Name: quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den svenske olympiske komité.

Nærværende protokol med humane biopsierede skeletmuskelprøver er godkendt af Regionernes Sundhedsavistiske Komitéer for Syddanmark (S-20170198). Muskelbiopsier blev opnået gennem et snit i huden fra vastus lateralis-musklen ved hjælp af en Bergström-nål med sugning, efter at lokalbedøvelse blev givet subkutant (1-3 ml lidokain 2% pr. Snit). Hvis der blev anvendt isolerede hele rottemuskler, blev dyrene ofret ved cervikal forskydning, inden muskelbiopsierne blev opnået, i overensstemmelse med retningsli...

<ol>
	<li>Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+life+of+the+glycogen+granule.">The dynamic life of the glycogen granule.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).</li><li>Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+glycogen+depletion+pattern+in+human+muscle+fibres+after+exercise+of+varying+intensity+and+at+varying+pedalling+rates.">Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates.</a> Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).</li><li>James, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+both+aerobic+glycolysis+and+Na+-K+-ATPase+activity+in+skeletal+muscle+by+epinephrine+or+amylin.">Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).</li><li>Jensen, R., Nielsen, J., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+glycogenolysis+prolongs+action+potential+repriming+period+and+impairs+muscle+function+in+rat+skeletal+muscle.">Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle.</a> Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).</li><li>Green, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+important+is+endogenous+muscle+glycogen+to+fatigue+in+prolonged+exercise.">How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).</li><li>Fitts, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+muscle+fatigue.">Cellular mechanisms of muscle fatigue.</a> Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).</li><li>Wanson, J. C., Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+glycogen+metabolism.">Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism.</a> Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).</li><li>Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+the+human+brachial+biceps+muscle.">Fiber types in the human brachial biceps muscle.</a> Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).</li><li>Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+glycogen.+Electron+microscopic+study+of+the+negative+stains+of+particulate+glycogen.">Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li><li>Thiery, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+polysaccharides+on+thin+sections+by+electron+microscopy.">Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).</li><li>De Bruijn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen,+its+chemistry+and+morphologic+appearance+in+the+electron+microscope.+I.+A+modified+OsO4+fixative+which+selectively+contrasts+glycogen.">Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen.</a> Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).</li><li>Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+accumulation+in+polymorphonuclear+leukocytes,+and+other+intracellular+alterations+that+occur+during+inflammation.">Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation.</a> The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).</li><li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes+-+the+organelles+of+glycogen+metabolism.">Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li><li>Gadisseux, J. F., Evrard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-neuronal+relationship+in+the+developing+central+nervous+system.+A+histochemical-electron+microscope+study+of+radial+glial+cell+particulate+glycogen+in+normal+and+reeler+mice+and+the+human+fetus.">Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus.</a> Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).</li><li>Frid&#233;n, J., Seger, J., Ekblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+periodic+acid-thiosemicarbazide-silver+proteinate+staining+for+ultrastructural+assessment+of+muscle+glycogen+utilization+during+exercise.">Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise.</a> Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+subcellular+glycogen+in+resting+human+muscle:+granule+size,+number,+and+location.">Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location.</a> Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+muscle+glycogen+granules+size+and+number+in+subcellular+locations+during+recovery+from+prolonged+exercise.">Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise.</a> Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).</li><li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Glycogenolysis+Modulates+Histone+Acetylation+in+Human+Non-Small+Cell+Lung+Cancers.">Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).</li><li>Jensen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+subcellular+muscle+glycogen+utilisation+during+exercise+impacts+endurance+capacity+in+men.">Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men.</a> Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).</li><li>Nielsen, J., Schr&#248;der, H. D., Rix, C. G., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+subcellular+glycogen+localization+on+tetanic+relaxation+time+and+endurance+in+mechanically+skinned+rat+skeletal+muscle+fibres.">Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).</li><li>Nielsen, J., Cheng, A. J., &#216;rtenblad, N., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+glycogen+and+decreased+tetanic+Ca2++in+fatigued+single+intact+mouse+muscle+fibres.">Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).</li><li>Mead, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+constraints+in+synchronous+muscle+limit+superfast+motor+control+in+vertebrates.">Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates.</a> eLife. 6, 29425 (2017).</li><li>Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., &#216;rtenblad, N., B&#248;tker, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+subcellular+glycogen+distribution+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling:+effects+of+ischaemia,+reperfusion+and+ischaemic+preconditioning.">Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning.</a> Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).</li><li>Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schr&#248;der, H. D., Saltin, B., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+glycogen+utilization+in+exhaustive+exercise:+role+of+subcellular+localization+and+fibre+type.">Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type.</a> Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).</li><li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new,+simple+and+efficient+stereological+methods+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).</li><li>Saltin, B., Gollnick, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+adaptability:+significance+for+metabolism+and+performance.">Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance.</a> Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).</li><li>Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-dependent+decrements+in+skeletal+muscle+glycogen+and+mitochondria+content+following+short-term+disuse+in+young+and+old+men.">Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).</li><li>Hokken, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-+and+fibre+type-dependent+utilization+of+muscle+glycogen+during+heavy+resistance+exercise+in+elite+power+and+Olympic+weightlifters.">Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters.</a> Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).</li><li>Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glycogen+storage+of+a+subcellular+hot+spot+in+human+skeletal+muscle+during+early+recovery+from+eccentric+contractions.">Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions.</a> PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).</li><li>Sj&#246;str&#246;m, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analyses+of+human+muscle+fiber+types.">Morphometric analyses of human muscle fiber types.</a> Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).</li><li>Gejl, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+depletion+of+glycogen+with+supramaximal+exercise+in+human+skeletal+muscle+fibres.">Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).</li><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li></ol>

