Name: quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Den svenske olympiske komité.

Dagens protokoll med humane biopsied skjelettmuskulaturprøver ble godkjent av Regionale komiteer for helseforskningsetikk for Sør-Danmark (S-20170198). Muskelbiopsier ble oppnådd gjennom et snitt i huden fra den enorme lateralismuskelen ved hjelp av en Bergström nål med sug etter at lokalbedøvelse ble gitt subkutant (1-3 ml Lidokain 2% per snitt). Hvis isolerte hele rottemuskler ble brukt, ble dyrene ofret av cervical dislokasjon før muskelbiopsiene ble oppnådd, i samsvar med retningslinjene fra dyreetik...

<ol>
	<li>Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+life+of+the+glycogen+granule.">The dynamic life of the glycogen granule.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).</li><li>Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+glycogen+depletion+pattern+in+human+muscle+fibres+after+exercise+of+varying+intensity+and+at+varying+pedalling+rates.">Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates.</a> Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).</li><li>James, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+both+aerobic+glycolysis+and+Na+-K+-ATPase+activity+in+skeletal+muscle+by+epinephrine+or+amylin.">Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).</li><li>Jensen, R., Nielsen, J., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+glycogenolysis+prolongs+action+potential+repriming+period+and+impairs+muscle+function+in+rat+skeletal+muscle.">Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle.</a> Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).</li><li>Green, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+important+is+endogenous+muscle+glycogen+to+fatigue+in+prolonged+exercise.">How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).</li><li>Fitts, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+muscle+fatigue.">Cellular mechanisms of muscle fatigue.</a> Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).</li><li>Wanson, J. C., Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+glycogen+metabolism.">Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism.</a> Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).</li><li>Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+the+human+brachial+biceps+muscle.">Fiber types in the human brachial biceps muscle.</a> Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).</li><li>Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+glycogen.+Electron+microscopic+study+of+the+negative+stains+of+particulate+glycogen.">Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li><li>Thiery, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+polysaccharides+on+thin+sections+by+electron+microscopy.">Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).</li><li>De Bruijn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen,+its+chemistry+and+morphologic+appearance+in+the+electron+microscope.+I.+A+modified+OsO4+fixative+which+selectively+contrasts+glycogen.">Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen.</a> Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).</li><li>Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+accumulation+in+polymorphonuclear+leukocytes,+and+other+intracellular+alterations+that+occur+during+inflammation.">Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation.</a> The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).</li><li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes+-+the+organelles+of+glycogen+metabolism.">Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li><li>Gadisseux, J. F., Evrard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-neuronal+relationship+in+the+developing+central+nervous+system.+A+histochemical-electron+microscope+study+of+radial+glial+cell+particulate+glycogen+in+normal+and+reeler+mice+and+the+human+fetus.">Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus.</a> Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).</li><li>Frid&#233;n, J., Seger, J., Ekblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+periodic+acid-thiosemicarbazide-silver+proteinate+staining+for+ultrastructural+assessment+of+muscle+glycogen+utilization+during+exercise.">Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise.</a> Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+subcellular+glycogen+in+resting+human+muscle:+granule+size,+number,+and+location.">Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location.</a> Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+muscle+glycogen+granules+size+and+number+in+subcellular+locations+during+recovery+from+prolonged+exercise.">Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise.</a> Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).</li><li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Glycogenolysis+Modulates+Histone+Acetylation+in+Human+Non-Small+Cell+Lung+Cancers.">Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).</li><li>Jensen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+subcellular+muscle+glycogen+utilisation+during+exercise+impacts+endurance+capacity+in+men.">Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men.</a> Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).</li><li>Nielsen, J., Schr&#248;der, H. D., Rix, C. G., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+subcellular+glycogen+localization+on+tetanic+relaxation+time+and+endurance+in+mechanically+skinned+rat+skeletal+muscle+fibres.">Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).</li><li>Nielsen, J., Cheng, A. J., &#216;rtenblad, N., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+glycogen+and+decreased+tetanic+Ca2++in+fatigued+single+intact+mouse+muscle+fibres.">Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).</li><li>Mead, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+constraints+in+synchronous+muscle+limit+superfast+motor+control+in+vertebrates.">Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates.</a> eLife. 6, 29425 (2017).</li><li>Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., &#216;rtenblad, N., B&#248;tker, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+subcellular+glycogen+distribution+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling:+effects+of+ischaemia,+reperfusion+and+ischaemic+preconditioning.">Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning.</a> Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).</li><li>Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schr&#248;der, H. D., Saltin, B., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+glycogen+utilization+in+exhaustive+exercise:+role+of+subcellular+localization+and+fibre+type.">Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type.</a> Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).</li><li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new,+simple+and+efficient+stereological+methods+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).</li><li>Saltin, B., Gollnick, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+adaptability:+significance+for+metabolism+and+performance.">Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance.</a> Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).</li><li>Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-dependent+decrements+in+skeletal+muscle+glycogen+and+mitochondria+content+following+short-term+disuse+in+young+and+old+men.">Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).</li><li>Hokken, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-+and+fibre+type-dependent+utilization+of+muscle+glycogen+during+heavy+resistance+exercise+in+elite+power+and+Olympic+weightlifters.">Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters.</a> Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).</li><li>Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glycogen+storage+of+a+subcellular+hot+spot+in+human+skeletal+muscle+during+early+recovery+from+eccentric+contractions.">Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions.</a> PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).</li><li>Sj&#246;str&#246;m, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analyses+of+human+muscle+fiber+types.">Morphometric analyses of human muscle fiber types.</a> Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).</li><li>Gejl, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+depletion+of+glycogen+with+supramaximal+exercise+in+human+skeletal+muscle+fibres.">Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).</li><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li></ol>

