Name: quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Comitê Olímpico Sueco.

O presente protocolo utilizando amostras de músculo esquelético biopsied humano foi aprovado pelos Comitês Regionais de Ética em Pesquisa em Saúde para a Dinamarca do Sul (S-20170198). Biópsias musculares foram obtidas através de uma incisão na pele do músculo vasto lateralis usando uma agulha bergström com sucção após a anestesia local ter sido dada subcutânea (1-3 mL de Lidocaína 2% por incisão). Se utilizados músculos inteiros de ratos isolados, os animais foram sacrificados por luxação cer...

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	<li>Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+life+of+the+glycogen+granule.">The dynamic life of the glycogen granule.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).</li><li>Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+glycogen+depletion+pattern+in+human+muscle+fibres+after+exercise+of+varying+intensity+and+at+varying+pedalling+rates.">Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates.</a> Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).</li><li>James, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+both+aerobic+glycolysis+and+Na+-K+-ATPase+activity+in+skeletal+muscle+by+epinephrine+or+amylin.">Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).</li><li>Jensen, R., Nielsen, J., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+glycogenolysis+prolongs+action+potential+repriming+period+and+impairs+muscle+function+in+rat+skeletal+muscle.">Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle.</a> Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).</li><li>Green, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+important+is+endogenous+muscle+glycogen+to+fatigue+in+prolonged+exercise.">How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).</li><li>Fitts, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+muscle+fatigue.">Cellular mechanisms of muscle fatigue.</a> Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).</li><li>Wanson, J. C., Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+glycogen+metabolism.">Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism.</a> Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).</li><li>Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+the+human+brachial+biceps+muscle.">Fiber types in the human brachial biceps muscle.</a> Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).</li><li>Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+glycogen.+Electron+microscopic+study+of+the+negative+stains+of+particulate+glycogen.">Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li><li>Thiery, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+polysaccharides+on+thin+sections+by+electron+microscopy.">Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).</li><li>De Bruijn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen,+its+chemistry+and+morphologic+appearance+in+the+electron+microscope.+I.+A+modified+OsO4+fixative+which+selectively+contrasts+glycogen.">Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen.</a> Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).</li><li>Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+accumulation+in+polymorphonuclear+leukocytes,+and+other+intracellular+alterations+that+occur+during+inflammation.">Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation.</a> The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).</li><li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes+-+the+organelles+of+glycogen+metabolism.">Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li><li>Gadisseux, J. F., Evrard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-neuronal+relationship+in+the+developing+central+nervous+system.+A+histochemical-electron+microscope+study+of+radial+glial+cell+particulate+glycogen+in+normal+and+reeler+mice+and+the+human+fetus.">Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus.</a> Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).</li><li>Frid&#233;n, J., Seger, J., Ekblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+periodic+acid-thiosemicarbazide-silver+proteinate+staining+for+ultrastructural+assessment+of+muscle+glycogen+utilization+during+exercise.">Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise.</a> Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+subcellular+glycogen+in+resting+human+muscle:+granule+size,+number,+and+location.">Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location.</a> Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+muscle+glycogen+granules+size+and+number+in+subcellular+locations+during+recovery+from+prolonged+exercise.">Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise.</a> Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).</li><li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Glycogenolysis+Modulates+Histone+Acetylation+in+Human+Non-Small+Cell+Lung+Cancers.">Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).</li><li>Jensen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+subcellular+muscle+glycogen+utilisation+during+exercise+impacts+endurance+capacity+in+men.">Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men.</a> Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).</li><li>Nielsen, J., Schr&#248;der, H. D., Rix, C. G., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+subcellular+glycogen+localization+on+tetanic+relaxation+time+and+endurance+in+mechanically+skinned+rat+skeletal+muscle+fibres.">Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).</li><li>Nielsen, J., Cheng, A. J., &#216;rtenblad, N., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+glycogen+and+decreased+tetanic+Ca2++in+fatigued+single+intact+mouse+muscle+fibres.">Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).</li><li>Mead, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+constraints+in+synchronous+muscle+limit+superfast+motor+control+in+vertebrates.">Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates.</a> eLife. 6, 29425 (2017).</li><li>Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., &#216;rtenblad, N., B&#248;tker, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+subcellular+glycogen+distribution+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling:+effects+of+ischaemia,+reperfusion+and+ischaemic+preconditioning.">Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning.</a> Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).</li><li>Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schr&#248;der, H. D., Saltin, B., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+glycogen+utilization+in+exhaustive+exercise:+role+of+subcellular+localization+and+fibre+type.">Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type.</a> Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).</li><li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new,+simple+and+efficient+stereological+methods+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).</li><li>Saltin, B., Gollnick, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+adaptability:+significance+for+metabolism+and+performance.">Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance.</a> Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).</li><li>Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-dependent+decrements+in+skeletal+muscle+glycogen+and+mitochondria+content+following+short-term+disuse+in+young+and+old+men.">Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).</li><li>Hokken, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-+and+fibre+type-dependent+utilization+of+muscle+glycogen+during+heavy+resistance+exercise+in+elite+power+and+Olympic+weightlifters.">Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters.</a> Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).</li><li>Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glycogen+storage+of+a+subcellular+hot+spot+in+human+skeletal+muscle+during+early+recovery+from+eccentric+contractions.">Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions.</a> PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).</li><li>Sj&#246;str&#246;m, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analyses+of+human+muscle+fiber+types.">Morphometric analyses of human muscle fiber types.</a> Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).</li><li>Gejl, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+depletion+of+glycogen+with+supramaximal+exercise+in+human+skeletal+muscle+fibres.">Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).</li><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li></ol>

