Name: quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par le Comité olympique suédois.

Le protocole actuel utilisant des échantillons de muscles squelettiques biopsiés humains a été approuvé par les comités régionaux d’éthique de la recherche en santé pour le sud du Danemark (S-20170198). Les biopsies musculaires ont été obtenues par une incision dans la peau du muscle vastus lateralis à l’aide d’une aiguille Bergström avec aspiration après anesthésie locale (1-3 mL de lidocaïne 2% par incision). Si des muscles entiers isolés de rats ont été utilisés, les animaux ont ét?...

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	<li>Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+life+of+the+glycogen+granule.">The dynamic life of the glycogen granule.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).</li><li>Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+glycogen+depletion+pattern+in+human+muscle+fibres+after+exercise+of+varying+intensity+and+at+varying+pedalling+rates.">Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates.</a> Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).</li><li>James, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+both+aerobic+glycolysis+and+Na+-K+-ATPase+activity+in+skeletal+muscle+by+epinephrine+or+amylin.">Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).</li><li>Jensen, R., Nielsen, J., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+glycogenolysis+prolongs+action+potential+repriming+period+and+impairs+muscle+function+in+rat+skeletal+muscle.">Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle.</a> Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).</li><li>Green, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+important+is+endogenous+muscle+glycogen+to+fatigue+in+prolonged+exercise.">How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).</li><li>Fitts, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+muscle+fatigue.">Cellular mechanisms of muscle fatigue.</a> Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).</li><li>Wanson, J. C., Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+glycogen+metabolism.">Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism.</a> Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).</li><li>Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+the+human+brachial+biceps+muscle.">Fiber types in the human brachial biceps muscle.</a> Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).</li><li>Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+glycogen.+Electron+microscopic+study+of+the+negative+stains+of+particulate+glycogen.">Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li><li>Thiery, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+polysaccharides+on+thin+sections+by+electron+microscopy.">Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).</li><li>De Bruijn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen,+its+chemistry+and+morphologic+appearance+in+the+electron+microscope.+I.+A+modified+OsO4+fixative+which+selectively+contrasts+glycogen.">Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen.</a> Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).</li><li>Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+accumulation+in+polymorphonuclear+leukocytes,+and+other+intracellular+alterations+that+occur+during+inflammation.">Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation.</a> The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).</li><li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes+-+the+organelles+of+glycogen+metabolism.">Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li><li>Gadisseux, J. F., Evrard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-neuronal+relationship+in+the+developing+central+nervous+system.+A+histochemical-electron+microscope+study+of+radial+glial+cell+particulate+glycogen+in+normal+and+reeler+mice+and+the+human+fetus.">Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus.</a> Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).</li><li>Frid&#233;n, J., Seger, J., Ekblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+periodic+acid-thiosemicarbazide-silver+proteinate+staining+for+ultrastructural+assessment+of+muscle+glycogen+utilization+during+exercise.">Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise.</a> Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+subcellular+glycogen+in+resting+human+muscle:+granule+size,+number,+and+location.">Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location.</a> Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+muscle+glycogen+granules+size+and+number+in+subcellular+locations+during+recovery+from+prolonged+exercise.">Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise.</a> Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).</li><li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Glycogenolysis+Modulates+Histone+Acetylation+in+Human+Non-Small+Cell+Lung+Cancers.">Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).</li><li>Jensen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+subcellular+muscle+glycogen+utilisation+during+exercise+impacts+endurance+capacity+in+men.">Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men.</a> Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).</li><li>Nielsen, J., Schr&#248;der, H. D., Rix, C. G., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+subcellular+glycogen+localization+on+tetanic+relaxation+time+and+endurance+in+mechanically+skinned+rat+skeletal+muscle+fibres.">Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).</li><li>Nielsen, J., Cheng, A. J., &#216;rtenblad, N., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+glycogen+and+decreased+tetanic+Ca2++in+fatigued+single+intact+mouse+muscle+fibres.">Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).</li><li>Mead, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+constraints+in+synchronous+muscle+limit+superfast+motor+control+in+vertebrates.">Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates.</a> eLife. 6, 29425 (2017).</li><li>Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., &#216;rtenblad, N., B&#248;tker, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+subcellular+glycogen+distribution+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling:+effects+of+ischaemia,+reperfusion+and+ischaemic+preconditioning.">Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning.</a> Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).</li><li>Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schr&#248;der, H. D., Saltin, B., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+glycogen+utilization+in+exhaustive+exercise:+role+of+subcellular+localization+and+fibre+type.">Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type.</a> Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).</li><li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new,+simple+and+efficient+stereological+methods+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).</li><li>Saltin, B., Gollnick, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+adaptability:+significance+for+metabolism+and+performance.">Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance.</a> Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).</li><li>Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-dependent+decrements+in+skeletal+muscle+glycogen+and+mitochondria+content+following+short-term+disuse+in+young+and+old+men.">Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).</li><li>Hokken, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-+and+fibre+type-dependent+utilization+of+muscle+glycogen+during+heavy+resistance+exercise+in+elite+power+and+Olympic+weightlifters.">Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters.</a> Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).</li><li>Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glycogen+storage+of+a+subcellular+hot+spot+in+human+skeletal+muscle+during+early+recovery+from+eccentric+contractions.">Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions.</a> PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).</li><li>Sj&#246;str&#246;m, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analyses+of+human+muscle+fiber+types.">Morphometric analyses of human muscle fiber types.</a> Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).</li><li>Gejl, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+depletion+of+glycogen+with+supramaximal+exercise+in+human+skeletal+muscle+fibres.">Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).</li><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li></ol>

