Name: quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal Comitato Olimpico Svedese.

Il presente protocollo che utilizza campioni di muscolo scheletrico bioptico umano è stato approvato dai Comitati regionali per l'etica della ricerca sanitaria per la Danimarca meridionale (S-20170198). Le biopsie muscolari sono state ottenute attraverso un'incisione nella pelle dal muscolo vasto laterale utilizzando un ago bergström con aspirazione dopo che l'anestesia locale è stata somministrata per via sottocutanea (1-3 ml di lidocaina 2% per incisione). Se sono stati utilizzati muscoli interi di ratto is...

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	<li>Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+life+of+the+glycogen+granule.">The dynamic life of the glycogen granule.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).</li><li>Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+glycogen+depletion+pattern+in+human+muscle+fibres+after+exercise+of+varying+intensity+and+at+varying+pedalling+rates.">Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates.</a> Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).</li><li>James, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+both+aerobic+glycolysis+and+Na+-K+-ATPase+activity+in+skeletal+muscle+by+epinephrine+or+amylin.">Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).</li><li>Jensen, R., Nielsen, J., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+glycogenolysis+prolongs+action+potential+repriming+period+and+impairs+muscle+function+in+rat+skeletal+muscle.">Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle.</a> Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).</li><li>Green, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+important+is+endogenous+muscle+glycogen+to+fatigue+in+prolonged+exercise.">How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).</li><li>Fitts, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+muscle+fatigue.">Cellular mechanisms of muscle fatigue.</a> Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).</li><li>Wanson, J. 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Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li><li>Thiery, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+polysaccharides+on+thin+sections+by+electron+microscopy.">Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).</li><li>De Bruijn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen,+its+chemistry+and+morphologic+appearance+in+the+electron+microscope.+I.+A+modified+OsO4+fixative+which+selectively+contrasts+glycogen.">Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen.</a> Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).</li><li>Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+accumulation+in+polymorphonuclear+leukocytes,+and+other+intracellular+alterations+that+occur+during+inflammation.">Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation.</a> The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).</li><li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes+-+the+organelles+of+glycogen+metabolism.">Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li><li>Gadisseux, J. 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A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus.</a> Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).</li><li>Frid&#233;n, J., Seger, J., Ekblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+periodic+acid-thiosemicarbazide-silver+proteinate+staining+for+ultrastructural+assessment+of+muscle+glycogen+utilization+during+exercise.">Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise.</a> Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+subcellular+glycogen+in+resting+human+muscle:+granule+size,+number,+and+location.">Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location.</a> Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+muscle+glycogen+granules+size+and+number+in+subcellular+locations+during+recovery+from+prolonged+exercise.">Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise.</a> Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).</li><li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Glycogenolysis+Modulates+Histone+Acetylation+in+Human+Non-Small+Cell+Lung+Cancers.">Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).</li><li>Jensen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+subcellular+muscle+glycogen+utilisation+during+exercise+impacts+endurance+capacity+in+men.">Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men.</a> Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).</li><li>Nielsen, J., Schr&#248;der, H. D., Rix, C. G., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+subcellular+glycogen+localization+on+tetanic+relaxation+time+and+endurance+in+mechanically+skinned+rat+skeletal+muscle+fibres.">Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).</li><li>Nielsen, J., Cheng, A. 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D., Saltin, B., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+glycogen+utilization+in+exhaustive+exercise:+role+of+subcellular+localization+and+fibre+type.">Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type.</a> Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).</li><li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new,+simple+and+efficient+stereological+methods+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).</li><li>Saltin, B., Gollnick, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+adaptability:+significance+for+metabolism+and+performance.">Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance.</a> Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).</li><li>Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-dependent+decrements+in+skeletal+muscle+glycogen+and+mitochondria+content+following+short-term+disuse+in+young+and+old+men.">Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).</li><li>Hokken, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-+and+fibre+type-dependent+utilization+of+muscle+glycogen+during+heavy+resistance+exercise+in+elite+power+and+Olympic+weightlifters.">Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters.</a> Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).</li><li>Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glycogen+storage+of+a+subcellular+hot+spot+in+human+skeletal+muscle+during+early+recovery+from+eccentric+contractions.">Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions.</a> PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).</li><li>Sj&#246;str&#246;m, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analyses+of+human+muscle+fiber+types.">Morphometric analyses of human muscle fiber types.</a> Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).</li><li>Gejl, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+depletion+of+glycogen+with+supramaximal+exercise+in+human+skeletal+muscle+fibres.">Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).</li><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li></ol>

Il passaggio critico del metodo è l'uso di osmio ridotto da ferrocianuro di potassio durante la post-fissazione. La selettività di questo fissativo modificato per il rilevamento del glicogeno non può essere completamente spiegata dalla chimica, ma include anche risultati sperimentali che dimostrano che non è stata rilevata alcuna particella in tessuti noti per essere privi di glicogeno o nello spazio extracellulare11.
I parametri critici sono la precisione delle sti...

