Name: quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

وقد دعمت اللجنة الأولمبية السويدية هذا العمل.

تمت الموافقة على البروتوكول الحالي باستخدام عينات العضلات الهيكلية البشرية الخزعة من قبل اللجان الإقليمية المعنية بأخلاقيات البحوث الصحية لجنوب الدنمارك (S-20170198). تم الحصول على خزعات العضلات من خلال شق في الجلد من العضلة الجانبية الواسعة باستخدام إبرة Bergström مع الشفط بعد إعطاء التخد?...

<ol>
	<li>Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+life+of+the+glycogen+granule.">The dynamic life of the glycogen granule.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).</li><li>Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+glycogen+depletion+pattern+in+human+muscle+fibres+after+exercise+of+varying+intensity+and+at+varying+pedalling+rates.">Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates.</a> Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).</li><li>James, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+both+aerobic+glycolysis+and+Na+-K+-ATPase+activity+in+skeletal+muscle+by+epinephrine+or+amylin.">Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).</li><li>Jensen, R., Nielsen, J., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+glycogenolysis+prolongs+action+potential+repriming+period+and+impairs+muscle+function+in+rat+skeletal+muscle.">Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle.</a> Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).</li><li>Green, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+important+is+endogenous+muscle+glycogen+to+fatigue+in+prolonged+exercise.">How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).</li><li>Fitts, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+muscle+fatigue.">Cellular mechanisms of muscle fatigue.</a> Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).</li><li>Wanson, J. C., Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+glycogen+metabolism.">Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism.</a> Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).</li><li>Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+the+human+brachial+biceps+muscle.">Fiber types in the human brachial biceps muscle.</a> Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).</li><li>Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+glycogen.+Electron+microscopic+study+of+the+negative+stains+of+particulate+glycogen.">Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li><li>Thiery, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+polysaccharides+on+thin+sections+by+electron+microscopy.">Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).</li><li>De Bruijn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen,+its+chemistry+and+morphologic+appearance+in+the+electron+microscope.+I.+A+modified+OsO4+fixative+which+selectively+contrasts+glycogen.">Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen.</a> Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).</li><li>Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+accumulation+in+polymorphonuclear+leukocytes,+and+other+intracellular+alterations+that+occur+during+inflammation.">Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation.</a> The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).</li><li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes+-+the+organelles+of+glycogen+metabolism.">Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li><li>Gadisseux, J. F., Evrard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-neuronal+relationship+in+the+developing+central+nervous+system.+A+histochemical-electron+microscope+study+of+radial+glial+cell+particulate+glycogen+in+normal+and+reeler+mice+and+the+human+fetus.">Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus.</a> Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).</li><li>Frid&#233;n, J., Seger, J., Ekblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+periodic+acid-thiosemicarbazide-silver+proteinate+staining+for+ultrastructural+assessment+of+muscle+glycogen+utilization+during+exercise.">Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise.</a> Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+subcellular+glycogen+in+resting+human+muscle:+granule+size,+number,+and+location.">Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location.</a> Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+muscle+glycogen+granules+size+and+number+in+subcellular+locations+during+recovery+from+prolonged+exercise.">Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise.</a> Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).</li><li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Glycogenolysis+Modulates+Histone+Acetylation+in+Human+Non-Small+Cell+Lung+Cancers.">Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).</li><li>Jensen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+subcellular+muscle+glycogen+utilisation+during+exercise+impacts+endurance+capacity+in+men.">Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men.</a> Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).</li><li>Nielsen, J., Schr&#248;der, H. D., Rix, C. G., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+subcellular+glycogen+localization+on+tetanic+relaxation+time+and+endurance+in+mechanically+skinned+rat+skeletal+muscle+fibres.">Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).</li><li>Nielsen, J., Cheng, A. J., &#216;rtenblad, N., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+glycogen+and+decreased+tetanic+Ca2++in+fatigued+single+intact+mouse+muscle+fibres.">Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).</li><li>Mead, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+constraints+in+synchronous+muscle+limit+superfast+motor+control+in+vertebrates.">Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates.</a> eLife. 6, 29425 (2017).</li><li>Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., &#216;rtenblad, N., B&#248;tker, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+subcellular+glycogen+distribution+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling:+effects+of+ischaemia,+reperfusion+and+ischaemic+preconditioning.">Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning.</a> Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).</li><li>Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schr&#248;der, H. D., Saltin, B., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+glycogen+utilization+in+exhaustive+exercise:+role+of+subcellular+localization+and+fibre+type.">Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type.</a> Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).</li><li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new,+simple+and+efficient+stereological+methods+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).</li><li>Saltin, B., Gollnick, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+adaptability:+significance+for+metabolism+and+performance.">Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance.</a> Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).</li><li>Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-dependent+decrements+in+skeletal+muscle+glycogen+and+mitochondria+content+following+short-term+disuse+in+young+and+old+men.">Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).</li><li>Hokken, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-+and+fibre+type-dependent+utilization+of+muscle+glycogen+during+heavy+resistance+exercise+in+elite+power+and+Olympic+weightlifters.">Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters.</a> Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).</li><li>Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glycogen+storage+of+a+subcellular+hot+spot+in+human+skeletal+muscle+during+early+recovery+from+eccentric+contractions.">Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions.</a> PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).</li><li>Sj&#246;str&#246;m, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analyses+of+human+muscle+fiber+types.">Morphometric analyses of human muscle fiber types.</a> Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).</li><li>Gejl, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+depletion+of+glycogen+with+supramaximal+exercise+in+human+skeletal+muscle+fibres.">Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).</li><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li></ol>