Det kritiske trinnet i metoden er bruk av redusert osmium ved kaliumferrocyanid under etterfiksering. Selektiviteten til dette modifiserte fikseringsmiddelet for glykogendeteksjon kan ikke forklares fullt ut av kjemi, men inkluderer også eksperimentelle funn som ikke viser noen deteksjon av slike partikler i vev som er kjent for å være fri for glykogen eller i det ekstracellulære rommet11.
Kritiske parametere er presisjonen til estimatene og fiber-til-fiber-variasjo...

Glykogenpartikler består av forgrenede polymerer av glukose og ulike tilknyttede proteiner1 og utgjør et viktig drivstoff under høye metabolske krav2. Selv om det ikke er allment anerkjent, utgjør glykogenpartikler også et lokalt drivstoff, hvor noen subcellulære prosesser fortrinnsvis bruker glykogen til tross for tilgjengeligheten av andre og mer langvarige drivstoff som plasmaglukose og fettsyrer3,4.
Betydningen av å lagre glykogen som et subcellulært spesifikt lokalisert drivstoff har blitt diskutert i flere vurderinger5,6 hovedsakelig basert på noen av de tidligste dokumentasjonene av den subcellulære fordelingen av glykogen ved overføringselektronmikroskopi (TEM)7,8. De første studiene brukte forskjellige protokoller for å øke kontrasten til glykogen fra histokjemiske fargingsteknikker til negative og positive flekker9,10. En viktig metodologisk utvikling var den raffinerte postfikseringsprotokollen med kaliumferrocyanid-redusert osmium11,12,13,14, noe som forbedret kontrasten til glykogenpartikler betydelig. Denne raffinerte protokollen ble ikke brukt i noe av det banebrytende arbeidet med treningsindusert glykogenuttømming15, men ble gjeninnført av Graham og kolleger16,17.
Basert på de 2-dimensjonale bildene, er den subcellulære fordelingen av glykogen oftest beskrevet som glykogenpartikler som ligger i tre bassenger: subsarcolemmal (like under overflatemembranen), intermyofibrillar (mellom myofibrils) eller intramyofibrillar (innenfor myofibrilene). Glykogenpartikler kan imidlertid også beskrives som assosiert med for eksempel sarkoplasmatisk retikulum7 eller kjerner18. I tillegg til den subcellulære fordelingen er fordelen med TEM-estimert glykogeninnhold også at kvantifisering kan utføres på enkeltfibernivå. Dette gjør det mulig å undersøke fiber-til-fiber variasjon og korrelative analyser med fibertyper og cellulære komponenter som mitokondrier og lipiddråper.
Her er protokollen for TEM-estimert fibertypespesifikk volumetrisk innhold av de tre vanlige subcellulære bassengene av glykogen (subsarcolemmal, intermyofibrillar og intramyofibrillar) i skjelettmuskulaturfibre beskrevet. Metoden har blitt brukt på skjelettmuskler fra mennesker19, rotter20 og mus21; så vel som fugler og fisk22; kardiomyocytter fra rotter23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Propylene oxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-56-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding 812 resin medium kit</td>
			<td>Taab</td>
			<td>T031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04239.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITEM</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM AC20</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Automatic contrasting system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSIS Veleta digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>0972A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM 100 Transmission EM</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455989-245G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4</td>
			<td>Ampliqon.com</td>
			<td>AMPQ40989.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-microtome Leica UC7</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>6159-44-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy

Ved bruk av transmisjonselektronmikroskopi kan det oppnås høyoppløselige bilder av faste prøver som inneholder individuelle muskelfibre. Dette muliggjør kvantifisering av ultrastrukturelle aspekter som volumfraksjoner, overflateareal til volumforhold, morformetri og fysiske kontaktområder for forskjellige subcellulære strukturer. På 1970-tallet ble en protokoll for forbedret farging av glykogen i celler utviklet og banet vei for en rekke studier på subcellulær lokalisering av glykogen og glykogenpartikkelstørrelse ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi. Mens de fleste analyser tolker glykogen som om det er homogent fordelt i muskelfibrene, og bare gir en enkelt verdi (f.eks. en gjennomsnittlig konsentrasjon), har transmisjonselektronmikroskopi avslørt at glykogen lagres som diskrete glykogenpartikler plassert i forskjellige subcellulære rom. Her beskrives den trinnvise protokollen fra vevsinnsamling til kvantitativ bestemmelse av volumfraksjonen og partikkeldiameteren til glykogen i de distinkte subcellulære rommene til individuelle skjelettmuskulaturfibre. Hensyn til hvordan man samler inn og flekker vevsprøver, 2) utfører bildeanalyser og datahåndtering, 3) evaluerer presisjonen av estimater, 4) diskriminerer mellom muskelfibertyper, og 5) metodologiske fallgruver og begrensninger er inkludert.

Ved hjelp av denne protokollen fremstår glykogenpartikler som svarte og distinkte (figur 1 og figur 2). De normale verdiene av glykogen er avbildet i figur 3. Disse dataene er basert på totalt 362 fibre fra 41 friske unge menn som samlet inn i forskjellige tidligere studier19,24,29,30,31.<sup ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

En modifisert post-fiksering prosedyre øker kontrasten av glykogen partikler i vev. Dette dokumentet gir en trinnvis protokoll som beskriver hvordan man håndterer vevet, utfører avbildningen og bruker stereologiske metoder for å oppnå objektive og kvantitative data om fibertypespesifikk subcellulær glykogenfordeling i skjelettmuskulatur.