Det kritiske trin i metoden er anvendelsen af reduceret osmium med kaliumferrocyanid under postfiksering. Selektiviteten af dette modificerede fikseringsmiddel til glykogendetektion kan ikke forklares fuldt ud af kemi, men omfatter også eksperimentelle fund, der ikke viser nogen påvisning af sådanne partikler i væv, der vides at være fri for glykogen eller i det ekstracellulære rum11.
Kritiske parametre er præcisionen af estimaterne og fiber-til-fiber-variationen...

Glykogenpartikler består af forgrenede polymerer af glucose og forskellige associerede proteiner1 og udgør et vigtigt brændstof under høje metaboliske krav2. Selvom de ikke er bredt anerkendt, udgør glykogenpartikler også et lokalt brændstof, hvor nogle subcellulære processer fortrinsvis bruger glykogen på trods af tilgængeligheden af andre og mere langvarige brændstoffer som plasmaglukose og fedtsyrer3,4.
Betydningen af at lagre glykogen som et subcellulært specifikt lokaliseret brændstof er blevet diskuteret i flere anmeldelser5,6 hovedsageligt baseret på nogle af de tidligste dokumentationer af den subcellulære fordeling af glykogen ved transmissionselektronmikroskopi (TEM)7,8. De første undersøgelser brugte forskellige protokoller til at øge glykogens kontrast fra histokemiske farvningsteknikker til negative og positive farvninger9,10. En vigtig metodologisk udvikling var den raffinerede postfikseringsprotokol med det kaliumferrocyanidrerede osmium11,12,13,14, hvilket signifikant forbedrede kontrasten mellem glykogenpartikler. Denne raffinerede protokol blev ikke brugt i noget af det banebrydende arbejde med træningsinduceret glykogenudtømning15, men blev genindført af Graham og kolleger16,17.
Baseret på de 2-dimensionelle billeder beskrives den subcellulære fordeling af glykogen oftest som glykogenpartikler placeret i tre puljer: subsarcolemmal (lige under overflademembranen), intermyofibrillær (mellem myofibrillerne) eller intramyofibrillær (inden for myofibrillerne). Glykogenpartikler kan dog også beskrives som associeret med for eksempel sarkoplasmatiske retikulum7 eller kerner18. Ud over den subcellulære fordeling er fordelen ved TEM-estimeret glykogenindhold også, at kvantificering kan udføres på enkeltfiberniveau. Dette muliggør undersøgelse af fiber-til-fiber variabilitet og korrelative analyser med fibertyper og cellulære komponenter som mitokondrier og lipiddråber.
Her beskrives protokollen for det TEM-estimerede fibertypespecifikke volumetriske indhold af de tre almindelige subcellulære puljer af glykogen (subsarcolemmal, intermyofibrillar og intramyofibrillar) i skeletmuskelfibre. Metoden er blevet anvendt på skeletmuskler fra mennesker19, rotter20 og mus21; samt fugle og fisk22; og kardiomyocytter fra rotter23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Propylene oxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-56-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding 812 resin medium kit</td>
			<td>Taab</td>
			<td>T031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04239.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITEM</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM AC20</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Automatic contrasting system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSIS Veleta digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>0972A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM 100 Transmission EM</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455989-245G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4</td>
			<td>Ampliqon.com</td>
			<td>AMPQ40989.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-microtome Leica UC7</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>6159-44-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy

