >Bruker BioSpin</td>
			<td >Paravision 360 3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen</td>
			<td >Airgas Healthcare</td>
			<td >UN1072</td>
			<td>LOT NUMBER S1432080XA02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sprague Dawley rats</td>
			<td >Charles River Laboratories</td>
			<td >Strain code: 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereotactic instrument</td>
			<td >KOPF Instuments</td>
			<td >Model 900LS Lazy Susan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile cotton tipped applicator</td>
			<td >Fischerbrand</td>
			<td >23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical blade</td>
			<td >covetrus</td>
			<td >#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Topical triple antibiotic</td>
			<td >Triple Antibiotic Ointment</td>
			<td >NDC 51672-2120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ventricle volume quantification software</td>
			<td >ITK-SNAP</td>
			<td >ITK-SNAP 4.0.0 beta</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling neonatal intraventricular hemorrhage through intraventricular injection of hemoglobin

La hemorragia intraventricular neonatal (Hiv) es una consecuencia común del nacimiento prematuro y conduce a lesión cerebral, hidrocefalia poshemorrágica (HPH) y déficits neurológicos de por vida. Si bien la PHH se puede tratar mediante procedimientos de derivación temporal y permanente del líquido cefalorraquídeo (LCR) (reservorio ventricular y derivación ventriculoperitoneal, respectivamente), no existen estrategias farmacológicas para prevenir o tratar la lesión cerebral inducida por la hemorragia intraventricular y la hidrocefalia. Se necesitan modelos animales para comprender mejor la fisiopatología de la hemorragia intraventricular y probar tratamientos farmacológicos. Si bien existen modelos de Hiv neonatal, aquellos que resultan confiablemente en hidrocefalia a menudo están limitados por la necesidad de inyecciones de gran volumen, lo que puede complicar el modelado de la patología o introducir variabilidad en el fenotipo clínico observado.
Estudios clínicos recientes han implicado a la hemoglobina y la ferritina en causar agrandamiento ventricular después de la hemorragia intraventricular. Aquí, desarrollamos un modelo animal sencillo que imita el fenotipo clínico de PHH utilizando inyecciones intraventriculares de pequeño volumen del producto de degradación sanguínea hemoglobina. Además de inducir de manera confiable el agrandamiento ventricular y la hidrocefalia, este modelo produce lesiones en la sustancia blanca, inflamación e infiltración de células inmunes en regiones periventriculares y de la sustancia blanca. Este artículo describe este método simple y clínicamente relevante para modelar la HPH-IVH en ratas neonatas mediante inyección intraventricular y presenta métodos para cuantificar el tamaño del ventrículo después de la inyección.

El éxito de la inyección se confirmó por medios radiológicos e inmunohistoquímicos. Los animales que se sometieron a inyección de hemoglobina desarrollaron ventriculomegalia aguda moderada cuando se evaluaron mediante resonancia magnética (Figura 2A), con ventrículos laterales significativamente más grandes a las 24 h y 72 h después de la inyección de hemoglobina en comparación con los animales inyectados en LCR (Figura 2B, C). Si bi...

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Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin

Presentamos un modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando crías de rata que imita la patología observada en humanos.

Modelado de hemorragia intraventricular neonatal a través de la inyección intraventricular de hemoglobina

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and ...

