Name: quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Zweeds Olympisch Comité.

Het huidige protocol met behulp van menselijke gebiopteerde skeletspiermonsters werd goedgekeurd door de regionale commissies voor gezondheidsonderzoeksethiek voor Zuid-Denemarken (S-20170198). Spierbiopten werden verkregen door een incisie in de huid van de spier vastus lateralis met behulp van een Bergström-naald met zuiging nadat lokale anesthesie subcutaan was toegediend (1-3 ml Lidocaïne 2% per incisie). Als geïsoleerde hele rattenspieren werden gebruikt, werden de dieren geofferd door cervicale dislocat...

<ol>
	<li>Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+life+of+the+glycogen+granule.">The dynamic life of the glycogen granule.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).</li><li>Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+glycogen+depletion+pattern+in+human+muscle+fibres+after+exercise+of+varying+intensity+and+at+varying+pedalling+rates.">Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates.</a> Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).</li><li>James, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+both+aerobic+glycolysis+and+Na+-K+-ATPase+activity+in+skeletal+muscle+by+epinephrine+or+amylin.">Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).</li><li>Jensen, R., Nielsen, J., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+glycogenolysis+prolongs+action+potential+repriming+period+and+impairs+muscle+function+in+rat+skeletal+muscle.">Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle.</a> Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).</li><li>Green, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+important+is+endogenous+muscle+glycogen+to+fatigue+in+prolonged+exercise.">How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).</li><li>Fitts, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+muscle+fatigue.">Cellular mechanisms of muscle fatigue.</a> Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).</li><li>Wanson, J. C., Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+glycogen+metabolism.">Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism.</a> Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).</li><li>Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+the+human+brachial+biceps+muscle.">Fiber types in the human brachial biceps muscle.</a> Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).</li><li>Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+glycogen.+Electron+microscopic+study+of+the+negative+stains+of+particulate+glycogen.">Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li><li>Thiery, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+polysaccharides+on+thin+sections+by+electron+microscopy.">Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).</li><li>De Bruijn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen,+its+chemistry+and+morphologic+appearance+in+the+electron+microscope.+I.+A+modified+OsO4+fixative+which+selectively+contrasts+glycogen.">Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen.</a> Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).</li><li>Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+accumulation+in+polymorphonuclear+leukocytes,+and+other+intracellular+alterations+that+occur+during+inflammation.">Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation.</a> The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).</li><li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes+-+the+organelles+of+glycogen+metabolism.">Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li><li>Gadisseux, J. F., Evrard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-neuronal+relationship+in+the+developing+central+nervous+system.+A+histochemical-electron+microscope+study+of+radial+glial+cell+particulate+glycogen+in+normal+and+reeler+mice+and+the+human+fetus.">Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus.</a> Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).</li><li>Frid&#233;n, J., Seger, J., Ekblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+periodic+acid-thiosemicarbazide-silver+proteinate+staining+for+ultrastructural+assessment+of+muscle+glycogen+utilization+during+exercise.">Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise.</a> Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+subcellular+glycogen+in+resting+human+muscle:+granule+size,+number,+and+location.">Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location.</a> Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+muscle+glycogen+granules+size+and+number+in+subcellular+locations+during+recovery+from+prolonged+exercise.">Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise.</a> Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).</li><li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Glycogenolysis+Modulates+Histone+Acetylation+in+Human+Non-Small+Cell+Lung+Cancers.">Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).</li><li>Jensen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+subcellular+muscle+glycogen+utilisation+during+exercise+impacts+endurance+capacity+in+men.">Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men.</a> Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).</li><li>Nielsen, J., Schr&#248;der, H. D., Rix, C. G., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+subcellular+glycogen+localization+on+tetanic+relaxation+time+and+endurance+in+mechanically+skinned+rat+skeletal+muscle+fibres.">Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).</li><li>Nielsen, J., Cheng, A. J., &#216;rtenblad, N., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+glycogen+and+decreased+tetanic+Ca2++in+fatigued+single+intact+mouse+muscle+fibres.">Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).</li><li>Mead, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+constraints+in+synchronous+muscle+limit+superfast+motor+control+in+vertebrates.">Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates.</a> eLife. 6, 29425 (2017).</li><li>Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., &#216;rtenblad, N., B&#248;tker, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+subcellular+glycogen+distribution+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling:+effects+of+ischaemia,+reperfusion+and+ischaemic+preconditioning.">Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning.</a> Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).</li><li>Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schr&#248;der, H. D., Saltin, B., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+glycogen+utilization+in+exhaustive+exercise:+role+of+subcellular+localization+and+fibre+type.">Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type.</a> Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).</li><li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new,+simple+and+efficient+stereological+methods+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).</li><li>Saltin, B., Gollnick, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+adaptability:+significance+for+metabolism+and+performance.">Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance.</a> Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).</li><li>Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-dependent+decrements+in+skeletal+muscle+glycogen+and+mitochondria+content+following+short-term+disuse+in+young+and+old+men.">Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).</li><li>Hokken, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-+and+fibre+type-dependent+utilization+of+muscle+glycogen+during+heavy+resistance+exercise+in+elite+power+and+Olympic+weightlifters.">Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters.</a> Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).</li><li>Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glycogen+storage+of+a+subcellular+hot+spot+in+human+skeletal+muscle+during+early+recovery+from+eccentric+contractions.">Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions.</a> PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).</li><li>Sj&#246;str&#246;m, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analyses+of+human+muscle+fiber+types.">Morphometric analyses of human muscle fiber types.</a> Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).</li><li>Gejl, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+depletion+of+glycogen+with+supramaximal+exercise+in+human+skeletal+muscle+fibres.">Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).</li><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li></ol>