L’étape critique de la méthode est l’utilisation d’osmium réduit par le ferrocyanure de potassium pendant la post-fixation. La sélectivité de ce fixateur modifié pour la détection du glycogène ne peut pas être entièrement expliquée par la chimie, mais comprend également des résultats expérimentaux démontrant qu’aucune détection de telles particules dans des tissus connus pour être exempts de glycogène ou dans l’espace extracellulaire11.
Les p...

Les particules de glycogène sont composées de polymères ramifiés de glucose et de diverses protéines associées1 et constituent un carburant important lors de demandes métaboliques élevées2. Bien qu’elles ne soient pas largement reconnues, les particules de glycogène constituent également un carburant local, où certains processus subcellulaires utilisent préférentiellement le glycogène malgré la disponibilité d’autres carburants plus durables comme le glucose plasmatique et les acides gras3,4.
L’importance du stockage du glycogène en tant que combustible localisé spécifique subcellulaire a été discutée dans plusieurs revues5,6 principalement basées sur certaines des premières documentations sur la distribution subcellulaire du glycogène par microscopie électronique à transmission (TEM)7,8. Les premières études ont utilisé différents protocoles pour augmenter le contraste du glycogène des techniques de coloration histochimique aux colorations négatives et positives9,10. Un développement méthodologique important a été le protocole de post-fixation raffiné avec l’osmium réduit en ferrocyanure de potassium11,12,13,14, qui a considérablement amélioré le contraste des particules de glycogène. Ce protocole affiné n’a pas été utilisé dans certains des travaux pionniers sur l’épuisement du glycogène induit par l’exercice15, mais a été réintroduit par Graham et ses collègues16,17.
Sur la base des images en 2 dimensions, la distribution subcellulaire du glycogène est le plus souvent décrite comme des particules de glycogène situées dans trois pools: subsarcolemmal (juste sous la membrane de surface), intermyofibrillaire (entre les myofibrillaires) ou intramyofibrillaire (dans les myofibrillaires). Cependant, les particules de glycogène pourraient également être décrites comme associées, par exemple, au réticulum sarcoplasmique7 ou aux noyaux18. En plus de la distribution subcellulaire, l’avantage de la teneur en glycogène estimée par TEM est également que la quantification peut être effectuée au niveau de la fibre unique. Cela permet d’étudier la variabilité fibre à fibre et d’effectuer des analyses corrélatives avec les types de fibres et les composants cellulaires tels que les mitochondries et les gouttelettes lipidiques.
Ici, le protocole pour le contenu volumétrique spécifique au type de fibre TEM estimé des trois pools subcellulaires communs de glycogène (sous-sarmateux, intermyofibrillaire et intramyofibrillaire) dans les fibres musculaires squelettiques est décrit. La méthode a été appliquée aux muscles squelettiques des humains19, des rats20 et des souris21; ainsi que les oiseaux et les poissons22; et les cardiomyocytes de rats23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Propylene oxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-56-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding 812 resin medium kit</td>
			<td>Taab</td>
			<td>T031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04239.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITEM</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM AC20</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Automatic contrasting system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSIS Veleta digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>0972A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM 100 Transmission EM</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455989-245G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4</td>
			<td>Ampliqon.com</td>
			<td>AMPQ40989.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-microtome Leica UC7</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>6159-44-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy

Avec l’utilisation de la microscopie électronique à transmission, des images à haute résolution d’échantillons fixes contenant des fibres musculaires individuelles peuvent être obtenues. Cela permet de quantifier les aspects ultrastructuraux tels que les fractions volumiques, les rapports surface/volume, la morphométrie et les sites de contact physique de différentes structures subcellulaires. Dans les années 1970, un protocole pour améliorer la coloration du glycogène dans les cellules a été développé et a ouvert la voie à une série d’études sur la localisation subcellulaire du glycogène et la taille des particules de glycogène à l’aide de la microscopie électronique à transmission. Alors que la plupart des analyses interprètent le glycogène comme s’il était réparti de manière homogène dans les fibres musculaires, ne fournissant qu’une seule valeur (par exemple, une concentration moyenne), la microscopie électronique à transmission a révélé que le glycogène est stocké sous forme de particules de glycogène discrètes situées dans des compartiments subcellulaires distincts. Ici, le protocole étape par étape de la collecte de tissus à la détermination quantitative de la fraction volumique et du diamètre des particules de glycogène dans les compartiments subcellulaires distincts des fibres musculaires squelettiques individuelles est décrit. Considérations sur la façon de 1) prélever et colorer des échantillons de tissus, 2) effectuer des analyses d’images et le traitement des données, 3) évaluer la précision des estimations, 4) discriminer entre les types de fibres musculaires, et 5) les pièges méthodologiques et les limites sont inclus.

En utilisant ce protocole, les particules de glycogène apparaissent noires et distinctes (figures 1 et figure 2). Les valeurs normales du glycogène sont représentées à la figure 3. Ces données sont basées sur un total de 362 fibres provenant de 41 jeunes hommes en bonne santé recueillies dans différentes études antérieures19,24,29,30,31.<sup class="xref...

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Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Une procédure de post-fixation modifiée augmente le contraste des particules de glycogène dans les tissus. Cet article fournit un protocole étape par étape décrivant comment manipuler le tissu, effectuer l’imagerie et utiliser des méthodes stéréologiques pour obtenir des données impartiales et quantitatives sur la distribution du glycogène subcellulaire spécifique au type de fibre dans le muscle squelettique.

Quantification de la distribution subcellulaire du glycogène dans les fibres musculaires squelettiques à l’aide de la microscopie électronique à transmission

