Name: quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана Шведским олимпийским комитетом.

Настоящий протокол с использованием образцов скелетных мышц человека с биопсией был одобрен Региональными комитетами по этике исследований в области здравоохранения для Южной Дании (S-20170198). Биопсию мышц получали через разрез в коже из мышцы vastus lateralis с использованием иглы Bergström с...

<ol>
	<li>Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+life+of+the+glycogen+granule.">The dynamic life of the glycogen granule.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).</li><li>Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+glycogen+depletion+pattern+in+human+muscle+fibres+after+exercise+of+varying+intensity+and+at+varying+pedalling+rates.">Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates.</a> Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).</li><li>James, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+both+aerobic+glycolysis+and+Na+-K+-ATPase+activity+in+skeletal+muscle+by+epinephrine+or+amylin.">Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).</li><li>Jensen, R., Nielsen, J., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+glycogenolysis+prolongs+action+potential+repriming+period+and+impairs+muscle+function+in+rat+skeletal+muscle.">Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle.</a> Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).</li><li>Green, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+important+is+endogenous+muscle+glycogen+to+fatigue+in+prolonged+exercise.">How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).</li><li>Fitts, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+muscle+fatigue.">Cellular mechanisms of muscle fatigue.</a> Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).</li><li>Wanson, J. C., Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+glycogen+metabolism.">Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism.</a> Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).</li><li>Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+the+human+brachial+biceps+muscle.">Fiber types in the human brachial biceps muscle.</a> Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).</li><li>Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+glycogen.+Electron+microscopic+study+of+the+negative+stains+of+particulate+glycogen.">Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li><li>Thiery, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+polysaccharides+on+thin+sections+by+electron+microscopy.">Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).</li><li>De Bruijn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen,+its+chemistry+and+morphologic+appearance+in+the+electron+microscope.+I.+A+modified+OsO4+fixative+which+selectively+contrasts+glycogen.">Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen.</a> Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).</li><li>Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+accumulation+in+polymorphonuclear+leukocytes,+and+other+intracellular+alterations+that+occur+during+inflammation.">Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation.</a> The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).</li><li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes+-+the+organelles+of+glycogen+metabolism.">Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li><li>Gadisseux, J. F., Evrard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-neuronal+relationship+in+the+developing+central+nervous+system.+A+histochemical-electron+microscope+study+of+radial+glial+cell+particulate+glycogen+in+normal+and+reeler+mice+and+the+human+fetus.">Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus.</a> Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).</li><li>Frid&#233;n, J., Seger, J., Ekblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+periodic+acid-thiosemicarbazide-silver+proteinate+staining+for+ultrastructural+assessment+of+muscle+glycogen+utilization+during+exercise.">Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise.</a> Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+subcellular+glycogen+in+resting+human+muscle:+granule+size,+number,+and+location.">Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location.</a> Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+muscle+glycogen+granules+size+and+number+in+subcellular+locations+during+recovery+from+prolonged+exercise.">Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise.</a> Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).</li><li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Glycogenolysis+Modulates+Histone+Acetylation+in+Human+Non-Small+Cell+Lung+Cancers.">Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).</li><li>Jensen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+subcellular+muscle+glycogen+utilisation+during+exercise+impacts+endurance+capacity+in+men.">Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men.</a> Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).</li><li>Nielsen, J., Schr&#248;der, H. D., Rix, C. G., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+subcellular+glycogen+localization+on+tetanic+relaxation+time+and+endurance+in+mechanically+skinned+rat+skeletal+muscle+fibres.">Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).</li><li>Nielsen, J., Cheng, A. J., &#216;rtenblad, N., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+glycogen+and+decreased+tetanic+Ca2++in+fatigued+single+intact+mouse+muscle+fibres.">Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).</li><li>Mead, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+constraints+in+synchronous+muscle+limit+superfast+motor+control+in+vertebrates.">Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates.</a> eLife. 6, 29425 (2017).</li><li>Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., &#216;rtenblad, N., B&#248;tker, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+subcellular+glycogen+distribution+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling:+effects+of+ischaemia,+reperfusion+and+ischaemic+preconditioning.">Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning.</a> Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).</li><li>Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schr&#248;der, H. D., Saltin, B., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+glycogen+utilization+in+exhaustive+exercise:+role+of+subcellular+localization+and+fibre+type.">Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type.</a> Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).</li><li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new,+simple+and+efficient+stereological+methods+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).</li><li>Saltin, B., Gollnick, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+adaptability:+significance+for+metabolism+and+performance.">Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance.</a> Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).</li><li>Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-dependent+decrements+in+skeletal+muscle+glycogen+and+mitochondria+content+following+short-term+disuse+in+young+and+old+men.">Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).</li><li>Hokken, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-+and+fibre+type-dependent+utilization+of+muscle+glycogen+during+heavy+resistance+exercise+in+elite+power+and+Olympic+weightlifters.">Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters.</a> Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).</li><li>Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glycogen+storage+of+a+subcellular+hot+spot+in+human+skeletal+muscle+during+early+recovery+from+eccentric+contractions.">Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions.</a> PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).</li><li>Sj&#246;str&#246;m, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analyses+of+human+muscle+fiber+types.">Morphometric analyses of human muscle fiber types.</a> Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).</li><li>Gejl, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+depletion+of+glycogen+with+supramaximal+exercise+in+human+skeletal+muscle+fibres.">Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).</li><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li></ol>