Este protocolo es significativo porque desarrollamos un modelo clínicamente relevante de lesión cerebral inducida por hemorragia intraventricular e hidrocefalia, utilizando la inyección de hemoglobina en los ventrículos, lo que permite la posterior cuantificación de los volúmenes de ventrículos en la aplicación, para probar nuevas estrategias terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la patología de la hemorragia intraventricular que está específicamente mediada por la hemoglobina y los productos de degradación sanguínea de la vía del hierro. Esta técnica también es fácil de usar y versátil.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de terapias para la hidrocefalia posthemorrágica, ya que permite una mayor comprensión de la fisiopatología de la hemorragia intraventricular y la valoración de estrategias de tratamiento clínicamente relevantes para la prevención de secuelas neurológicas después de la hemorragia intraventricular. Demostrando el procedimiento estará Sruthi Ramagiri, un post-doc asociado del Laboratorio de Australia. Para comenzar, coloque la rata anestesiada propensa en el aparato estereotáctico con la nariz colocada en el adaptador de anestesia.Luego asegure la cabeza apretando las barras auditivas sin ruptura en el meato auditivo externo. Para limpiar la cabeza, primero toque un aplicador estéril con punta de algodón empapado en Betadine en el centro de la cabeza y muévase hacia afuera para extender el Betadine en círculos. Luego repita el proceso con un aplicador empapado en etanol al 70%.A continuación, usando un bisturí, haga una incisión de 0,3 centímetros verticalmente por el centro de la cabeza para exponer el bregma del cráneo. Luego seque el área con un aplicador con punta de algodón. Para configurar el inyector estereotáctico, extraiga la solución de hemoglobina previamente preparada en una jeringa de 0,3 o 0,5 mililitros, y coloque la jeringa en el sistema de inyección estereotáctica.A continuación, encienda la interfaz del inyector estereotáctico y haga clic en el botón de configuración para ingresar el volumen de inyección y la configuración de la velocidad. Haga clic en volumen y establezca el volumen en 20, 000 nanolitros. Luego haga clic en la velocidad de infusión y establezca la velocidad en 8, 000 nanolitros por minuto.Haga clic en el botón de restablecimiento de posición para salir de la configuración. Enjuague la punta de la aguja haciendo clic en el botón de infusión hasta que aparezca una pequeña gota de hemoglobina en la punta de la aguja, luego use un aplicador con punta de algodón para quitar suavemente la cuenta. Para comenzar la inyección en el animal, establezca el bregma como cero en el sistema de inyección estereotáctica ajustando las posiciones mediolateral y anteroposterior de la jeringa.Luego baje la aguja de la jeringa para tocar suavemente el cráneo en el bregma. Después de identificar las coordenadas de elección, levante la aguja de la jeringa un centímetro por encima del cráneo para despejar el cuero cabelludo. Establezca las coordenadas mediolateral y anteroposterior.Luego baje la jeringa para que la aguja toque suavemente el cráneo y establezca la coordenada dorsoventral durante 30 segundos. Una vez que se hayan establecido las coordenadas, comience la inyección haciendo clic en el botón de ejecución en la interfaz del inyector estereotáctico. Una vez finalizada la inyección, deje la aguja en su lugar durante dos minutos para minimizar el reflujo de la solución.A continuación, retire lentamente la jeringa a lo largo de la coordenada dorsoventral durante dos minutos, hasta que la punta de la aguja esté dos centímetros por encima del cuero cabelludo. Luego gire el brazo inyector estereotáctico lejos del campo operatorio y cierre el cuero cabelludo con una sutura de monofilamento 6-O. Para la resonancia magnética, realice imágenes ponderadas en T2 seleccionando una secuencia de eco de giro rápido ponderada en T2.Después de configurar los parámetros de resonancia magnética como se describe en el texto, haga clic en el botón continuar para iniciar la secuencia. Para el procesamiento de imágenes y el análisis del volumen cerebral, abra los datos ponderados T2 nativos en el software de segmentación. Para delinear manualmente los ventrículos laterales, haga clic en el modo de pincel y seleccione el estilo de pincel cuadrado, luego ajuste el tamaño del pincel a uno.A continuación, haga clic en el inspector de diseño, seleccione la vista axial y haga clic en zoom para ajustar. Luego coloque el cursor sobre la imagen y trace y llene el espacio del ventrículo lateral. Finalmente, haga clic en segmentación en la barra de herramientas, seguido de volumen y estadísticas para ver los volúmenes segmentados.Los animales que se sometieron a inyección de hemoglobina desarrollaron ventriculomegalia moderada cuando se evaluaron mediante resonancia magnética. Con ventrículos laterales significativamente más grandes a las 24 horas y 72 horas después de la inyección de hemoglobina, en comparación con los animales inyectados con ACSF. Aunque la diferencia en el volumen ventricular lateral entre los dos grupos de ratas no fue significativa después de 38 días, las imágenes por resonancia magnética demostraron que el 44% de las ratas que recibieron hemoglobina todavía tenían ventriculomegalia no resuelta.Además, en comparación con ACSF, la inyección de hemoglobina resultó en una disminución significativa en el volumen de sustancia blanca después de 38 días. La hemoglobina también promovió una respuesta inflamatoria in vivo, como lo demuestra el nivel significativamente más alto del factor de necrosis tumoral alfa de citoquinas proinflamatorias después de inyectar hemoglobina, pero no solución salina o sangre entera. Además, la tinción inmunohistoquímica de la proteína ácida fibrilar glial reveló una activación significativamente mayor de los astrocitos después de la inyección de hemoglobina que después de la inyección de ACSF.Lo más importante que debe recordar al intentar este procedimiento es establecer las coordenadas de inyección correctas para garantizar el suministro de hemoglobina en los ventrículos laterales. Después de este procedimiento, los trazadores del LCR se pueden administrar en el espacio del LCR para evaluar los cambios en la circulación del LCR y los patrones de eflujo después de la Hiv. Este método adicional aborda cómo se altera el flujo de LCR en la HPH IVH.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

Inyección de sangre autóloga al modelo hemorragia intracerebral espontánea en ratones

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Investigación

Neurociencias

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

La electroporación neonatal zona subventricular

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Entrega intraventricular directa de medicamentos al roedor Sistema Nervioso Central

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Neonatal Pial Surface Electroporation

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Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Intracerebroventricular y por inyección intravascular de partículas víricas y fluorescentes microperlas en el cerebro neonatal

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el Virus Zika utilizando estrategias de inyección Intracerebral: embrionario, Neonatal y adulto

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Un método volumétrico para la cuantificación de vasoespasmo Cerebral en un modelo murino de hemorragia subaracnoidea

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Minimally Invasive Endoscopic Intracerebral Hemorrhage Evacuation

Evacuación endoscópica mínimamente invasiva de hemorragia intracerebral

Intracerebral hemorrhage (ICH) is a subtype of stroke with high mortality and poor functional outcomes, largely because there are no evidence-based ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Doble inyección directa de sangre en la Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnoidea

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...