Ved brug af transmissionselektronmikroskopi kan der opnås billeder i høj opløsning af faste prøver indeholdende individuelle muskelfibre. Dette muliggør kvantificeringer af ultrastrukturelle aspekter såsom volumenfraktioner, overfladeareal til volumenforhold, morfometri og fysiske kontaktsteder for forskellige subcellulære strukturer. I 1970'erne blev der udviklet en protokol til forbedret farvning af glykogen i celler og banede vejen for en række undersøgelser af den subcellulære lokalisering af glykogen og glykogenpartikelstørrelse ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi. Mens de fleste analyser fortolker glykogen, som om det er homogent fordelt i muskelfibrene, hvilket kun giver en enkelt værdi (f.eks. En gennemsnitlig koncentration), har transmissionselektronmikroskopi afsløret, at glykogen opbevares som diskrete glykogenpartikler placeret i forskellige subcellulære rum. Her beskrives den trinvise protokol fra vævsopsamling til kvantitativ bestemmelse af volumenfraktionen og partikeldiameteren af glykogen i de forskellige subcellulære rum i individuelle skeletmuskelfibre. Overvejelser om, hvordan man 1) indsamler og pletter vævsprøver, 2) udfører billedanalyser og datahåndtering, 3) evaluerer estimaternes præcision, 4) diskriminerer mellem muskelfibertyper, og 5) metodiske faldgruber og begrænsninger indgår.

Ved hjælp af denne protokol fremstår glykogenpartikler sorte og tydelige (figur 1 og figur 2). De normale værdier af glykogen er afbildet i figur 3. Disse data er baseret på i alt 362 fibre fra 41 raske unge mænd som indsamlet i forskellige tidligere undersøgelser19,24,29,30,31.<sup class=...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

En modificeret postfikseringsprocedure øger kontrasten mellem glykogenpartikler i væv. Dette papir giver en trinvis protokol, der beskriver, hvordan man håndterer vævet, udfører billeddannelsen og bruger stereologiske metoder til at opnå upartiske og kvantitative data om fibertypespecifik subcellulær glykogenfordeling i skeletmuskulaturen.