Le particelle di glicogeno sono composte da polimeri ramificati di glucosio e varie proteine associate1 e costituiscono un combustibile importante durante le elevate richieste metaboliche2. Sebbene non ampiamente riconosciute, le particelle di glicogeno costituiscono anche un combustibile locale, dove alcuni processi subcellulari utilizzano preferenzialmente il glicogeno nonostante la disponibilità di altri e più combustibili di lunga durata come il glucosio plasmatico e gli acidi grassi3,4.
L'importanza di immagazzinare il glicogeno come combustibile localizzato specifico subcellulare è stata discussa in diverse revisioni5,6 basate principalmente su alcune delle prime documentazioni sulla distribuzione subcellulare del glicogeno mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM)7,8. I primi studi hanno utilizzato protocolli diversi per aumentare il contrasto del glicogeno dalle tecniche di colorazione istochimica alle colorazioni negative e positive9,10. Un importante sviluppo metodologico è stato il raffinato protocollo post-fissazione con l'osmio a ridotto ferrocianuro di potassio11,12,13,14, che ha migliorato significativamente il contrasto delle particelle di glicogeno. Questo protocollo raffinato non è stato utilizzato in alcuni dei lavori pionieristici sulla deplezione del glicogeno indotta dall'esercizio15, ma è stato reintrodotto da Graham e colleghi16,17.
Sulla base delle immagini a 2 dimensioni, la distribuzione subcellulare del glicogeno è più spesso descritta come particelle di glicogeno situate in tre pool: subsarcolemmale (appena sotto la membrana superficiale), intermiofibrillare (tra le miofibrille) o intramiofibrillare (all'interno delle miofibrille). Tuttavia, le particelle di glicogeno potrebbero anche essere descritte come associate, ad esempio, al reticolo sarcoplasmatico7 o ai nuclei18. Oltre alla distribuzione subcellulare, il vantaggio del contenuto di glicogeno stimato da TEM è anche che la quantificazione può essere condotta a livello di singola fibra. Ciò consente lo studio della variabilità da fibra a fibra e analisi correlative con tipi di fibre e componenti cellulari come mitocondri e goccioline lipidiche.
Qui, viene descritto il protocollo per il contenuto volumetrico specifico del tipo di fibra stimato TEM dei tre pool subcellulari comuni di glicogeno (subsarcolemmale, intermiofibrillare e intramiofibrillare) nelle fibre muscolari scheletriche. Il metodo è stato applicato ai muscoli scheletrici degli esseri umani19, ratti20 e topi21; così come uccelli e pesci22; e cardiomiociti da ratti23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Propylene oxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-56-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding 812 resin medium kit</td>
			<td>Taab</td>
			<td>T031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04239.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITEM</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM AC20</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Automatic contrasting system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSIS Veleta digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>0972A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM 100 Transmission EM</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455989-245G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4</td>
			<td>Ampliqon.com</td>
			<td>AMPQ40989.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-microtome Leica UC7</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>6159-44-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy

Con l'uso della microscopia elettronica a trasmissione, è possibile ottenere immagini ad alta risoluzione di campioni fissi contenenti singole fibre muscolari. Ciò consente di quantificare aspetti ultrastrutturali come frazioni di volume, rapporti superficie/volume, morfometria e siti di contatto fisico di diverse strutture subcellulari. Nel 1970, un protocollo per la colorazione migliorata del glicogeno nelle cellule è stato sviluppato e ha aperto la strada a una serie di studi sulla localizzazione subcellulare della dimensione delle particelle di glicogeno e glicogeno utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione. Mentre la maggior parte delle analisi interpreta il glicogeno come se fosse distribuito in modo omogeneo all'interno delle fibre muscolari, fornendo solo un singolo valore (ad esempio, una concentrazione media), la microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato che il glicogeno è immagazzinato come particelle di glicogeno discrete situate in compartimenti subcellulari distinti. Qui, viene descritto il protocollo passo-passo dalla raccolta dei tessuti alla determinazione quantitativa della frazione di volume e del diametro delle particelle del glicogeno nei distinti compartimenti subcellulari delle singole fibre muscolari scheletriche. Considerazioni su come 1) raccogliere e macchiare campioni di tessuto, 2) eseguire analisi di immagini e gestione dei dati, 3) valutare la precisione delle stime, 4) discriminare tra i tipi di fibre muscolari e 5) sono incluse insidie e limitazioni metodologiche.