الخطوة الحاسمة لهذه الطريقة هي استخدام الأوزميوم المنخفض بواسطة فيروسيانيد البوتاسيوم أثناء التثبيت التالي. لا يمكن تفسير انتقائية هذا المثبت المعدل للكشف عن الجليكوجين بشكل كامل من خلال الكيمياء، ولكنه يشمل أيضا النتائج التجريبية التي تظهر عدم اكتشاف مثل هذه الجسيمات في الأنسجة المعر...

تتكون جزيئات الجليكوجين من بوليمرات متفرعة من الجلوكوز ومختلف البروتينات المرتبطة بها1 وتشكل وقودا مهما خلال المتطلبات الأيضية العالية2. على الرغم من عدم الاعتراف بها على نطاق واسع، إلا أن جزيئات الجليكوجين تشكل أيضا وقودا محليا، حيث تستخدم بعض العمليات دون الخلوية الجليكوجين بشكل تفضيلي على الرغم من توافر أنواع وقود أخرى طويلة الأمد مثل جلوكوز البلازما والأحماض الدهنية3,4.
نوقشت أهمية تخزين الجليكوجين كوقود موضعي محدد تحت الخلية في العديد من المراجعات5,6 استنادا أساسا إلى بعض الوثائق المبكرة للتوزيع تحت الخلوي للجليكوجين عن طريق المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)7,8. استخدمت الدراسات الأولى بروتوكولات مختلفة لزيادة تباين الجليكوجين من تقنيات التلطيخ الكيميائي النسيجي إلى البقع السلبية والإيجابية9,10. كان التطور المنهجي المهم هو بروتوكول ما بعد التثبيت المكرر مع الأوزميوم المخفض بفيروسيانيد البوتاسيوم 11،12،13،14 ، مما أدى إلى تحسين كبير في تباين جزيئات الجليكوجين. لم يستخدم هذا البروتوكول المكرر في بعض الأعمال الرائدة حول استنفاد الجليكوجين الناجم عن التمرين15 ولكن أعيد تقديمه من قبل غراهام وزملاؤه16،17.
استنادا إلى الصور ذات الأبعاد 2 ، غالبا ما يوصف التوزيع تحت الخلوي للجليكوجين بأنه جزيئات جليكوجين تقع في ثلاثة تجمعات: تحت القصبة (تحت الغشاء السطحي مباشرة) ، intermyofibrillar (بين myofibrils) ، أو intramyofibrillar (داخل myofibrils). ومع ذلك، يمكن أيضا وصف جزيئات الجليكوجين بأنها مرتبطة مثلا بالشبكة الساركوبلازمية7 أو النوى18. بالإضافة إلى التوزيع تحت الخلوي ، فإن ميزة محتوى الجليكوجين المقدر من TEM هي أيضا أنه يمكن إجراء القياس الكمي على مستوى الألياف المفردة. وهذا يسمح بالتحقيق في التباين من الألياف إلى الألياف والتحليلات المرتبطة بأنواع الألياف والمكونات الخلوية مثل الميتوكوندريا وقطرات الدهون.
هنا ، يتم وصف بروتوكول المحتوى الحجمي الخاص بنوع الألياف المقدر من TEM للمجمعات تحت الخلوية الثلاثة الشائعة من الجليكوجين (تحت الساركوليمال ، intermyofibrillar ، و intramyofibrillar) في ألياف العضلات الهيكلية. تم تطبيق هذه الطريقة على عضلات الهيكل العظمي من البشر19 والجرذان20 والفئران21. وكذلك الطيور والأسماك22 ؛ والخلايا العضلية القلبية من الفئران23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Propylene oxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-56-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding 812 resin medium kit</td>
			<td>Taab</td>
			<td>T031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04239.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITEM</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM AC20</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Automatic contrasting system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSIS Veleta digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>0972A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM 100 Transmission EM</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455989-245G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4</td>
			<td>Ampliqon.com</td>
			<td>AMPQ40989.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-microtome Leica UC7</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>6159-44-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy

باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل ، يمكن الحصول على صور عالية الدقة لعينات ثابتة تحتوي على ألياف عضلية فردية. وهذا يتيح تحديد كميات الجوانب فوق الهيكلية مثل كسور الحجم ، ونسب المساحة السطحية إلى الحجم ، و morphometry ، ومواقع الاتصال المادي للهياكل تحت الخلوية المختلفة. في 1970s ، تم تطوير بروتوكول لتعزيز تلطيخ الجليكوجين في الخلايا ومهد الطريق لسلسلة من الدراسات حول التوطين تحت الخلوي لحجم جسيمات الجليكوجين والجليكوجين باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل. في حين أن معظم التحليلات تفسر الجليكوجين كما لو كان موزعا بشكل متجانس داخل ألياف العضلات ، مما يوفر قيمة واحدة فقط (على سبيل المثال ، متوسط التركيز) ، فقد كشف المجهر الإلكتروني الناقل أن الجليكوجين يتم تخزينه كجزيئات جليكوجين منفصلة تقع في مقصورات دون خلوية متميزة. هنا ، يتم وصف البروتوكول خطوة بخطوة من جمع الأنسجة إلى التحديد الكمي للجزء الحجمي وقطر الجسيمات من الجليكوجين في المقصورات تحت الخلوية المميزة لألياف العضلات الهيكلية الفردية. اعتبارات حول كيفية 1) جمع عينات الأنسجة ووصمها ، 2) إجراء تحليلات الصور ومعالجة البيانات ، 3) تقييم دقة التقديرات ، 4) التمييز بين أنواع الألياف العضلية ، و 5) يتم تضمين المزالق والقيود المنهجية.

باستخدام هذا البروتوكول ، تظهر جزيئات الجليكوجين سوداء ومتميزة (الشكل 1 والشكل 2). يتم توضيح القيم الطبيعية للجليكوجين في الشكل 3. تستند هذه البيانات إلى ما مجموعه 362 من الألياف من 41 شابا سليما كما تم جمعها في دراسات سابقة مختلفة19...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

يزيد إجراء ما بعد التثبيت المعدل من تباين جزيئات الجليكوجين في الأنسجة. توفر هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة يصف كيفية التعامل مع الأنسجة وإجراء التصوير واستخدام الأساليب المجسمة للحصول على بيانات كمية وغير متحيزة حول توزيع الجليكوجين تحت الخلوي الخاص بنوع الألياف في العضلات الهيكلية.

القياس الكمي لتوزيع الجليكوجين تحت الخلوي في ألياف العضلات الهيكلية باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