De kritieke stap van de methode is het gebruik van gereduceerd osmium door kaliumferrocyanide tijdens postfixatie. De selectiviteit van dit gemodificeerde fixatief voor glycogeendetectie kan niet volledig worden verklaard door chemie, maar omvat ook experimentele bevindingen die aantonen dat dergelijke deeltjes niet worden gedetecteerd in weefsels waarvan bekend is dat ze vrij zijn van glycogeen of in de extracellulaire ruimte11.
Kritische parameters zijn de precisie va...

Glycogeendeeltjes zijn samengesteld uit vertakte polymeren van glucose en verschillende bijbehorende eiwitten1 en vormen een belangrijke brandstof tijdens hoge metabolische eisen2. Hoewel niet algemeen erkend, vormen glycogeendeeltjes ook een lokale brandstof, waar sommige subcellulaire processen bij voorkeur glycogeen gebruiken ondanks de beschikbaarheid van andere en duurzamere brandstoffen zoals plasmaglucose en vetzuren3,4.
Het belang van het opslaan van glycogeen als een subcellulaire specifieke gelokaliseerde brandstof is besproken in verschillende beoordelingen5,6 voornamelijk gebaseerd op enkele van de vroegste documentaties van de subcellulaire verdeling van glycogeen door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)7,8. De eerste studies gebruikten verschillende protocollen om het contrast van glycogeen van histochemische kleuringstechnieken naar negatieve en positieve kleuringen9,10 te verhogen. Een belangrijke methodologische ontwikkeling was het verfijnde postfixatieprotocol met het kaliumferrocyanide-gereduceerde osmium11,12,13,14, dat het contrast van glycogeendeeltjes aanzienlijk verbeterde. Dit verfijnde protocol werd niet gebruikt in een deel van het pionierswerk aan door inspanning geïnduceerde glycogeendepletie15, maar werd opnieuw geïntroduceerd door Graham en collega's16,17.
Op basis van de 2-dimensionale afbeeldingen wordt de subcellulaire verdeling van glycogeen meestal beschreven als glycogeendeeltjes in drie pools: subsarcolemmaal (net onder het oppervlaktemembraan), intermyofibrillair (tussen de myofibrillen) of intramyofibrillair (binnen de myofibrillen). Glycogeendeeltjes kunnen echter ook worden beschreven als geassocieerd met bijvoorbeeld sarcoplasmatisch reticulum7 of kernen18. Naast de subcellulaire verdeling is het voordeel van het tem-geschatte glycogeengehalte ook dat kwantificering kan worden uitgevoerd op het niveau van één vezel. Dit maakt onderzoek van vezel-naar-vezel variabiliteit en correlatieve analyses met vezeltypen en cellulaire componenten als mitochondriën en lipidedruppels mogelijk.
Hier wordt het protocol beschreven voor het TEM-geschatte vezeltypespecifieke volumetrische gehalte van de drie gemeenschappelijke subcellulaire pools van glycogeen (subsarcolemmaal, intermyofibrillair en intramyofibrillair) in skeletspiervezels. De methode is toegepast op skeletspieren van mensen19, ratten20 en muizen21; evenals vogels en vissen22; en cardiomyocyten van ratten23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Propylene oxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-56-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding 812 resin medium kit</td>
			<td>Taab</td>
			<td>T031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04239.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITEM</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM AC20</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Automatic contrasting system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSIS Veleta digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>0972A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM 100 Transmission EM</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455989-245G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4</td>
			<td>Ampliqon.com</td>
			<td>AMPQ40989.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-microtome Leica UC7</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>6159-44-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy

Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie kunnen afbeeldingen met hoge resolutie van vaste monsters met individuele spiervezels worden verkregen. Dit maakt kwantificeringen mogelijk van ultrastructurele aspecten zoals volumefracties, oppervlakte-volumeverhoudingen, morfometrie en fysieke contactlocaties van verschillende subcellulaire structuren. In de jaren 1970 werd een protocol voor verbeterde kleuring van glycogeen in cellen ontwikkeld en de weg vrijgemaakt voor een reeks studies over de subcellulaire lokalisatie van glycogeen en glycogeendeeltjesgrootte met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Terwijl de meeste analyses glycogeen interpreteren alsof het homogeen verdeeld is in de spiervezels en slechts een enkele waarde oplevert (bijvoorbeeld een gemiddelde concentratie), heeft transmissie-elektronenmicroscopie aangetoond dat glycogeen wordt opgeslagen als discrete glycogeendeeltjes in verschillende subcellulaire compartimenten. Hier wordt het stapsgewijze protocol beschreven van weefselverzameling tot de kwantitatieve bepaling van de volumefractie en deeltjesdiameter van glycogeen in de verschillende subcellulaire compartimenten van individuele skeletspiervezels. Overwegingen over hoe 1) weefselmonsters te verzamelen en te kleuren, 2) beeldanalyses en gegevensverwerking uit te voeren, 3) de precisie van schattingen te evalueren, 4) onderscheid te maken tussen spiervezeltypen en 5) methodologische valkuilen en beperkingen zijn inbegrepen.

Met behulp van dit protocol lijken glycogeendeeltjes zwart en duidelijk (figuren 1 en figuur 2). De normale waarden van glycogeen zijn weergegeven in figuur 3. Deze gegevens zijn gebaseerd op een totaal van 362 vezels van 41 gezonde jonge mannen zoals verzameld in verschillende eerdere studies19,24,29,30,31.</su...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Een aangepaste postfixatieprocedure verhoogt het contrast van glycogeendeeltjes in weefsel. Dit artikel biedt een stapsgewijs protocol dat beschrijft hoe het weefsel moet worden behandeld, de beeldvorming moet worden uitgevoerd en stereologische methoden moeten worden gebruikt om onbevooroordeelde en kwantitatieve gegevens te verkrijgen over vezeltypespecifieke subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspieren.