Критическим этапом метода является использование восстановленного осмия ферроцианидом калия во время постфиксации. Селективность этого модифицированного фиксатора для обнаружения гликогена не может быть полностью объяснена химией, но также включает экспериментальные результаты, ?...

Частицы гликогена состоят из разветвленных полимеров глюкозы и различных связанных с ней белков1 и являются важным топливом во время высоких метаболических потребностей2. Хотя частицы гликогена не получили широкого признания, они также представляют собой местное топливо, где некоторые субклеточные процессы преимущественно используют гликоген, несмотря на наличие других и более долговечных видов топлива, таких как глюкоза плазмы и жирные кислоты3,4.
Важность хранения гликогена в качестве субклеточного специфического локализованного топлива обсуждалась в нескольких обзорах5,6, в основном на основе некоторых из самых ранних документов о субклеточном распределении гликогена с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ)7,8. В первых исследованиях использовались различные протоколы для увеличения контраста гликогена от методов гистохимического окрашивания к отрицательным и положительным окрашиваниям9,10. Важной методологической разработкой стал уточненный протокол постфиксации с ферроцианидом калия-восстановленным осмием11,12,13,14, что значительно улучшило контраст частиц гликогена. Этот усовершенствованный протокол не использовался в некоторых новаторских работах по истощению гликогена, вызванному физическими упражнениями15, но был вновь введен Грэмом и его коллегами16,17.
Основываясь на 2-мерных изображениях, субклеточное распределение гликогена чаще всего описывается как частицы гликогена, расположенные в трех бассейнах: субсарколеммальном (прямо под поверхностной мембраной), интермиофибриллярном (между миофибриллами) или интрамиофибриллярном (в пределах миофибрилл). Однако частицы гликогена также могут быть описаны как связанные, например, с саркоплазматическим ретикулумом7 или ядрами18. В дополнение к субклеточному распределению, преимущество предполагаемого содержания гликогена, оцениваемого ТЕА, также заключается в том, что количественная оценка может проводиться на уровне одного волокна. Это позволяет исследовать изменчивость волокна к волокну и коррелятивный анализ с типами волокон и клеточными компонентами, такими как митохондрии и капли липидов.
Здесь описан протокол оценки ТЭМ типоспецифического объемного содержания трех общих субклеточных пулов гликогена (субсарколеммального, интермиофибриллярного и интрамиофибриллярного) в скелетных мышечных волокнах. Метод был применен к скелетным мышцам человека19, крыс20 и мышей21; а также птицы и рыбы22; и кардиомиоциты крыс23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Propylene oxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-56-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding 812 resin medium kit</td>
			<td>Taab</td>
			<td>T031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04239.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITEM</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM AC20</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Automatic contrasting system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSIS Veleta digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>0972A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM 100 Transmission EM</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455989-245G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4</td>
			<td>Ampliqon.com</td>
			<td>AMPQ40989.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-microtome Leica UC7</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>6159-44-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy

С помощью просвечивающей электронной микроскопии можно получить изображения с высоким разрешением неподвижных образцов, содержащих отдельные мышечные волокна. Это позволяет количественно оценивать ультраструктурные аспекты, такие как объемные фракции, отношение площади поверхности к объему, морфометрия и физические контакты различных субклеточных структур. В 1970-х годах был разработан протокол усиленного окрашивания гликогена в клетках, который проложил путь для серии исследований субклеточной локализации гликогена и размера частиц гликогена с использованием просвечивающей электронной микроскопии. В то время как большинство анализов интерпретируют гликоген так, как если бы он равномерно распределялся внутри мышечных волокон, обеспечивая только одно значение (например, среднюю концентрацию), просвечивающая электронная микроскопия показала, что гликоген хранится в виде дискретных частиц гликогена, расположенных в отдельных субклеточных компартментах. Здесь описан пошаговый протокол от сбора тканей до количественного определения объемной фракции и диаметра частиц гликогена в отдельных субклеточных компартментах отдельных волокон скелетных мышц. Включены соображения о том, как 1) собирать и окрашивать образцы тканей, 2) выполнять анализ изображений и обработку данных, 3) оценивать точность оценок, 4) различать типы мышечных волокон и 5) методологические подводные камни и ограничения.

Используя этот протокол, частицы гликогена выглядят черными и отчетливыми (рисунки 1 и 2). Нормальные значения гликогена изображены на рисунке 3. Эти данные основаны в общей сложности на 362 волокнах от 41 здорового молодого человека, собранн...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Модифицированная процедура постфиксации увеличивает контраст частиц гликогена в ткани. В этой статье представлен пошаговый протокол, описывающий, как обращаться с тканью, проводить визуализацию и использовать стереологические методы для получения объективных и количественных данных о распределении субклеточного гликогена в скелетных мышцах.

Количественная оценка распределения субклеточного гликогена в волокнах скелетных мышц с помощью просвечивающей электронной микроскопии