Utilizzando questo protocollo, le particelle di glicogeno appaiono nere e distinte (Figure 1 e Figura 2). I valori normali del glicogeno sono rappresentati nella Figura 3. Questi dati si basano su un totale di 362 fibre di 41 giovani uomini sani come raccolto in diversi studi precedenti19,24,29,30,31....

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Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Una procedura post-fissazione modificata aumenta il contrasto delle particelle di glicogeno nei tessuti. Questo documento fornisce un protocollo passo-passo che descrive come gestire il tessuto, condurre l'imaging e utilizzare metodi stereologici per ottenere dati imparziali e quantitativi sulla distribuzione del glicogeno subcellulare specifico della fibra nel muscolo scheletrico.

Quantificazione della distribuzione subcellulare del glicogeno nelle fibre muscolari scheletriche mediante microscopia elettronica a trasmissione

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

La misura del contenuto di glicogeno nelle singole cellule e nelle organizzazioni subcellulari è importante perché nella maggior parte dei tipi di cellule, le singole cellule si adattano in modo diverso alle mutevoli condizioni fisiologiche e alle malattie. Quindi, il vantaggio principale di questa tecnica è l'altissima risoluzione nel microscopio elettronico a trasmissione. Questo migliora la possibilità di avere strutture subcellulari localizzate e anche in questo contenuto in questa tecnica qui, è importante che la colorazione del glicogeno sia priva di anticorpi.Quindi, non abbiamo alcuna specificità di cui preoccuparci. Per ottenere un migliore contrasto sul glicogeno, basta usare il ferrocianuro di potassio all'1,5% invece del ferrocianuro di potassio. Preparare 1,6 millilitri della soluzione fissativa primaria aggiungendo il 2,5% di glutaraldeide in un tampone di cacodilato di sodio molare da 0,1 millilitri in un tubo di microcentrificazione da due millilitri.Conservalo a cinque gradi Celsius per un massimo di 14 giorni. Isolare un piccolo campione dalla biopsia muscolare o da un intero muscolo che ha un diametro massimo di un millimetro in qualsiasi direzione ed è più lungo longitudinalmente che in sezione trasversale. Posizionare il campione nel tubo contenente la soluzione di fissazione primaria fredda.Conservalo a cinque gradi Celsius per 24 ore. Quindi lavare il campione quattro volte in 0,1 tampone di cacodilato di sodio molare. Utilizzando pipette di trasferimento, rimuovere il buffer utilizzato dal tubo lasciando intatto il campione e aggiungere il buffer fresco.Post-fissare il campione con 1% di tetrossido di osmio e 1,5% di ferrocianuro di potassio in tampone di cacodilato di sodio molare 0,1% per 120 minuti a quattro gradi Celsius. Risciacquare il campione due volte in acqua distillata doppia a temperatura ambiente. Disidratare immergendo in una serie graduata di etanolo a temperatura ambiente.Infiltrare il campione con miscele classificate di ossido di propilene e resina epossidica a temperatura ambiente utilizzando i rapporti di volume menzionati. Il giorno seguente, incorporare campioni in resina epossidica fresca al 100% in stampi e polimerizzare a 60 gradi Celsius per 48 ore. Montare il blocco di un campione sul supporto dell'ultramicrotoma.Tagliare il blocco sulla superficie con una lama di rasoio per raggiungere il livello del tessuto. Montare un coltello diamantato davanti al campione e allineare la superficie del campione parallelamente al coltello. Produrre una sezione semisottile di uno spessore micrometrico con il coltello diamantato per controllare l'orientamento del campione.Macchiare la sezione semisottile con toluidina blu per l'osservazione con microscopia ottica. Quindi tagliare ulteriormente il blocco per ridurre l'area di interesse per ottenere sezioni ultrasottili adeguate. Tagliare sezioni ultrasottili da 60 a 70 nanometri di spessore con un secondo coltello diamantato.Raccogli una o due sezioni su un'intera griglia di rame usando un loop perfetto. Per contrastare le sezioni, immergere le griglie in soluzione di acetato di uranile per 20 minuti e lavare le griglie in acqua a doppio distillato e quindi immergere le griglie in citrato di piombo per 15 minuti e lavare nuovamente le griglie in acqua a doppia distillazione. Accendere il computer al microscopio elettronico a trasmissione e il software di registrazione delle immagini, registrare immagini digitali con una fotocamera CCD digitale a scansione lenta e il software di imaging associato.Dopo aver inserito la griglia con più sezioni nello stadio del microscopio, schermare la griglia inizialmente a basso ingrandimento