A etapa crítica do método é o uso de osmium reduzido por ferrocianídeo de potássio durante a pós-fixação. A seletividade deste fixador modificado para detecção de glicogênio não pode ser totalmente explicada pela química, mas também inclui achados experimentais que demonstram nenhuma detecção de tais partículas em tecidos conhecidos por estarem livres de glicogênio ou no espaço extracelular11.
Parâmetros críticos são a precisão das estimativas e a...

As partículas glicogênio são compostas de polímeros ramificados de glicose e várias proteínas associadas1 e constituem um combustível importante durante altas demandas metabólicas2. Embora não amplamente reconhecidas, as partículas de glicogênio também constituem um combustível local, onde alguns processos subcelulares utilizam preferencialmente o glicogênio, apesar da disponibilidade de outros combustíveis mais duradouros como glicose plasmática e ácidos graxos3,4.
A importância de armazenar glicogênio como combustível localizado específico subcelular tem sido discutida em várias revisões5,6 principalmente com base em algumas das documentações mais antigas da distribuição subcelular de glicogênio por microscopia eletrônica de transmissão (TEM)7,8. Os primeiros estudos utilizaram diferentes protocolos para aumentar o contraste do glicogênio das técnicas histoquímicas de coloração para manchas negativas e positivas9,10. Um importante desenvolvimento metodológico foi o refinado protocolo pós-fixação com o osmium reduzido por ferrociancida de potássio111,12,13,14, o que melhorou significativamente o contraste das partículas de glicogênio. Este protocolo refinado não foi usado em alguns dos trabalhos pioneiros sobre o esgotamento do glicogênio induzido pelo exercício15, mas foi reintroduzido por Graham e seus colegas16,17.
Com base nas imagens bidimensionais, a distribuição subcelular do glicogênio é mais frequentemente descrita como partículas de glicogênio localizadas em três piscinas: subsarcolemmal (logo abaixo da membrana superficial), intermyofibrilar (entre os miofibrils) ou intramyofibrilar (dentro dos miofibrils). No entanto, partículas de glicogênio também podem ser descritas como associadas, por exemplo, a reguloso sarcoplasmático7 ou núcleos18. Além da distribuição subcelular, a vantagem do teor de glicogênio estimado pelo TEM também é que a quantificação pode ser realizada no nível único de fibra. Isso permite a investigação da variabilidade de fibra para fibra e análises correlativas com tipos de fibras e componentes celulares como mitocôndrias e gotículas lipídicas.
Aqui, descreve-se o protocolo para o teor volutrico específico do tipo de fibra tem das três piscinas subcelulares comuns de glicogênio (subsarcolemmal, intermyofibrilar e intramyofibrilar) em fibras musculares esqueléticas. O método foi aplicado aos músculos esqueléticos de humanos19, ratos20 e camundongos21; assim como aves e peixes22; e cardiomiócitos de ratos23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Propylene oxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-56-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding 812 resin medium kit</td>
			<td>Taab</td>
			<td>T031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04239.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITEM</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM AC20</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Automatic contrasting system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSIS Veleta digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>0972A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM 100 Transmission EM</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455989-245G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4</td>
			<td>Ampliqon.com</td>
			<td>AMPQ40989.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-microtome Leica UC7</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>6159-44-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy

Com o uso de microscopia eletrônica de transmissão, podem ser obtidas imagens de alta resolução de amostras fixas contendo fibras musculares individuais. Isso permite quantificações de aspectos ultraestruturais, como frações de volume, proporções de superfície/volume, morfometria e locais de contato físico de diferentes estruturas subcelulares. Na década de 1970, um protocolo para melhor coloração de glicogênio nas células foi desenvolvido e abriu caminho para uma série de estudos sobre a localização subcelular do tamanho de partículas glicogênio e glicogênio usando microscopia eletrônica de transmissão. Enquanto a maioria das análises interpreta o glicogênio como se fosse distribuído homogêneo dentro das fibras musculares, fornecendo apenas um único valor (por exemplo, uma concentração média), a microscopia eletrônica de transmissão revelou que o glicogênio é armazenado como partículas de glicogênio discretas localizadas em compartimentos subcelulares distintos. Aqui, descreve-se o protocolo passo-a-passo da coleta de tecidos para a determinação quantitativa da fração de volume e diâmetro de partículas do glicogênio nos distintos compartimentos subcelulares das fibras musculares esqueléticas individuais. Considerações sobre como 1) coletar e manchar amostras de tecidos, 2) realizar análises de imagem e manuseio de dados, 3) avaliar a precisão das estimativas, 4) discriminar entre tipos de fibras musculares e 5) armadilhas e limitações metodológicas.

Usando este protocolo, as partículas de glicogênio parecem negras e distintas (Figuras 1 e Figura 2). Os valores normais do glicogênio são retratados na Figura 3. Esses dados são baseados em um total de 362 fibras de 41 jovens saudáveis, conforme coletado em diferentes estudos anteriores19,24,29,30,31.</su...

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Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Um procedimento pós-fixação modificado aumenta o contraste das partículas de glicogênio no tecido. Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo descrevendo como lidar com o tecido, conduzir a imagem e usar métodos esterológicos para obter dados imparciales e quantitativos sobre a distribuição de glicogênio subcelular específico do tipo de fibra no músculo esquelético.

Quantificação da Distribuição de Glicogênio Subcelular em Fibras Musculares Esqueléticas usando Microscopia eletrônica de transmissão