Kvantifisering av subcellulær glykogenfordeling i skjelettmuskulaturfibre ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Målet på glykogeninnhold i enkeltceller og subcellulære organisasjoner er viktig fordi i de fleste celletyper tilpasser enkeltceller seg annerledes til endrede fysiologiske forhold og sykdommer. Så den største fordelen med denne teknikken er den svært høye oppløsningen i transmisjonselektronmikroskopet. Dette forbedrer muligheten for å ha lokalisert subcellulære strukturer, og også i dette innholdet i denne teknikken her, er det viktig at glykogenfargingen er antistofffri.Så vi har ingen spesifisitet å bekymre oss for. For å få en bedre kontrast på glykogen, bruk bare kaliumferrocyanid 1,5% i stedet for kaliumferrocyanid. Forbered 1,6 milliliter av den primære fikseringsløsningen ved å tilsette 2,5% glutaraldehyd i 0,1 molar natriumkakrodylatbuffer i et to milliliter mikrosentrifiseringsrør.Oppbevar den på fem grader Celsius i maksimalt 14 dager. Isoler en liten prøve fra muskelbiopsien eller hele muskelen som har en maksimal diameter på en millimeter i alle retninger og er lengre langsgående enn tverrsnitt. Plasser prøven i røret som inneholder den kalde primære fikseringsløsningen.Oppbevar den på fem grader Celsius i 24 timer. Vask deretter prøven fire ganger i 0,1 molar natriumkaktokylatbuffer. Bruk overføringspipetter til å fjerne den brukte bufferen fra røret slik at prøven blir urørt og tilsett den ferske bufferen.Etterfiks prøven med 1% osmium tetroxide og 1,5% kalium ferrocyanid i 0,1 molar natrium kaktocylatbuffer i 120 minutter ved fire grader Celsius. Skyll prøven to ganger i dobbelt destillert vann ved romtemperatur. Dehydrer ved å senke ned i en gradert serie etanol ved romtemperatur.Infiltrer prøven med propylenoksid og epossidic harpiks graderte blandinger ved romtemperatur ved hjelp av de nevnte volumforholdene. Neste dag legger du inn prøver i 100% frisk epossidisk harpiks i mugg og polymeriserer ved 60 grader Celsius i 48 timer. Monter blokken av en prøve på ultramikrotomholderen.Trim blokken på overflaten med et barberblad for å nå vevsnivået. Monter en diamantkniv foran prøven og juster prøveoverflaten parallelt med kniven. Produser en halvtynn del av en mikrometertykkelse med diamantkniven for å sjekke retningen på prøven.Flekk den halvtynne delen med toluidinblå for observasjon med lysmikroskopi. Trim deretter blokken ytterligere for å redusere interesseområdet for å få riktige ultratynne seksjoner. Klipp 60 til 70 nanometertykkelse ultratynne seksjoner med en annen diamantkniv.Samle en til to seksjoner på en hel kobbergitter ved hjelp av en perfekt sløyfe. For å kontrastere seksjonene, senk gitteret i uranylacetatoppløsning i 20 minutter og vask gitteret i dobbelt destillert vann og senk deretter gitteret i blysitrat i 15 minutter og vask gitteret i dobbelt destillert vann. Slå på transmisjonselektronmikroskopets datamaskin- og bildeopptaksprogramvare, ta opp digitale bilder med et digitalt Slow Scan CCD-kamera og tilhørende bildebehandlingsprogramvare.Etter å ha satt inn rutenettet med flere seksjoner i mikroskopstadiet, kan du skjerme rutenettet i utgangspunktet ved lav forstørrelse for å velge seksjoner av beste kvalitet og bestemme retningen på muskelfibrene. Neste fokus er bildet ved forstørrelse over 30 000 med strålen sentrert på en perifer fiber i seksjonen og ta opp bilder med ett sekunds eksponeringstid ved ønsket forstørrelse. Forsikre deg om at bildene er fordelt over lengden og bredden på fiberen i en randomisert bot systematisk rekkefølge for å oppnå objektive resultater og gjenta bildet til seks til ti fibre er avbildet.Importer bilder til bilde J ved å klikke på filen etterfulgt av åpen. Angi global skala slik at den samsvarer med den opprinnelige størrelsen på bildet ved å klikke på analyser og deretter angi skala. For å zoome inn 100% klikk på bildet, gå til zoom og klikk på.Mål tykkelsen på en Z-disk per bilde av myofibrillarområdet ved hjelp av det rette linjeverktøyet fra verktøymenyen og beregn den gjennomsnittlige Z-disktykkelsen på hver av de seks til ti fibrene. Bruk det segmenterte linjeverktøyet til å måle lengden på den ytterste myofibril som er synlig like under den subsarkolemmale regionen. Hvis du vil sette inn et rutenett, klikker du analyser, merker verktøy og velger deretter rutenett.Sett nå området per punkt på 32 400 kvadrat nanometer. Tell antall treff innenfor den tilgjengelige lengden i de 12 subsarcolemmale bildene der et kryss treffer det subsarcolemmale glykogenet. Sett inn et rutenett ved å klikke på analyser, velg deretter verktøy, etterfulgt av rutenett og sett areal per punkt på 160 000 kvadratiske nanometer.Tell antall treff i 12th myofibrillar bilder der et kryss treffer intramyofibrillar plass. Deretter igjen, for å sette inn et rutenett, klikk på analyser, velg verktøy og velg deretter rutenett. Sett nå området per punkt på 3600 kvadrat nanometer.Tell antall treff i 12th myofibrillar bilder der et kryss treffer intramyofibrillar glykogen. Sett inn et rutenett ved å klikke på analyser, velg deretter verktøy, etterfulgt av rutenett og sett areal per punkt på 32 400 kvadrat nanometer. Tell antall treff i 12th myofibrillar bilder der et kryss treffer intermyofibrillar glykogen.Ved hjelp av det 32 400 kvadratiske nanometergitteret for å tilfeldig velge glykogenpartiklene, start med øvre venstre firkant og flytt til venstre om nødvendig. Bruk rett linje verktøy, måle diameteren på fem tilfeldig valgte glykogen partikler av hvert basseng for hvert av de 12 bildene for å oppnå et gjennomsnitt på 60 partikler per basseng per fiber. Denne figuren viser de normale verdiene til de tre glykogenbassengene.Det kan observeres at intermyofibrillare glykogenverdier fordeles nær normalen, mens både intramyofibrillar og subsarcolemmal glykogen viser skjev fordeling der fibre noen ganger har en overdreven mengde glykogen. Blant alle trinnene er det veldig viktig å bruke kaliumferrocyanid. Analysen av glykogen kan kombineres med analyse av mitokondrie og lipiddråper som kan forbedre vår forståelse av hvordan andre viktige metabolske komponenter korrelerer med glykogen og muskelhelse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode for å visualisere og analysere Membran samspill proteiner av transmisjonselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Forbedret protokollen for Chromatin Immunoprecipitation fra musen skjelettlidelser muskel

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse av β-Amyloid-indusert unormalt Fibrin Clot struktur av spektroskopi og skanning elektronmikroskop

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Utarbeidelse av prøvestøttefilmer i transmisjonselektronmikroskopi ved hjelp av en støtteflytblokk

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropattering overføring elektronmikroskopinett til direkte celleposisjonering i hele celler Cryo-Electron Tomography Arbeidsflyter

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Måling av protein import kapasitet av skjelett muskel mitokondrier

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

Bestemmelse av glukankjedelengdefordeling av glykogen ved hjelp av fluoroforassistert karbohydratelektroforese (FACE) metode

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemessig innsamling av kryo-EM-datasett med høy oppløsning ved bruk av 200 KV-transmisjonselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

High-throughput bildebasert kvantifisering av mitokondriell DNA-syntese og distribusjon

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...