per scegliere le sezioni di migliore qualità e determinare la direzione delle fibre muscolari. Messa a fuoco successiva, l'immagine a ingrandimento superiore a 30.000 con il raggio centrato su una fibra periferica nella sezione e registrare le immagini con un secondo di esposizione all'ingrandimento desiderato. Assicurarsi che le immagini siano distribuite su tutta la lunghezza e la larghezza della fibra in un ordine sistematico bot randomizzato per ottenere risultati imparziali e ripetere l'imaging fino a quando non vengono visualizzate da sei a 10 fibre.Importa le immagini nell'immagine J facendo clic su file seguito da apri. Imposta la scala globale in modo che corrisponda alle dimensioni originali dell'immagine facendo clic su Analizza e quindi imposta scala. Per ingrandire al 100% fare clic sull'immagine, andare ingrandi e fare clic su in.Misurare lo spessore di un disco Z per immagine dello spazio miofibrillare utilizzando lo strumento linea retta dal menu strumenti e calcolare lo spessore medio del disco Z di ciascuna delle sei-10 fibre. Utilizzare lo strumento linea segmentata per misurare la lunghezza della miofibrilla più esterna visibile appena sotto la regione subsarcolemmale. Per inserire una griglia, fare clic su Analizza, selezionare strumenti e quindi selezionare griglia.Ora imposta l'area per punto a 32.400 nanometri quadrati. Conta il numero di colpi entro la lunghezza disponibile nelle 12 immagini subsarcolemmali in cui una croce colpisce il glicogeno subsarcolemmale. Inserisci una griglia facendo clic su analizza, quindi seleziona strumenti, quindi griglia e imposta l'area per punto a 160.000 nanometri quadrati.Conta il numero di colpi nella 12a immagine miofibrillare in cui una croce colpisce lo spazio intramiofibrillare. Quindi di nuovo, per inserire una griglia, fare clic su Analizza, selezionare strumenti e quindi selezionare griglia. Ora imposta l'area per punto a 3.600 nanometri quadrati.Conta il numero di colpi nella 12a immagine miofibrillare in cui una croce colpisce il glicogeno intramiofibrillare. Inserisci una griglia facendo clic su Analizza, quindi seleziona strumenti, quindi griglia e imposta l'area per punto a 32.400 nanometri quadrati. Conta il numero di colpi nella 12a immagine miofibrillare in cui una croce colpisce il glicogeno intermiofibrillare.Utilizzando la griglia di 32.400 nanometri quadrati per scegliere casualmente le particelle di glicogeno, iniziare con il quadrato in alto a sinistra e spostarsi a sinistra se necessario. Utilizzando lo strumento linea retta, misurare il diametro di cinque particelle di glicogeno scelte casualmente di ciascun pool per ciascuna delle 12 immagini per ottenere una media di 60 particelle per pool per fibra. Questa figura mostra i valori normali dei tre pool di glicogeno.Si può osservare che i valori del glicogeno intermiofibrillare sono distribuiti vicino al normale, mentre sia il glicogeno intramiofibrillare che quello subsarcolemmale mostrano una distribuzione distorta in cui le fibre a volte hanno una quantità eccessiva di glicogeno. Tra tutti i passaggi è molto importante utilizzare ferrocianuro di potassio. L'analisi del glicogeno può essere combinata con l'analisi dei mitocondri e delle goccioline lipidiche che possono migliorare la nostra comprensione di come altri componenti metabolici chiave siano correlati con il glicogeno e la salute muscolare.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Ricerca

Biochimica

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal Mouse del muscolo scheletrico

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analisi delle anomalie indotta da β-amiloide sulla struttura di coagulo di fibrina di spettroscopia e microscopia elettronica a scansione

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Preparazione di film di supporto campione in microscopia elettronica a trasmissione utilizzando un blocco di galleggiamento di supporto

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Griglie per dirigere il posizionamento delle cellule all'interno dei flussi di lavoro della tomografia crioelettronica a cellule intere

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Misurazione della capacità di importazione di proteine dei mitocondri del muscolo scheletrico

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

Determinazione della distribuzione della lunghezza della catena glucano del glicogeno utilizzando il metodo dell'elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Raccolta di routine di set di dati crio-EM ad alta risoluzione utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione da 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...