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

A medida do teor de glicogênio em células únicas e organizações subcelulares é importante porque, na maioria dos tipos de células, as células únicas se adaptam de forma diferente às mudanças nas condições fisiológicas e doenças. Então, a principal vantagem desta técnica é a resolução muito alta no microscópio eletrônico de transmissão. Isso melhora a possibilidade de ter estruturas subcelulares localizadas e também neste conteúdo nesta técnica aqui, é importante que a coloração de glicogênio seja livre de anticorpos.Então, não temos nenhuma especificidade para nos preocuparmos. Para obter um melhor contraste sobre o glicogênio, basta usar ferrocidato de potássio 1,5% em vez de ferrocianida de potássio. Prepare 1,6 mililitros da solução fixa primária adicionando 2,5% de glutaraldeído em 0,1 amortecedor de cacodilato de sódio molar em um tubo de microcentrificação de dois mililitros.Guarde-o a 5 graus Celsius por um máximo de 14 dias. Isole uma pequena amostra da biópsia muscular ou músculo inteiro que tenha um diâmetro máximo de um milímetro em qualquer direção e seja mais longo do que transversalmente. Coloque a amostra no tubo contendo a solução de fixação primária fria.Guarde-o a 5 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, lave a amostra quatro vezes em 0,1 amortecedor de cacodilato de sódio molar. Usando pipetas de transferência, remova o tampão usado do tubo deixando a amostra intocada e adicione o tampão fresco.Pós-fixar a amostra com 1%de tetroxida de ósmio e ferrocianida de potássio de 1,5% em 0,1 tampão de cacodilato de sódio molar por 120 minutos a quatro graus Celsius. Enxágüe o espécime duas vezes em água dupla destilada à temperatura ambiente. Desidratar submergindo em uma série de etanol classificado à temperatura ambiente.Infiltrar-se no espécime com óxido de propileno e misturas epósdicas de resina a temperatura ambiente usando as razões de volume mencionadas. No dia seguinte, incorpore espécimes em resina esídica 100% fresca em moldes e polimerize a 60 graus Celsius por 48 horas. Monte o bloco de um espécime no suporte ultramicroome.Corte o bloco na superfície com uma lâmina de barbear para atingir o nível do tecido. Monte uma faca de diamante na frente da amostra e alinhe a superfície da amostra paralelamente à faca. Produza uma seção semifina de uma espessura de micrômetro com a faca de diamante para verificar a orientação da amostra.Colora a seção semifina com azul toluidina para observação com microscopia leve. Em seguida, corte ainda mais o bloco para reduzir a área de interesse para obter seções ultrathin adequadas. Corte de 60 a 70 seções de ultrathina de espessura de 60 a 70 nanômetros com uma segunda faca de diamante.Colete de uma a duas seções em uma grade de cobre inteira usando um loop perfeito. Para contrastar as seções, mergulhe as grades em solução de acetato deuranyl por 20 minutos e lave as grades em água dupla destilada e, em seguida, mergulhe as grades em citrato de chumbo por 15 minutos e relave as grades em água dupla destilada. Ligue o computador de microscópio eletrônico de transmissão e o software de gravação de imagens, grave imagens digitais com uma câmera CCD de varredura lenta digital e o software de imagem associado.Depois de inserir a grade com várias seções no estágio do microscópio, trive a grade inicialmente em baixa ampliação para escolher as seções de melhor qualidade e determinar a direção das fibras musculares. Em seguida, a imagem na ampliação acima de 30.000 com o feixe centrado em uma fibra periférica na seção e registra imagens com um segundo tempo de exposição na ampliação desejada. Certifique-se de que as imagens estão distribuídas através do comprimento e largura da fibra em uma ordem sistemática de bot randomizada para obter resultados imparciales e repetir a imagem até que seis a 10 fibras sejam imagens.Importe imagens para a imagem J clicando no arquivo seguido de abertura. Defina escala global para corresponder ao tamanho original da imagem clicando em analisar e, em seguida, definir escala. Para ampliar 100% clique na imagem, vá para zoom e clique em dentro.Meça a espessura de um disco Z por imagem do espaço miofibrilar usando a ferramenta de linha reta do menu de ferramentas e calcule a espessura média do disco Z de cada uma das seis a 10 fibras. Use a ferramenta de linha segmentada para medir o comprimento do myofibril externo mais visível logo abaixo da região subsarcolemmal. Para inserir uma grade, clique em analisar, selecione ferramentas e selecione grade.Agora coloque a área por ponto em 32.400 nanômetros quadrados. Conte o número de acertos dentro do comprimento disponível nas 12 imagens subsarcolemmal onde uma cruz atinge o glicogênio subsarcolemmal. Insira uma grade clicando em analisar, em seguida, selecione ferramentas, seguidas por grade e área de configuração por ponto em 160.000 nanômetros quadrados.Conte o número de acessos nas imagens miofibrilares 12 onde um cruzamento atinge o espaço intramyofibrilar. Em seguida, novamente, para inserir uma grade, clique em analisar, selecione ferramentas e selecione grade. Agora coloque a área por ponto em 3.600 nanômetros quadrados.Conte o número de acertos nas imagens de miofibrilar 12 onde um cruzamento atinge o glicogênio intramyofibrilar. Insira uma grade clicando em analisar, em seguida, selecione ferramentas, seguido de grade e definir área por ponto em 32,400 nanômetros quadrados. Conte o número de acertos nas imagens de 12º miofibrilar onde um cruzamento atinge o glicogênio intermyofibrilar.Usando a grade de 32.400 nanômetros quadrados para escolher aleatoriamente as partículas de glicogênio, comece com o quadrado superior esquerdo e mova-se para a esquerda, se necessário. Utilizando a ferramenta de linha reta, meça o diâmetro de cinco partículas de glicogênio escolhidas aleatoriamente de cada piscina para cada uma das 12 imagens para obter uma média de 60 partículas por piscina por fibra. Esta figura mostra os valores normais das três piscinas de glicogênio.Observa-se que os valores de glicogênio intermyofibrilar são distribuídos perto do normal, enquanto tanto o glicogênio intramyofibrilar quanto o glicógeno subsarcolêmal apresentam distribuição distorcida onde as fibras às vezes têm uma quantidade excessiva de glicogênio. Entre todas as etapas é muito importante usar ferrocidaide de potássio. A análise do glicogênio pode ser combinada com a análise de mitocôndrias e gotículas lipídicas que podem melhorar nossa compreensão de como outros componentes metabólicos chave se correlacionam com a saúde glicogênio e muscular.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Método para visualizar e analisar proteínas de interação de membrana por microscopia eletrônica de transmissão

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Bioquímica

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Protocolo melhorado por imunoprecipitação da cromatina do músculo esquelético de rato

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Análise de β-amiloide-induzida de anormalidades na estrutura do coágulo de fibrina por espectroscopia e microscopia eletrônica

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Preparação de filmes de suporte à amostra em microscopia eletrônica de transmissão usando um bloco de flutuação de suporte

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmissão Electron Microscopy Grids para Posicionamento Direto celular dentro de fluxos de trabalho de tomografia crio-elétron inteira

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Medição da Capacidade de Importação de Proteínas das Mitocôndrias Musculares Esqueléticas

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

Determinação da distribuição do comprimento da cadeia glucano do glicógeno usando o Método de Eletroforese de Carboidratos Assistido por Fluorophore (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Coleta rotineira de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando microscópio eletrônico de transmissão de 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...