Name: quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00
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この作業はスウェーデンオリンピック委員会の支援を受けた。

ヒト生検された骨格筋サンプルを用いた本プロトコールは、デンマーク南部の健康研究倫理に関する地域委員会(S-20170198)によって承認された。筋生検は、局所麻酔が皮下投与された後に吸引されたベルグストローム針を用いて バストゥス側方 筋から皮膚の切開を通して得られた(切開部あたり2%のリドカイン1〜3mL)。単離されたラット全筋肉を使用した場合、デンマークのオーデンセ大...

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	<li>Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+life+of+the+glycogen+granule.">The dynamic life of the glycogen granule.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).</li><li>Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+glycogen+depletion+pattern+in+human+muscle+fibres+after+exercise+of+varying+intensity+and+at+varying+pedalling+rates.">Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates.</a> Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).</li><li>James, J. 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Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li><li>Thiery, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+polysaccharides+on+thin+sections+by+electron+microscopy.">Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).</li><li>De Bruijn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen,+its+chemistry+and+morphologic+appearance+in+the+electron+microscope.+I.+A+modified+OsO4+fixative+which+selectively+contrasts+glycogen.">Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen.</a> Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).</li><li>Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+accumulation+in+polymorphonuclear+leukocytes,+and+other+intracellular+alterations+that+occur+during+inflammation.">Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation.</a> The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).</li><li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes+-+the+organelles+of+glycogen+metabolism.">Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li><li>Gadisseux, J. F., Evrard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-neuronal+relationship+in+the+developing+central+nervous+system.+A+histochemical-electron+microscope+study+of+radial+glial+cell+particulate+glycogen+in+normal+and+reeler+mice+and+the+human+fetus.">Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus.</a> Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).</li><li>Frid&#233;n, J., Seger, J., Ekblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+periodic+acid-thiosemicarbazide-silver+proteinate+staining+for+ultrastructural+assessment+of+muscle+glycogen+utilization+during+exercise.">Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise.</a> Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+subcellular+glycogen+in+resting+human+muscle:+granule+size,+number,+and+location.">Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location.</a> Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+muscle+glycogen+granules+size+and+number+in+subcellular+locations+during+recovery+from+prolonged+exercise.">Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise.</a> Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).</li><li>Sun, R. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+depletion+of+glycogen+with+supramaximal+exercise+in+human+skeletal+muscle+fibres.">Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).</li><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li></ol>

この方法の重要なステップは、固定後におけるフェロシアン化カリウムによる還元オスミウムの使用である。グリコーゲン検出のためのこの修飾固定液の選択性は、化学によって完全に説明することはできませんが、グリコーゲンを含まないことが知られている組織または細胞外空間においてそのような粒子が検出されないことを実証する実験的知見も含まれています11。</...

グリコーゲン粒子は、グルコースと様々な関連タンパク質1の分岐ポリマーで構成されており、代謝要求が高い2際に重要な燃料を構成しています。広く認識されていないが、グリコーゲン粒子はまた、血漿グルコースおよび脂肪酸として他のより長期持続性の燃料が利用可能であるにもかかわらず、いくつかの細胞内プロセスがグリコーゲンを優先的に利用する局所燃料を構成する3,4。
グリコーゲンを細胞内特異的局在化燃料として貯蔵することの重要性は、主に透過型電子顕微鏡(TEM)7,8によるグリコーゲンの細胞内分布に関する初期の文書のいくつかに基づいて、いくつかのレビュー5,6で議論されている7,8。最初の研究では、組織化学染色技術から陰性および陽性染色へのグリコーゲンのコントラストを高めるために、異なるプロトコールを使用しました9,10。重要な方法論的発展は、フェロシアン化カリウム還元オスミウム11,12,13,14による精製された固定後プロトコルであり、グリコーゲン粒子のコントラストを有意に改善した。この洗練されたプロトコルは、運動誘発グリコーゲン枯渇に関する先駆的な研究の一部では使用されず15、グラハムと同僚によって再導入されました16,17。
2次元画像に基づいて、グリコーゲンの細胞内分布は、サルコレンマル下(表面膜のすぐ下)、筋原線維間(筋原線維間)、または筋原線維内(筋原線維内)の3つのプールに位置するグリコーゲン粒子として最も頻繁に記述される。しかしながら、グリコーゲン粒子は、例えば筋小胞体7またはnuclei18に関連するものとして記述することもできる。細胞内分布に加えて、TEM推定グリコーゲン含有量の利点は、単繊維レベルで定量を行うことができることである。これにより、繊維間変動性の調査や、ミトコンドリアや脂肪滴などの繊維タイプや細胞成分との相関解析が可能になります。
ここでは、骨格筋線維におけるグリコーゲンの3つの一般的な細胞内プール(筋筋下、筋原線維間、および筋原線維内)のTEM推定線維型特異的体積含量に関するプロトコールが記載されている。この方法は、ヒト19、ラット20、およびマウス21の骨格筋に適用されている。鳥や魚だけでなく22;ラット由来の心筋細胞23。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Propylene oxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-56-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding 812 resin medium kit</td>
			<td>Taab</td>
			<td>T031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04239.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITEM</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM AC20</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Automatic contrasting system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSIS Veleta digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>0972A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM 100 Transmission EM</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455989-245G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4</td>
			<td>Ampliqon.com</td>
			<td>AMPQ40989.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-microtome Leica UC7</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>6159-44-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy

透過型電子顕微鏡を用いることで、個々の筋線維を含む固定試料の高解像度画像を得ることができる。これにより、体積分率、表面積対体積比、モルフォメトリー、および異なる細胞内構造の物理的接触部位などの超構造的側面の定量化が可能になる。1970年代には、細胞内のグリコーゲンの染色を強化するためのプロトコルが開発され、透過型電子顕微鏡を用いたグリコーゲンおよびグリコーゲン粒子径の細胞内局在化に関する一連の研究への道を開いた。ほとんどの分析では、グリコーゲンが筋線維内に均質に分布しているかのように解釈され、単一の値(例えば、平均濃度)しか提供されないが、透過型電子顕微鏡は、グリコーゲンが別個の細胞内区画に位置する個別のグリコーゲン粒子として保存されることが明らかになった。ここでは、組織採取から個々の骨格筋線維の別個の細胞内区画におけるグリコーゲンの体積分率および粒子径の定量的決定までの段階的なプロトコールが記載されている。1)組織標本の収集と染色、2)画像解析とデータ処理の実行、3)推定値の精度の評価、4)筋線維タイプの識別、5)方法論的な落とし穴と限界に関する考慮事項が含まれています。

このプロトコルを使用すると、グリコーゲン粒子は黒くはっきりと見えます(図1および図2)。グリコーゲンの正常値を図3に示します。これらのデータは、異なる先行研究で収集された41人の健康な若い男性からの合計362本の繊維に基づいている19、24、29、<sup class="x...

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Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

修正された固定後手順は、組織中のグリコーゲン粒子のコントラストを増加させる。この論文は、組織を処理し、イメージングを行い、立体学的方法を使用して骨格筋における繊維型特異的な細胞内グリコーゲン分布に関する偏りのない定量的データを得る方法を説明するステップバイステップのプロトコルを提供する。