Kvantificering af subcellulær glykogenfordeling i skeletmuskelfibre ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Målingen af glykogenindholdet i enkeltceller og subcellulære organisationer er vigtig, fordi enkeltceller i de fleste celletyper tilpasser sig forskelligt til skiftende fysiologiske tilstande og sygdomme. Så den største fordel ved denne teknik er den meget høje opløsning i transmissionselektronmikroskopet. Dette forbedrer muligheden for at have lokaliserede subcellulære strukturer, og også i dette indhold i denne teknik her er det vigtigt, at glykogenfarvningen er antistoffri.Så vi har ikke nogen specificitet at bekymre os om. For at få en bedre kontrast på glykogen skal du bare bruge kaliumferrocyanid 1,5% i stedet for kaliumferrocyanid. Forbered 1,6 ml af den primære fikseringsopløsning ved at tilsætte 2,5% glutaraldehyd i 0,1 molær natriumkacodylatbuffer i et mikrocentrifikationsrør på to milliliter.Opbevar det ved fem grader Celsius i højst 14 dage. Isoler en lille prøve fra muskelbiopsi eller hele musklen, som har en maksimal diameter på en millimeter i enhver retning og er længere i længderetningen end tværsnit. Prøven anbrings i røret, der indeholder den kolde primære fikseringsopløsning.Opbevar det ved fem grader Celsius i 24 timer. Derefter vaskes prøven fire gange i 0,1 molær natriumkacodylatbuffer. Brug overførselspipetter til at fjerne den brugte buffer fra røret og lade prøven være uberørt og tilsætte den friske buffer.Efterfikseres prøven med 1% osmiumtetroxid og 1,5% kaliumferrocyanid i 0,1 molær natriumkacodylatbuffer i 120 minutter ved fire grader Celsius. Prøven skylles to gange i dobbeltdestilleret vand ved stuetemperatur. Dehydrer ved at nedsænke i en gradueret serie ethanol ved stuetemperatur.Prøven infiltreres med propylenoxid og epossidiske harpiksklassificerede blandinger ved stuetemperatur under anvendelse af de nævnte volumenforhold. Den følgende dag indlejres prøver i 100% frisk epossidisk harpiks i forme og polymeriseres ved 60 grader Celsius i 48 timer. Monter blokken af en prøve på ultramikrotomholderen.Trim blokken på overfladen med et barberblad for at nå vævsniveauet. Monter en diamantkniv foran prøven, og juster prøveoverfladen parallelt med kniven. Fremstil en halvtynd sektion af en mikrometer tykkelse med diamantkniven for at kontrollere prøvens retning.Plet den halvtynde sektion med toluidinblå til observation med lysmikroskopi. Trim derefter blokken yderligere for at reducere interesseområdet for at få ordentlige ultratynde sektioner. Skær 60 til 70 nanometer tykkelse ultratynde sektioner med en anden diamantkniv.Saml en til to sektioner på et helt kobbergitter ved hjælp af en perfekt løkke. Til kontrastering af sektionerne nedsænkes gitterene i uranylacetatopløsning i 20 minutter og vaskes gitterene i dobbeltdestilleret vand og nedsænkes derefter i blycitrat i 15 minutter og vaskes gitterene igen i dobbeltdestilleret vand. Tænd transmissionselektronmikroskopet computer og billedoptagelsessoftware, optag digitale billeder med et digitalt Slow Scan CCD-kamera og den tilhørende billedbehandlingssoftware.Efter indsættelse af gitteret med flere sektioner i mikroskopfasen skal du screene gitteret oprindeligt ved lav forstørrelse for at vælge sektioner af bedste kvalitet og bestemme muskelfibrenes retning. Næste fokus, billedet ved forstørrelse over 30.000 med strålen centreret på en perifer fiber i sektionen og optage billeder med et sekund eksponeringstid ved den ønskede forstørrelse. Sørg for, at billederne fordeles over fiberens længde og bredde i en randomiseret bot systematisk rækkefølge for at opnå upartiske resultater og gentage billeddannelsen, indtil seks til 10 fibre er afbildet.Importer billeder til billede J ved at klikke på filen efterfulgt af åben. Indstil global skala til at matche billedets oprindelige størrelse ved at klikke på analysér og derefter indstille skala. For at zoome ind 100% klik på billedet skal du gå til zoom og klikke på ind.Mål tykkelsen af en Z-disk pr. billede af det myofibrillære rum ved hjælp af værktøjet lige linje fra værktøjsmenuen, og beregn den gennemsnitlige Z-disktykkelse for hver af de seks til 10 fibre. Brug det segmenterede linjeværktøj til at måle længden af den yderste myofibriller, der er synlig lige under det subsarkolemmale område. For at indsætte et gitter skal du klikke på analyser, vælge værktøjer og derefter vælge gitter.Indstil nu arealet pr. Punkt til 32.400 kvadrat nanometer. Tæl antallet af hits inden for den tilgængelige længde i de 12 subsarcolemmale billeder, hvor et kryds rammer det subsarkolemmale glykogen. Indsæt et gitter ved at klikke på analyser, vælg derefter værktøjer efterfulgt af gitter og indstil areal pr. Punkt ved 160.000 kvadrat nanometer.Tæl antallet af hits i de 12. myofibrillære billeder, hvor et kryds rammer det intramyofibrillære rum. Så igen, for at indsætte et gitter, skal du klikke på analysere, vælge værktøjer og derefter vælge gitter. Indstil nu arealet pr. punkt til 3.600 kvadrat nanometer.Tæl antallet af hits i de 12. myofibrillære billeder, hvor et kryds rammer det intramyofibrillære glykogen. Indsæt et gitter ved at klikke på analyser, vælg derefter værktøjer efterfulgt af gitter og indstil areal pr. Punkt på 32.400 kvadrat nanometer. Tæl antallet af hits i det 12. myofibrillære billede, hvor et kryds rammer det intermyofibrillære glykogen.Brug gitteret på 32.400 kvadratiske nanometer til tilfældigt at vælge glykogenpartiklerne, start med den øverste venstre firkant og flyt til venstre, hvis det er nødvendigt. Ved hjælp af lige linjeværktøj måles diameteren af fem tilfældigt udvalgte glykogenpartikler i hver pool for hvert af de 12 billeder for at opnå et gennemsnit på 60 partikler pr. Pool pr. Fiber. Denne figur viser de normale værdier for de tre glykogenpuljer.Det kan observeres, at intermyofibrillære glykogenværdier fordeles tæt på det normale, mens både intramyofibrillært og subsarcolemmalt glykogen viser skæv fordeling, hvor fibre undertiden har en for stor mængde glykogen. Blandt alle trinene er det meget vigtigt at bruge kaliumferrocyanid. Analysen af glykogen kan kombineres med analyse af mitokondrier og lipiddråber, som kan forbedre vores forståelse af, hvordan andre vigtige metaboliske komponenter korrelerer med glykogen og muskelsundhed.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode til at visualisere og analysere membran interagerende proteiner af Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Forbedret protokol for kromatin Immunoprecipitation fra mus skeletmuskulatur

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse af β-Amyloid-induceret afvigelser Fibrin blodprop strukturen af spektroskopi og Scanning elektronmikroskopi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Forberedelse af prøvestøttefilm i transmissionselektronmikroskopi ved hjælp af en støtteflådsblok

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmission ElektronMikroskopiGitre til direkte cellepositionering i hele celle kryo-elektrontomografi arbejdsprocesser

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Måling af proteinimportkapacitet af skeletmuskulatur mitokondrier

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

Bestemmelse af glucankædelængdefordeling af glykogen ved hjælp af fluorofor-assisteret kulhydratelektroforese (FACE) -metoden

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemæssig indsamling af kryo-EM-datasæt i høj opløsning ved hjælp af 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Billedbaseret kvantificering med høj kapacitet af mitokondrie-DNA-syntese og -distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...