Kwantificering van subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspiervezels met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

De meting van het glycogeengehalte in afzonderlijke cellen en subcellulaire organisaties is belangrijk omdat in de meeste celtypen afzonderlijke cellen zich anders aanpassen aan veranderende fysiologische omstandigheden en ziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dus de zeer hoge resolutie in de transmissie-elektronenmicroscoop. Dit verbetert de mogelijkheid om gelokaliseerde subcellulaire structuren te hebben en ook in deze inhoud in deze techniek hier, is het belangrijk dat de glycogeenkleuring antilichaamvrij is.We hebben dus geen specificiteit om ons zorgen over te maken. Om een beter contrast op glycogeen te krijgen, gebruikt u gewoon kaliumferrocyanide 1,5% in plaats van kaliumferrocyanide. Bereid 1,6 milliliter van de primaire fixatieve oplossing door 2,5% glutaaraldehyde toe te voegen aan 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer in een microcentrificatiebuis van twee milliliter.Bewaar het bij vijf graden Celsius gedurende maximaal 14 dagen. Isoleer een klein monster uit de spierbiopsie of hele spier met een maximale diameter van één millimeter in elke richting en is langer in de lengterichting dan dwarsdoorsnede. Plaats het monster in de buis met de koude primaire fixatieoplossing.Bewaar het bij vijf graden Celsius gedurende 24 uur. Was het monster vervolgens vier keer in een natriumkactodocytenbuffer van 0,1 kies. Verwijder met behulp van transferpipeten de gebruikte buffer uit de buis en laat het monster onaangeroerd en voeg de verse buffer toe.Fixeer het monster na met 1%osmiumtetroxide en 1,5% kaliumferrocyanide in 0,1 molaire natriumkactrodinebuffer gedurende 120 minuten bij vier graden Celsius. Spoel het monster tweemaal in dubbel gedestilleerd water bij kamertemperatuur. Droog uit door onderdompeling in een gesorteerde reeks ethanol bij kamertemperatuur.Infiltreer het monster met mengsels van propyleenoxide en epossidische harskwaliteit bij kamertemperatuur met behulp van de genoemde volumeverhoudingen. De volgende dag, integreer monsters in 100% verse epossidische hars in mallen en polymeriseer bij 60 graden Celsius gedurende 48 uur. Monteer het blok van een monster op de ultramicrotomehouder.Snijd het blok op het oppervlak af met een scheermesje om het weefselniveau te bereiken. Monteer een diamantmes voor het monster en lijn het monsteroppervlak parallel aan het mes uit. Produceer een halfdunne sectie van één micrometer dikte met het diamantmes om de oriëntatie van het monster te controleren.Kleur het halfdunne gedeelte met toluidineblauw voor observatie met lichtmicroscopie. Snijd vervolgens het blok verder bij om het interessegebied te verkleinen om de juiste ultradunne secties te krijgen. Snijd ultradunne secties van 60 tot 70 nanometer dikte met een tweede diamantmes.Verzamel één tot twee secties op een heel koperen rooster met behulp van een perfecte lus. Om de secties te contrasteren, dompelt u de roosters gedurende 20 minuten onder in uranylacetaatoplossing en wast u de roosters in dubbel gedestilleerd water en dompelt u de roosters vervolgens gedurende 15 minuten onder in loodcitraat en wast u de roosters opnieuw in dubbel gedestilleerd water. Schakel de transmissie-elektronenmicroscoopcomputer en beeldopnamesoftware in, neem digitale beelden op met een digitale Slow Scan CCD-camera en de bijbehorende beeldbewerkingssoftware.Na het invoegen van het raster met meerdere secties in de microscoopfase, screent u het raster aanvankelijk bij lage vergroting om de secties van de beste kwaliteit te kiezen en de richting van de spiervezels te bepalen. Stel vervolgens het beeld scherp bij een vergroting boven 30.000 met de straal gecentreerd op een perifere vezel in de sectie en neem beelden op met een seconde belichtingstijd bij de gewenste vergroting. Zorg ervoor dat de afbeeldingen