透過型電子顕微鏡による骨格筋線維の細胞内グリコーゲン分布の定量化

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

単一細胞および細胞内組織におけるグリコーゲン含有量の測定は、ほとんどの細胞タイプにおいて、単一細胞が変化する生理学的状態および疾患に異なる方法で適応するため、重要である。したがって、この技術の主な利点は、透過型電子顕微鏡における非常に高い分解能である。これは、局在化した細胞下構造を有する可能性を改善し、またここでのこの技術におけるこの含有量において、グリコーゲン染色が抗体フリーであることが重要である。だから、私たちは心配する特異性を持っていません。グリコーゲンのコントラストを良くするには、フェロシアン化カリウムの代わりにフェロシアン化カリウム1.5%を使用してください。2ミリリットルのマイクロセントリフィケーションチューブ内の0.1モルカコジル酸ナトリウム緩衝液中の2.5%グルタルアルデヒドを添加することによって、1.6ミリリットルの一次固定液溶液を調製する。摂氏5度で最大14日間保管してください。筋肉生検または筋肉全体から、任意の方向に最大直径が1ミリメートルで、断面よりも縦方向に長い小さな標本を単離する。冷一次固定液を入れたチューブに検体を入れる。摂氏5度で24時間保管してください。次いで、検体を0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で4回洗浄する。トランスファーピペットを使用して、使用済みのバッファーをチューブから取り出し、検体に触れずに、新しいバッファーを追加します。検体を1%四酸化オスミウムと1.5%フェロシアン化カリウムを0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液中で摂氏4度で120分間固定した。室温の二重蒸留水で検体を2回すすいでください。室温で段階的な一連のエタノールに沈めることによって脱水する。前述の体積比を使用して、室温でプロピレンオキシドおよびエポシディック樹脂グレーディング混合物で試料を浸潤させる。翌日、100%新鮮なエポシディック樹脂に試料を型に埋め込み、摂氏60度で48時間重合します。試料のブロックをウルトラミクロトームホルダーに取り付けます。表面のブロックをカミソリの刃でトリミングして、組織レベルに達します。ダイヤモンドナイフをサンプルの前に取り付け、サンプル表面をナイフに平行に揃えます。ダイヤモンドナイフで厚さ1マイクロメートルの半薄切片を作り、サンプルの向きを確認します。半薄切片をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で観察する。次に、ブロックをさらにトリミングして関心領域を縮小し、適切な超薄断面を取得します。厚さ60~70ナノメートルの極薄切片を2本目のダイヤモンドナイフで切断する。完璧なループを使用して、1つの銅グリッド全体に1〜2つのセクションを収集します。セクションを対比するために、グリッドを酢酸ウラニル溶液に20分間浸漬し、グリッドを二重蒸留水で洗浄してから、グリッドをクエン酸鉛に15分間浸漬し、グリッドを二重蒸留水で再洗浄する。透過型電子顕微鏡コンピュータと画像記録ソフトウェアの電源を入れ、デジタルスロースキャンCCDカメラと関連するイメージングソフトウェアでデジタル画像を記録します。顕微鏡ステージに複数の切片を持つグリッドを挿入した後、最初に低倍率でグリッドをスクリーニングして最高品質の断面を選択し、筋線維の方向を決定します。次に焦点を合わせ、断面内の周辺繊維を中心とするビームを用いて30,000を超える倍率で画像を作成し、所望の倍率で1秒の露光時間で画像を記録する。画像がランダム化されたボットの体系的な順序でファイバーの長さと幅に分散されていることを確認し、偏りのない結果を得て、6 ~ 10 本のファイバーが画像化されるまでイメージングを繰り返します。画像Jに画像をインポートするには、ファイルをクリックしてから開きます。[分析]をクリックして、画像の元のサイズと一致するようにグローバルスケールを設定し、スケールを設定します。画像を100%クリックするには、ズームに移動してクリックします。ツールメニューから直線ツールを使用して筋原線維空間の画像ごとに1枚のZディスクの厚さを測定し、6〜10本の繊維の平均Zディスク厚さを計算します。セグメント化された線ツールを使用して、サブサルコレム領域のすぐ下に見える最も外側の筋原線維の長さを測定します。グリッドを挿入するには、[分析]をクリックし、[ツール]を選択してから[グリッド]を選択します。次に、ポイントあたりの面積を32,400平方ナノメートルに設定します。十字がサブサルコレンマルグリコーゲンに当たる12のサブサルコレンマル画像で利用可能な長さ内のヒット数を数えます。[解析]をクリックしてグリッドを挿入し、ツールを選択してからグリッドを挿入し、ポイントあたりの面積を160,000平方ナノメートルに設定します。十字が筋原線維内空間に当たる第12の筋原線維画像におけるヒット数を数える。もう一度、グリッドを挿入するには、[分析]をクリックし、ツールを選択してから[グリッド]を選択します。次に、ポイントあたりの面積を3,600平方ナノメートルに設定します。筋原線維内グリコーゲンに十字が当たる第12筋原線維画像におけるヒット数をカウントする。[解析]をクリックしてグリッドを挿入し、ツールを選択してからグリッドを選択し、ポイントあたりの面積を32,400平方ナノメートルに設定します。クロスが筋原線維間グリコーゲンに当たる第12の筋原線維画像におけるヒット数を数える。32、400平方ナノメートルのグリッドを使用してグリコーゲン粒子をランダムに選択し、左上の正方形から始めて、必要に応じて左に移動します。直線ツールを使用して、12枚の画像のそれぞれについて各プールのランダムに選択された5つのグリコーゲン粒子の直径を測定し、繊維当たりプール当たり平均60個の粒子を得た。この図は、3つのグリコーゲンプールの正常値を示す。筋原線維間グリコーゲン値は正常に近い分布を示すが、筋原線維内グリコーゲンおよびサブサルコレンマルグリコーゲンの両方が、繊維が時々過剰な量のグリコーゲンを有する歪んだ分布を示すことが観察され得る。すべてのステップの中で、フェロシアン化カリウムを使用することは非常に重要です。グリコーゲンの分析は、ミトコンドリアおよび脂肪滴の分析と組み合わせることができ、他の重要な代謝成分がグリコーゲンおよび筋肉の健康とどのように相関するかの理解を改善することができる。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

支持浮遊ブロックを用いた透過電子顕微鏡におけるサンプル支持膜の作製

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

全細胞クライオ電子断層撮影ワークフロー内での細胞位置のダイレクト位置を測定するマイクロパターン化透過電子顕微鏡グリッド

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

骨格筋ミトコンドリアのタンパク質輸入能の測定

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

フルオロフォアアシスト炭水化物電気泳動(FACE)法を用いたグリコーゲンのグルカン鎖長分布の決定

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200KV透過型電子顕微鏡を用いた高分解能クライオEMデータセットのルーチンコレクション

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...