Name: quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Comité Olímpico Sueco.

El presente protocolo que utiliza muestras de músculo esquelético biopsiado en humanos fue aprobado por los Comités Regionales de Ética de investigación en salud para el sur de Dinamarca (S-20170198). Las biopsias musculares se obtuvieron a través de una incisión en la piel del músculo vastus lateralis utilizando una aguja de Bergström con succión después de que se administró anestesia local por vía subcutánea (1-3 ml de lidocaína al 2% por incisión). Si se utilizaron músculos de rata enteros ai...

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	<li>Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+life+of+the+glycogen+granule.">The dynamic life of the glycogen granule.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).</li><li>Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+glycogen+depletion+pattern+in+human+muscle+fibres+after+exercise+of+varying+intensity+and+at+varying+pedalling+rates.">Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates.</a> Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).</li><li>James, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+both+aerobic+glycolysis+and+Na+-K+-ATPase+activity+in+skeletal+muscle+by+epinephrine+or+amylin.">Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).</li><li>Jensen, R., Nielsen, J., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+glycogenolysis+prolongs+action+potential+repriming+period+and+impairs+muscle+function+in+rat+skeletal+muscle.">Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle.</a> Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).</li><li>Green, H. 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A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus.</a> Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).</li><li>Frid&#233;n, J., Seger, J., Ekblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+periodic+acid-thiosemicarbazide-silver+proteinate+staining+for+ultrastructural+assessment+of+muscle+glycogen+utilization+during+exercise.">Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise.</a> Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+subcellular+glycogen+in+resting+human+muscle:+granule+size,+number,+and+location.">Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location.</a> Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+muscle+glycogen+granules+size+and+number+in+subcellular+locations+during+recovery+from+prolonged+exercise.">Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise.</a> Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).</li><li>Sun, R. 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El paso crítico del método es el uso de osmio reducido por ferrocianuro de potasio durante la post-fijación. La selectividad de este fijador modificado para la detección de glucógeno no puede explicarse completamente por la química, pero también incluye hallazgos experimentales que demuestran que no hay detección de tales partículas en tejidos que se sabe que están libres de glucógeno o en el espacio extracelular11.
Los parámetros críticos son la precisión...

Las partículas de glucógeno están compuestas por polímeros ramificados de glucosa y diversas proteínas asociadas1 y constituyen un combustible importante durante las altas demandas metabólicas2. Aunque no son ampliamente reconocidas, las partículas de glucógeno también constituyen un combustible local, donde algunos procesos subcelulares utilizan preferentemente el glucógeno a pesar de la disponibilidad de otros combustibles más duraderos como la glucosa plasmática y los ácidos grasos3,4.
La importancia de almacenar glucógeno como combustible localizado específico subcelular ha sido discutida en varias revisiones5,6 basándose principalmente en algunas de las primeras documentaciones de la distribución subcelular del glucógeno por microscopía electrónica de transmisión (TEM)7,8. Los primeros estudios utilizaron diferentes protocolos para aumentar el contraste de glucógeno desde técnicas de tinción histoquímica hasta tinciones negativas y positivas9,10. Un desarrollo metodológico importante fue el protocolo refinado de post-fijación con el osmio reducido en ferrocianuro de potasio11,12,13,14, que mejoró significativamente el contraste de las partículas de glucógeno. Este refinado protocolo no fue utilizado en algunos de los trabajos pioneros sobre el agotamiento del glucógeno inducido por el ejercicio15, sino que fue reintroducido por Graham y sus colegas16,17.
Según las imágenes en 2 dimensiones, la distribución subcelular del glucógeno se describe con mayor frecuencia como partículas de glucógeno ubicadas en tres grupos: subsarcolema (justo debajo de la membrana superficial), intermiofibrilar (entre las miofibrillas) o intramiofibrilar (dentro de las miofibrillas). Sin embargo, las partículas de glucógeno también podrían describirse como asociadas, por ejemplo, al retículo sarcoplásmico7 o núcleos18. Además de la distribución subcelular, la ventaja del contenido de glucógeno estimado por TEM es también que la cuantificación se puede realizar a nivel de fibra única. Esto permite la investigación de la variabilidad de fibra a fibra y análisis correlativos con tipos de fibra y componentes celulares como mitocondrias y gotas de lípidos.
Aquí, se describe el protocolo para el contenido volumétrico específico del tipo de fibra estimado por TEM de las tres piscinas subcelulares comunes de glucógeno (subsarcolema, intermiofibrilar e intramiofibrilar) en las fibras musculares esqueléticas. El método se ha aplicado a los músculos esqueléticos de humanos19, ratas20 y ratones21; así como aves y peces22; y cardiomiocitos de ratas23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Propylene oxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-56-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding 812 resin medium kit</td>
			<td>Taab</td>
			<td>T031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04239.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITEM</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM AC20</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Automatic contrasting system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSIS Veleta digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>0972A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM 100 Transmission EM</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455989-245G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4</td>
			<td>Ampliqon.com</td>
			<td>AMPQ40989.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-microtome Leica UC7</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>6159-44-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy

Con el uso de microscopía electrónica de transmisión, se pueden obtener imágenes de alta resolución de muestras fijas que contienen fibras musculares individuales. Esto permite cuantificaciones de aspectos ultraestructurales como fracciones de volumen, relaciones superficie/volumen, morfometría y sitios de contacto físico de diferentes estructuras subcelulares. En la década de 1970, se desarrolló un protocolo para mejorar la tinción de glucógeno en las células y allanó el camino para una serie de estudios sobre la localización subcelular del glucógeno y el tamaño de partícula de glucógeno utilizando microscopía electrónica de transmisión. Si bien la mayoría de los análisis interpretan el glucógeno como si estuviera distribuido homogéneamente dentro de las fibras musculares, proporcionando solo un valor único (por ejemplo, una concentración promedio), la microscopía electrónica de transmisión ha revelado que el glucógeno se almacena como partículas discretas de glucógeno ubicadas en distintos compartimentos subcelulares. Aquí, se describe el protocolo paso a paso desde la recolección de tejidos hasta la determinación cuantitativa de la fracción de volumen y el diámetro de partículas de glucógeno en los distintos compartimentos subcelulares de las fibras musculares esqueléticas individuales. Consideraciones sobre cómo 1) recolectar y teñir muestras de tejido, 2) realizar análisis de imágenes y manejo de datos, 3) evaluar la precisión de las estimaciones, 4) discriminar entre tipos de fibras musculares y 5) se incluyen las trampas y limitaciones metodológicas.

Usando este protocolo, las partículas de glucógeno aparecen negras y distintas (Figuras 1 y Figura 2). Los valores normales de glucógeno se representan en la Figura 3. Estos datos se basan en un total de 362 fibras de 41 jóvenes sanos recogidos en diferentes estudios previos19,24,29,30,31.<s...

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Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Un procedimiento modificado posterior a la fijación aumenta el contraste de las partículas de glucógeno en el tejido. Este documento proporciona un protocolo paso a paso que describe cómo manejar el tejido, realizar las imágenes y utilizar métodos estereológicos para obtener datos imparciales y cuantitativos sobre la distribución de glucógeno subcelular específico del tipo de fibra en el músculo esquelético.

Cuantificación de la distribución de glucógeno subcelular en fibras musculares esqueléticas mediante microscopía electrónica de transmisión