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

La mesure de la teneur en glycogène dans les cellules individuelles et les organisations subcellulaires est importante car dans la plupart des types de cellules, les cellules individuelles s’adaptent différemment aux conditions physiologiques changeantes et aux maladies. Ainsi, le principal avantage de cette technique est la très haute résolution dans le microscope électronique à transmission. Cela améliore la possibilité d’avoir des structures subcellulaires localisées et aussi dans ce contenu dans cette technique ici, il est important que la coloration au glycogène soit sans anticorps.Nous n’avons donc aucune spécificité à craindre. Afin d’obtenir un meilleur contraste sur le glycogène, il suffit d’utiliser du ferrocyanure de potassium 1,5% au lieu du ferrocyanure de potassium. Préparer 1,6 millilitre de la solution fixative primaire en ajoutant 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 molaire dans un tube de microcentrification de deux millilitres.Conservez-le à cinq degrés Celsius pendant un maximum de 14 jours. Isolez un petit échantillon de la biopsie musculaire ou d’un muscle entier qui a un diamètre maximal d’un millimètre dans n’importe quelle direction et qui est plus long longitudinalement que transversalement. Placer l’échantillon dans le tube contenant la solution de fixation primaire froide.Conservez-le à cinq degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, lavez l’échantillon quatre fois dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 molaire. À l’aide de pipettes de transfert, retirez le tampon utilisé du tube en laissant l’échantillon intact et ajoutez le tampon frais.Post-fixer l’échantillon avec 1% de tétroxyde d’osmium et 1,5% de ferrocyanure de potassium dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 molaire pendant 120 minutes à quatre degrés Celsius. Rincer l’échantillon deux fois dans de l’eau distillée double à température ambiante. Déshydrater en s’immergeant dans une série graduée d’éthanol à température ambiante.Infiltrer l’échantillon avec de l’oxyde de propylène et des mélanges classés en résine epossique à température ambiante en utilisant les rapports de volume mentionnés. Le lendemain, incorporez des échantillons dans de la résine épsidique 100% fraîche dans des moules et polymérez à 60 degrés Celsius pendant 48 heures. Montez le bloc d’un spécimen sur le support ultramicrotome.Coupez le bloc à la surface avec une lame de rasoir pour atteindre le niveau des tissus. Montez un couteau à diamant devant l’échantillon et alignez la surface de l’échantillon parallèlement au couteau. Produire une section semi-mince d’un micromètre d’épaisseur avec le couteau à diamant pour vérifier l’orientation de l’échantillon.Tacher la section semi-mince avec du bleu de toluidine pour l’observation en microscopie optique. Ensuite, coupez le bloc plus loin pour réduire la zone d’intérêt afin d’obtenir des sections ultraminces appropriées. Découpez des sections ultraminces de 60 à 70 nanomètres d’épaisseur avec un deuxième couteau en diamant.Collectez une à deux sections sur une grille de cuivre entière à l’aide d’une boucle parfaite. Pour contraster les sections, immergez les grilles dans une solution d’acétate d’uranyle pendant 20 minutes et lavez les grilles dans de l’eau distillée double, puis immergez les grilles dans du citrate de plomb pendant 15 minutes et lavez à nouveau les grilles dans de l’eau distillée double. Allumez l’ordinateur de microscope électronique à transmission et le logiciel d’enregistrement d’images, enregistrez des images numériques avec une caméra CCD numérique à balayage lent et le logiciel d’imagerie associé.Après avoir inséré la grille avec plusieurs sections dans l’étage du microscope, filtrez d’abord la grille à faible grossissement pour choisir les sections de la meilleure qualité et déterminer la direction des fibres musculaires. Ensuite, faites la mise au point, l’image à un grossissement supérieur à 30 000 avec le faisceau centré sur une fibre périphérique dans la section et enregistrez les images avec un temps d’exposition d’une seconde au grossissement souhaité. Assurez-vous que les images sont réparties sur la longueur et la largeur de la fibre dans un ordre systématique aléatoire pour obtenir des résultats impartiaux et répétez l’imagerie jusqu’à ce que six à 10 fibres soient imagées.Importez des images dans l’image J en cliquant sur fichier suivi de l’ouverture. Définissez l’échelle globale pour qu’elle corresponde à la taille d’origine de l’image en cliquant sur Analyser, puis définissez l’échelle. Pour zoomer à 100%, cliquez sur l’image, allez sur zoom et cliquez sur dans.Mesurez l’épaisseur d’un disque Z par image de l’espace myofibrillaire à l’aide de l’outil Ligne droite du menu Outils et calculez l’épaisseur moyenne du disque Z de chacune des six à 10 fibres. Utilisez l’outil de ligne segmentée pour mesurer la longueur de la myofibrille la plus externe visible juste en dessous de la région sous-sarmate. Pour insérer une grille, cliquez sur analyser, sélectionnez outils, puis sélectionnez grille.Maintenant, définissez la surface par point à 32 400 nanomètres carrés. Comptez le nombre de hits dans la longueur disponible dans les 12 images sous-sarmateuses où un croisement frappe le glycogène sous-sarmol. Insérez une grille en cliquant sur analyser, puis sélectionnez les outils, puis la grille et définissez la surface par point à 160 000 nanomètres carrés.Comptez le nombre de coups dans les 12e images myofibrillaires où une croix frappe l’espace intramyofibrillaire. Là encore, pour insérer une grille, cliquez sur analyser, sélectionnez outils, puis sélectionnez grille. Maintenant, définissez la surface par point à 3 600 nanomètres carrés.Comptez le nombre de hits dans les 12èmes images myofibrillaires où un croisement frappe le glycogène intramyofibrillaire. Insérez une grille en cliquant sur analyser, puis sélectionnez des outils, puis grillez et définissez la surface par point à 32 400 nanomètres carrés. Comptez le nombre de hits dans les 12èmes images myofibrillaires où un croisement frappe le glycogène intermyofibrillaire.En utilisant la grille de 32 400 nanomètres carrés pour choisir au hasard les particules de glycogène, commencez par le carré supérieur gauche et déplacez-vous vers la gauche si nécessaire. À l’aide de l’outil en ligne droite, mesurez le diamètre de cinq particules de glycogène choisies au hasard de chaque pool pour chacune des 12 images afin d’obtenir une moyenne de 60 particules par pool et par fibre. Cette figure montre les valeurs normales des trois pools de glycogène.On peut observer que les valeurs de glycogène intermyofibrillaire sont distribuées près de la normale, alors que le glycogène intramyofibrillaire et sous-sarmateux montre une distribution asymétrique où les fibres ont parfois une quantité excessive de glycogène. Parmi toutes les étapes, il est très important d’utiliser du ferrocyanure de potassium. L’analyse du glycogène peut être combinée à l’analyse des gouttelettes de mitochondrie et de lipides, ce qui peut améliorer notre compréhension de la corrélation entre d’autres composants métaboliques clés et la santé musculaire.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Recherche

Biochimie

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Protocole amélioré pour l’immunoprécipitation de la chromatine du Muscle squelettique de souris

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse des anomalies induite par la β-amyloïde sur Structure de caillot de fibrine par spectroscopie et microscopie électronique à balayage

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Préparation de films de support d’échantillons en microscopie électronique à transmission à l’aide d’un bloc de flottaison de support

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micromodélisation de microscopie électronique à transmission pour diriger le positionnement des cellules dans les flux de travail de cryo-tomographie électronique à cellules entières

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mesure de la capacité d’importation de protéines des mitochondries du muscle squelettique

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

Détermination de la distribution de la longueur de la chaîne de glucane du glycogène à l’aide de la méthode d’électrophorèse des glucides assistée par fluorophore (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Collecte de routine d’ensembles de données cryo-EM haute résolution à l’aide d’un microscope électronique à transmission de 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Quantification à haut débit basée sur l’image de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...