worden verdeeld over de lengte en breedte van de vezel in een gerandomiseerde bot systematische volgorde om onbevooroordeelde resultaten te verkrijgen en herhaal de beeldvorming totdat zes tot 10 vezels in beeld zijn gebracht.Importeer afbeeldingen naar afbeelding J door op bestand te klikken gevolgd door openen. Stel de globale schaal in op de oorspronkelijke grootte van de afbeelding door op analyseren te klikken en vervolgens schaal in te stellen. Om 100% in te zoomen klik je op afbeelding, ga je naar zoomen en klik je in.Meet de dikte van één Z-schijf per afbeelding van de myofibrillaire ruimte met behulp van het rechte lijngereedschap uit het gereedschapsmenu en bereken de gemiddelde Z-schijfdikte van elk van de zes tot 10 vezels. Gebruik het gereedschap Gesegmenteerde lijn om de lengte van de buitenste myofibril te meten die net onder het subsarcolemmale gebied zichtbaar is. Als u een raster wilt invoegen, klikt u op analyseren, selecteert u gereedschappen en selecteert u vervolgens raster.Stel nu het gebied per punt in op 32.400 vierkante nanometer. Tel het aantal treffers binnen de beschikbare lengte in de 12 subsarcolemmale afbeeldingen waar een kruis het subsarcolemmale glycogeen raakt. Voeg een raster in door op analyseren te klikken, selecteer vervolgens gereedschappen, gevolgd door raster en stel het gebied per punt in op 160.000 vierkante nanometer.Tel het aantal treffers in de 12e myofibrillaire beelden waarbij een kruis de intramyofibrillaire ruimte raakt. Aan de andere kant, om een raster in te voegen, klikt u op analyseren, selecteert u gereedschappen en selecteert u vervolgens raster. Stel nu het gebied per punt in op 3.600 vierkante nanometer.Tel het aantal treffers in de 12e myofibrillaire beelden waarbij een kruis het intramyofibrillaire glycogeen raakt. Voeg een raster in door op analyseren te klikken, selecteer vervolgens gereedschappen, gevolgd door raster en stel het gebied per punt in op 32.400 vierkante nanometer. Tel het aantal treffers in de 12e myofibrillaire beelden waarbij een kruising het intermyofibrilllar glycogeen raakt.Gebruik het raster van 32, 400 vierkante nanometer om willekeurig de glycogeendeeltjes te kiezen, begin met het vierkant linksboven en beweeg indien nodig naar links. Meet met behulp van een rechtlijnig gereedschap de diameter van vijf willekeurig gekozen glycogeendeeltjes van elk zwembad voor elk van de 12 afbeeldingen om een gemiddelde van 60 deeltjes per pool per vezel te verkrijgen. Deze figuur toont de normale waarden van de drie glycogeenpools.Er kan worden waargenomen dat intermyofibrillaire glycogeenwaarden dicht bij normaal worden verdeeld, terwijl zowel intramyofibrillair als subsarcospecletaal glycogeen een scheve verdeling vertonen waarbij vezels soms een overmatige hoeveelheid glycogeen hebben. Onder alle stappen is het erg belangrijk om kaliumferrocyanide te gebruiken. De analyse van glycogeen kan worden gecombineerd met analyse van mitochondrion en lipidedruppels die ons begrip van hoe andere belangrijke metabole componenten correleren met glycogeen en spiergezondheid kunnen verbeteren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Verbeterde Protocol voor chromatine Immunoprecipitation van muis skeletspieren

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Voorbereiding van sample support films in transmissie elektronenmicroscopie met behulp van een support floatation block

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Meting van eiwitimportcapaciteit van skeletspier mitochondriën

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

Bepaling van de glucaanketenlengteverdeling van glycogeen met behulp van de fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE) -methode

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

High-throughput image-based kwantificering van mitochondriale DNA-synthese en -distributie

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...