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

La medida del contenido de glucógeno en células individuales y organizaciones subcelulares es importante porque en la mayoría de los tipos de células, las células individuales se adaptan de manera diferente a las condiciones fisiológicas y enfermedades cambiantes. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es la muy alta resolución en el microscopio electrónico de transmisión. Esto mejora la posibilidad de tener estructuras subcelulares localizadas y también en este contenido en esta técnica aquí, es importante que la tinción de glucógeno esté libre de anticuerpos.Por lo tanto, no tenemos ninguna especificidad de la que preocuparnos. Para obtener un mejor contraste en el glucógeno, simplemente use ferrocianuro de potasio 1.5% en lugar de ferrocianuro de potasio. Prepare 1,6 mililitros de la solución fijadora primaria añadiendo glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 molar en un tubo de microcentrificación de dos mililitros.Guárdelo a cinco grados centígrados durante un máximo de 14 días. Aislar una muestra pequeña de la biopsia muscular o de todo el músculo que tiene un diámetro máximo de un milímetro en cualquier dirección y es más largo longitudinalmente que la sección transversal. Coloque la muestra en el tubo que contiene la solución de fijación primaria fría.Guárdelo a cinco grados centígrados durante 24 horas. Luego lave la muestra cuatro veces en tampón de cacodilato de sodio molar 0.1. Usando pipetas de transferencia, retire el tampón usado del tubo dejando la muestra intacta y agregue el tampón fresco.Después de fijar la muestra con tetróxido de osmio al 1% y ferrocianuro de potasio al 1,5% en tampón de cacodilato de sodio molar 0,1 durante 120 minutos a cuatro grados centígrados. Enjuague la muestra dos veces en agua destilada doble a temperatura ambiente. Deshidrata sumergiéndote en una serie graduada de etanol a temperatura ambiente.Infiltrar la muestra con óxido de propileno y mezclas graduadas de resina eposídica a temperatura ambiente utilizando las proporciones de volumen mencionadas. Al día siguiente, incrusta especímenes en resina eposídica 100% fresca en moldes y polimeriza a 60 grados centígrados durante 48 horas. Monte el bloque de un espécimen en el soporte del ultramicrotomo.Recorte el bloque en la superficie con una cuchilla de afeitar para alcanzar el nivel del tejido. Monte un cuchillo de diamante delante de la muestra y alinee la superficie de la muestra paralela al cuchillo. Produzca una sección semifina de un grosor de un micrómetro con el cuchillo de diamante para verificar la orientación de la muestra.Manche la sección semifina con azul toluidina para observación con microscopía de luz. Luego recorte el bloque aún más para reducir el área de interés para obtener secciones ultradelgadas adecuadas. Corte secciones ultrafinas de 60 a 70 nanómetros de espesor con un segundo cuchillo de diamante.Recoge una o dos secciones en una rejilla de cobre entera usando un bucle perfecto. Para contrastar las secciones, sumerja las rejillas en solución de acetato de uranilo durante 20 minutos y lave las rejillas en agua destilada doble y luego sumerja las rejillas en citrato de plomo durante 15 minutos y vuelva a lavar las rejillas en agua destilada doble. Encienda la computadora de microscopio electrónico de transmisión y el software de grabación de imágenes, grabe imágenes digitales con una cámara CCD de escaneo lento digital y el software de imágenes asociado.Después de insertar la rejilla con múltiples secciones en la etapa del microscopio, examine la rejilla inicialmente a bajo aumento para elegir las secciones de mejor calidad y determinar la dirección de las fibras musculares. A continuación, enfoque, la imagen a un aumento superior a 30, 000 con el haz centrado en una fibra periférica en la sección y grabe imágenes con un segundo de tiempo de exposición en el aumento deseado. Asegúrese de que las imágenes se distribuyan a lo largo y ancho de la fibra en un orden sistemático de bot aleatorio para obtener resultados imparciales y repetir la imagen hasta que se tomen imágenes de seis a 10 fibras.Importe imágenes a la imagen J haciendo clic en el archivo seguido de abrir. Establezca la escala global para que coincida con el tamaño original de la imagen haciendo clic en analizar y luego establecer la escala. Para ampliar al 100%, haga clic en la imagen, vaya a zoom y haga clic en entrar.Mida el grosor de un disco Z por imagen del espacio miofibrilar utilizando la herramienta de línea recta del menú de herramientas y calcule el grosor promedio del disco Z de cada una de las seis a 10 fibras. Utilice la herramienta de línea segmentada para medir la longitud de la miofibrilla más externa visible justo debajo de la región subesarcolema. Para insertar una cuadrícula, haga clic en analizar, seleccione herramientas y luego seleccione cuadrícula.Ahora establezca el área por punto en 32, 400 nanómetros cuadrados. Cuente el número de aciertos dentro de la longitud disponible en las 12 imágenes subsarcolemmales donde una cruz golpea el glucógeno subsarcolemmal. Inserte una cuadrícula haciendo clic en analizar, luego seleccione herramientas, seguido de cuadrícula y establezca el área por punto en 160, 000 nanómetros cuadrados.Cuente el número de aciertos en las 12ª imágenes miofibrilares donde una cruz golpea el espacio intramiofibrilar. Por otra parte, para insertar una cuadrícula, haga clic en analizar, seleccione herramientas y luego seleccione cuadrícula. Ahora establezca el área por punto en 3, 600 nanómetros cuadrados.Cuente el número de aciertos en las 12ª imágenes miofibrilares donde una cruz golpea el glucógeno intramiofibrilar. Inserte una cuadrícula haciendo clic en analizar, luego seleccione herramientas, seguido de cuadrícula y establezca el área por punto en 32, 400 nanómetros cuadrados. Cuente el número de golpes en las 12ª imágenes miofibrilares donde una cruz golpea el glucógeno intermiofibrilar.Usando la cuadrícula de 32, 400 nanómetros cuadrados para elegir aleatoriamente las partículas de glucógeno, comience con el cuadrado superior izquierdo y muévase a la izquierda si es necesario. Usando la herramienta de línea recta, mida el diámetro de cinco partículas de glucógeno elegidas al azar de cada grupo para cada una de las 12 imágenes para obtener un promedio de 60 partículas por grupo por fibra. Esta figura muestra los valores normales de las tres piscinas de glucógeno.Se puede observar que los valores de glucógeno intermiofibrilar se distribuyen cerca de lo normal, mientras que tanto el glucógeno intramiofibrilar como el subsarcolemado muestran una distribución sesgada donde las fibras a veces tienen una cantidad excesiva de glucógeno. Entre todos los pasos es muy importante usar ferrocianuro de potasio. El análisis de glucógeno se puede combinar con el análisis de mitocondrias y gotas lipídicas que pueden mejorar nuestra comprensión de cómo otros componentes metabólicos clave se correlacionan con el glucógeno y la salud muscular.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Investigación

Bioquímica

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Análisis de anomalías inducida por β-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina por espectroscopía y microscopía electrónica de barrido

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Preparación de películas de soporte de muestra en microscopía electrónica de transmisión utilizando un bloque de flotación de soporte

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatronaje Transmisión Microscopía Microscopía Rejillas para Dirigir el Posicionamiento Celular dentro de los Flujos de Trabajo de Tomografía Crioelectrónica de Celda Entera

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Medición de la capacidad de importación de proteínas de las mitocondrias del músculo esquelético

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

Determinación de la distribución de la longitud de la cadena de glucano del glucógeno utilizando el método de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Recopilación rutinaria de conjuntos de datos crio-EM de alta resolución utilizando un microscopio electrónico de transmisión de 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Cuantificación basada en imágenes de alto rendimiento de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...