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Измерение содержания гликогена в отдельных клетках и субклеточных организациях важно, потому что в большинстве типов клеток одиночные клетки по-разному адаптируются к изменяющимся физиологическим условиям и заболеваниям. Итак, основным преимуществом данной методики является очень высокое разрешение в просвечивающем электронном микроскопе. Это улучшает возможность иметь локализованные субклеточные структуры, а также в этом содержании в этой технике здесь важно, чтобы окрашивание гликогена не содержало антител.Таким образом, у нас нет никакой специфики, о которой нужно беспокоиться. Для того, чтобы получить лучший контраст на гликогене, просто используйте ферроцианид калия 1,5% вместо ферроцианида калия. Готовят 1,6 миллилитра первичного фиксаторного раствора, добавляя 2,5% глутаральдегида в 0,1 молярный буфер какодилата натрия в двухмиллилитровой микроцентрификационной трубке.Храните его при пяти градусах Цельсия в течение максимум 14 дней. Выделите небольшой образец из биопсии мышцы или целой мышцы, которая имеет максимальный диаметр в один миллиметр в любом направлении и длиннее продольно, чем поперечно. Поместите образец в трубку, содержащую холодный раствор первичной фиксации.Храните его при пяти градусах Цельсия в течение 24 часов. Затем промыть образец четыре раза в 0,1 молярном буфере какодилата натрия. Используя переносные пипетки, извлеките использованный буфер из трубки, оставив образец нетронутым, и добавьте свежий буфер.После фиксации образца с 1% тетроксидом осмия и 1,5% ферроцианида калия в 0,1 молярном буфере какодилата натрия в течение 120 минут при четырех градусах Цельсия. Дважды промойте образец в двойной дистиллированной воде комнатной температуры. Обезвоживание путем погружения в градуированную серию этанола при комнатной температуре.Инфильтрировать образец градуированными смесями оксида пропилена и эпоссидной смолы при комнатной температуре с использованием указанных объемных соотношений. На следующий день встраивают образцы в 100% свежую эпоссидную смолу в формы и полимеризуют при 60 градусах Цельсия в течение 48 часов. Установите блок образца на держатель ультрамикротома.Обрежьте блок на поверхности лезвием бритвы, чтобы достичь уровня ткани. Установите алмазный нож перед образцом и выровняйте поверхность образца параллельно ножу. Изготовьте полутонкий срез толщиной в один микрометр алмазным ножом для проверки ориентации образца.Окрашивание полутонкого сечения толуидиновым синим цветом для наблюдения с помощью световой микроскопии. Затем обрежьте блок дальше, чтобы уменьшить интересующую область, чтобы получить правильные ультратонкие участки. Режете ультратонкие сечения толщиной от 60 до 70 нанометров вторым алмазным ножом.Соберите одну-две секции на одной цельной медной сетке, используя идеальную петлю. Для контрастирования секций погружают сетки в раствор уранилацетата на 20 минут и промывают сетки в двойной дистиллированной воде, а затем погружают сетки в цитрат свинца на 15 минут и повторно промывают сетки в двойной дистиллированной воде. Включите компьютер просвечивающего электронного микроскопа и программное обеспечение для записи изображений, записывайте цифровые изображения с помощью цифровой ПЗС-камеры с медленным сканированием и соответствующего программного обеспечения для обработки изображений.После вставки сетки с несколькими секциями в стадии микроскопа, сначала экранируйте сетку при небольшом увеличении, чтобы выбрать наиболее качественные участки и определить направление мышечных волокон. Далее фокусируют изображение при увеличении выше 30 000 с пучком, центрированным на периферийном волокне в сечении и записывают изображения с одним секундным временем экспозиции при нужном увеличении. Убедитесь, что изображения распределены по длине и ширине волокна в систематическом порядке рандомизированного бота для получения объективных результатов и повторяют изображение до тех пор, пока не будет получено изображение от шести до 10 волокон.Импортируйте изображения в изображение J, нажав на файл с последующим открытием. Установите глобальный масштаб в соответствии с исходным размером изображения, щелкнув «Анализировать», а затем установите масштаб. Чтобы увеличить на 100%, нажмите на изображение, перейдите в масштаб и нажмите на него.Измерьте толщину одного Z-диска на образ миофибриллярного пространства с помощью инструмента «прямая линия» из меню инструментов и рассчитайте среднюю толщину Z-диска каждого из шести-10 волокон. Используйте инструмент сегментированной линии для измерения длины самой внешней миофибрюли, видимой чуть ниже субсарколеммальной области. Чтобы вставить сетку, нажмите «Анализ», выберите инструменты, а затем выберите сетку.Теперь установите площадь на точку в 32 400 квадратных нанометров. Подсчитайте количество попаданий в пределах доступной длины на 12 субсарколеммальных изображениях, где крест попадает в субсарколеммальный гликоген. Вставьте сетку, щелкнув по анализу, затем выберите инструменты, затем сетку и установите площадь на точку в 160 000 квадратных нанометров.Подсчитайте количество попаданий на 12-м миофибриллярном изображении, где крест попадает во внутримиофибриллярное пространство. Затем, чтобы вставить сетку, нажмите на анализ, выберите инструменты, а затем выберите сетку. Теперь установите площадь на точку в 3 600 квадратных нанометров.Подсчитайте количество попаданий на 12-м миофибриллярном снимке, где крест попадает в интрамиофибриллярный гликоген. Вставьте сетку, щелкнув по анализу, затем выберите инструменты, затем сетку и установите площадь на точку в 32 400 квадратных нанометров. Подсчитайте количество попаданий на 12-м миофибриллярном снимке, где крест попадает в межмиофибриллярный гликоген.Используя сетку площадью 32 400 квадратных нанометров, чтобы случайным образом выбрать частицы гликогена, начните с верхнего левого квадрата и при необходимости переместитесь влево. Используя инструмент прямой линии, измерьте диаметр пяти случайно выбранных частиц гликогена каждого бассейна для каждого из 12 изображений, чтобы получить в среднем 60 частиц на пул на волокно. На этом рисунке показаны нормальные значения трех пулов гликогена.Можно наблюдать, что значения межмиофибриллярного гликогена распределены близко к норме, тогда как как внутримиофибриллярный, так и субсарколеммальный гликоген показывают искаженное распределение, где волокна иногда имеют чрезмерное количество гликогена. Среди всех шагов очень важно использовать ферроцианид калия. Анализ гликогена может быть объединен с анализом митохондрий и липидных капель, что может улучшить наше понимание того, как другие ключевые метаболические компоненты коррелируют с гликогеном и здоровьем мышц.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Метод визуализации и анализа Мембранные белков, взаимодействующих с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Улучшенная протокол для иммунопреципитации Chromatin от мыши скелетных мышц

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Анализ отклонений β-амилоид индуцированной фибринового сгустка структуры спектроскопии и растровая электронная микроскопия

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Подготовка образцов опорных пленок в просвечивающей электронной микроскопии с использованием опорного флотационного блока

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Микроструктурирование просвечивающих электронных микроскопических сеток для прямого позиционирования клеток в рабочих процессах криоэлектронной томографии цельноклеточной криоэлектронной томографии

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Измерение способности митохондрий скелетных мышц импортировать белок

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

Определение распределения гликогена по длине глюкановой цепи методом флуорофорного углеводного электрофореза (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Рутинный сбор наборов крио-ЭМ данных высокого разрешения с использованием просвечивающего электронного микроскопа 200 кВ

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...