يعد قياس محتوى الجليكوجين في الخلايا المفردة والمنظمات دون الخلوية أمرا مهما لأنه في معظم أنواع الخلايا ، تتكيف الخلايا المفردة بشكل مختلف مع الظروف والأمراض الفسيولوجية المتغيرة. لذا ، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الدقة العالية جدا في المجهر الإلكتروني الناقل. هذا يحسن من إمكانية وجود هياكل تحت خلوية موضعية وأيضا في هذا المحتوى في هذه التقنية هنا ، من المهم أن يكون تلطيخ الجليكوجين خاليا من الأجسام المضادة.لذلك ، ليس لدينا أي خصوصية تدعو للقلق. من أجل الحصول على تباين أفضل على الجليكوجين ، ما عليك سوى استخدام فيروسيانيد البوتاسيوم بنسبة 1.5٪ بدلا من فيروسيانيد البوتاسيوم. تحضير 1.6 ملليلتر من المحلول المثبت الأساسي عن طريق إضافة 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.1 مول الصوديوم كاكوديلات المخزن المؤقت في أنبوب تركيز دقيق 2 ملليلتر.قم بتخزينه في خمس درجات مئوية لمدة أقصاها 14 يوما. عزل عينة صغيرة من خزعة العضلات أو العضلة بأكملها التي يبلغ قطرها الأقصى ملليمترا واحدا في أي اتجاه وهي أطول طوليا من المقطع العرضي. ضع العينة في الأنبوب الذي يحتوي على محلول التثبيت الأولي البارد.تخزينها في خمس درجات مئوية لمدة 24 ساعة. ثم اغسل العينة أربع مرات في 0.1 مخزن مؤقت كاكوديليات الصوديوم المولي. باستخدام ماصات النقل ، قم بإزالة المخزن المؤقت المستخدم من الأنبوب تاركا العينة دون أن تمسها وأضف المخزن المؤقت الطازج.بعد إصلاح العينة مع 1٪ من رابع أكسيد الأوزميوم و 1.5٪ من فيروسيانيد البوتاسيوم في 0.1 مخزن مؤقت كاكوديليت الصوديوم المولي لمدة 120 دقيقة عند أربع درجات مئوية. شطف العينة مرتين في الماء المقطر المزدوج في درجة حرارة الغرفة. الجفاف عن طريق الغمر في سلسلة متدرجة من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة.تسلل إلى العينة مع أكسيد البروبيلين ومخاليط الراتنج الإيبوسيدي المتدرج في درجة حرارة الغرفة باستخدام نسب الحجم المذكورة. في اليوم التالي ، قم بتضمين العينات في راتنج epossidic طازج بنسبة 100٪ في قوالب وبلمرة عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. قم بتركيب كتلة عينة على حامل ultramicrotome.قم بتقليم الكتلة على السطح باستخدام شفرة حلاقة للوصول إلى مستوى الأنسجة. قم بتركيب سكين الماس أمام العينة ومحاذاة سطح العينة بالتوازي مع السكين. قم بإنتاج قسم شبه رقيق بسماكة ميكرومتر واحد باستخدام سكين الماس للتحقق من اتجاه العينة.قم بتلطيخ القسم شبه الرقيق باللون الأزرق تولويدين للمراقبة باستخدام المجهر الضوئي. ثم قم بتقليم الكتلة أكثر لتقليل مساحة الاهتمام للحصول على أقسام رقيقة للغاية مناسبة. قطع 60 إلى 70 نانومتر سماكة أقسام رقيقة جدا بسكين الماس الثاني.اجمع قسما إلى قسمين على شبكة نحاسية كاملة باستخدام حلقة مثالية. لمقارنة الأقسام ، اغمر الشبكات في محلول أسيتات اليورانيل لمدة 20 دقيقة واغسل الشبكات في ماء مقطر مزدوج ثم اغمر الشبكات في سترات الرصاص لمدة 15 دقيقة وأعد غسل الشبكات في ماء مقطر مزدوج. قم بتشغيل كمبيوتر المجهر الإلكتروني الناقل وبرنامج تسجيل الصور ، وسجل الصور الرقمية باستخدام كاميرا CCD الرقمية للمسح البطيء وبرنامج التصوير المرتبط بها.بعد إدخال الشبكة بأقسام متعددة في مرحلة المجهر ، قم بفحص الشبكة في البداية عند تكبير منخفض لاختيار أفضل الأقسام جودة وتحديد اتجاه ألياف العضلات. التركيز البؤري التالي ، الصورة عند التكبير فوق 30،000 مع تركيز الشعاع على ألياف طرفية في القسم وتسجيل الصور مع وقت التعرض ثانية واحدة في التكبير المطلوب. تأكد من توزيع الصور عبر طول وعرض الألياف في ترتيب منهجي عشوائي للحصول على نتائج غير متحيزة وتكرار التصوير حتى يتم تصوير ستة إلى 10 ألياف.استيراد الصور إلى الصورة J عن طريق النقر على ملف متبوعا بفتح. قم بتعيين مقياس عمومي لمطابقة الحجم الأصلي للصورة من خلال النقر فوق تحليل ثم تعيين مقياس. للتكبير بنسبة 100٪ ، انقر فوق الصورة ، وانتقل إلى التكبير وانقر على.قم بقياس سمك قرص Z واحد لكل صورة لمساحة myofibrillar باستخدام أداة الخط المستقيم من قائمة الأدوات واحسب متوسط سمك قرص Z لكل من الألياف الستة إلى 10. استخدم أداة الخط المجزأ لقياس طول myofibril الخارجي المرئي أسفل المنطقة تحت الساركوليمال مباشرة. لإدراج شبكة، انقر فوق تحليل، وحدد أدوات، ثم حدد شبكة.الآن اضبط المساحة لكل نقطة على 32،400 نانومتر مربع. احسب عدد الزيارات ضمن الطول المتاح في 12 صورة تحت الساركوليمال حيث يضرب الصليب الجليكوجين تحت الساركوليمال. أدخل شبكة بالنقر فوق تحليل، ثم حدد أدوات، متبوعة بشبكة وحدد المساحة لكل نقطة عند 160،000 نانومتر مربع.احسب عدد الزيارات في صور myofibrillar 12th حيث يضرب الصليب الفضاء داخل myofibrillar. ثم مرة أخرى ، لإدراج شبكة ، انقر فوق تحليل ، وحدد الأدوات ثم حدد الشبكة. الآن اضبط المساحة لكل نقطة على 3،600 نانومتر مربع.عد عدد الزيارات في الصور 12th myofibrillar حيث يضرب الصليب الجليكوجين داخل myofibrillar. أدخل شبكة بالنقر فوق تحليل، ثم حدد الأدوات، متبوعا بالشبكة وحدد المساحة لكل نقطة عند 32،400 نانومتر مربع. عد عدد الزيارات في الصور ال 12 myofibrillar حيث يضرب الصليب الجليكوجين intermyofibrillar.باستخدام شبكة 32،400 نانومتر مربع لاختيار جزيئات الجليكوجين عشوائيا ، ابدأ بالمربع العلوي الأيسر وانتقل إلى اليسار إذا لزم الأمر. باستخدام أداة الخط المستقيم ، قم بقياس قطر خمسة جزيئات جليكوجين مختارة عشوائيا لكل تجمع لكل صورة من الصور ال 12 للحصول على متوسط 60 جسيما لكل تجمع لكل ألياف. يوضح هذا الشكل القيم الطبيعية لبرك الجليكوجين الثلاثة.يمكن ملاحظة أن قيم الجليكوجين intermyofibrillar موزعة بالقرب من المعدل الطبيعي ، في حين أن كلا من الجليكوجين داخل myofibrillar و subsarcolemmal يظهر توزيعا منحرفا حيث تحتوي الألياف في بعض الأحيان على كمية زائدة من الجليكوجين. من بين جميع الخطوات ، من المهم جدا استخدام فيروسيانيد البوتاسيوم. يمكن الجمع بين تحليل الجليكوجين وتحليل الميتوكوندريون وقطرات الدهون التي يمكن أن تحسن فهمنا لكيفية ارتباط المكونات الأيضية الرئيسية الأخرى مع الجليكوجين وصحة العضلات.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

تحسين بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين من الماوس الهيكل العظمى والعضلات

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

إعداد عينات من أفلام الدعم في المجهر الإلكترون الإرسال باستخدام كتلة دعم التعويم

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

شبكات المجهر الإلكتروني للإرسال بالنمط المجهري لتحديد مواقع الخلايا مباشرة ضمن سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون للخلية الكاملة

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

قياس قدرة استيراد البروتين للميتوكوندريا العضلية الهيكلية

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

تحديد توزيع طول سلسلة الجلوكان للجليكوجين باستخدام طريقة الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

القياس الكمي عالي الإنتاجية القائم على الصور لتخليق وتوزيع الحمض النووي للميتوكوندريا

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...