Name: quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Sveriges Olympiska Kommitté.

Det nuvarande protokollet med användning av humana biopsierade skelettmuskelprover godkändes av de regionala kommittéerna för hälsoforskningsetik för södra Danmark (S-20170198). Muskelbiopsier erhölls genom ett snitt i huden från vastus lateralismuskeln med hjälp av en Bergströmnål med sug efter att lokalbedövning gavs subkutant (1-3 ml lidokain 2 % per snitt). Om isolerade hela råttmuskler användes offrades djuren genom cervikal dislokation innan muskelbiopsierna erhölls, i enlighet med riktlinj...

<ol>
	<li>Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+life+of+the+glycogen+granule.">The dynamic life of the glycogen granule.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).</li><li>Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+glycogen+depletion+pattern+in+human+muscle+fibres+after+exercise+of+varying+intensity+and+at+varying+pedalling+rates.">Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates.</a> Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).</li><li>James, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+both+aerobic+glycolysis+and+Na+-K+-ATPase+activity+in+skeletal+muscle+by+epinephrine+or+amylin.">Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).</li><li>Jensen, R., Nielsen, J., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+glycogenolysis+prolongs+action+potential+repriming+period+and+impairs+muscle+function+in+rat+skeletal+muscle.">Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle.</a> Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).</li><li>Green, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+important+is+endogenous+muscle+glycogen+to+fatigue+in+prolonged+exercise.">How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).</li><li>Fitts, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+muscle+fatigue.">Cellular mechanisms of muscle fatigue.</a> Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).</li><li>Wanson, J. C., Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+glycogen+metabolism.">Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism.</a> Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).</li><li>Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+the+human+brachial+biceps+muscle.">Fiber types in the human brachial biceps muscle.</a> Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).</li><li>Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+glycogen.+Electron+microscopic+study+of+the+negative+stains+of+particulate+glycogen.">Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li><li>Thiery, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+polysaccharides+on+thin+sections+by+electron+microscopy.">Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).</li><li>De Bruijn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen,+its+chemistry+and+morphologic+appearance+in+the+electron+microscope.+I.+A+modified+OsO4+fixative+which+selectively+contrasts+glycogen.">Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen.</a> Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).</li><li>Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+accumulation+in+polymorphonuclear+leukocytes,+and+other+intracellular+alterations+that+occur+during+inflammation.">Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation.</a> The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).</li><li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes+-+the+organelles+of+glycogen+metabolism.">Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li><li>Gadisseux, J. F., Evrard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-neuronal+relationship+in+the+developing+central+nervous+system.+A+histochemical-electron+microscope+study+of+radial+glial+cell+particulate+glycogen+in+normal+and+reeler+mice+and+the+human+fetus.">Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus.</a> Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).</li><li>Frid&#233;n, J., Seger, J., Ekblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+periodic+acid-thiosemicarbazide-silver+proteinate+staining+for+ultrastructural+assessment+of+muscle+glycogen+utilization+during+exercise.">Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise.</a> Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+subcellular+glycogen+in+resting+human+muscle:+granule+size,+number,+and+location.">Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location.</a> Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).</li><li>Marchand, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+muscle+glycogen+granules+size+and+number+in+subcellular+locations+during+recovery+from+prolonged+exercise.">Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise.</a> Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).</li><li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Glycogenolysis+Modulates+Histone+Acetylation+in+Human+Non-Small+Cell+Lung+Cancers.">Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).</li><li>Jensen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+subcellular+muscle+glycogen+utilisation+during+exercise+impacts+endurance+capacity+in+men.">Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men.</a> Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).</li><li>Nielsen, J., Schr&#248;der, H. D., Rix, C. G., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+subcellular+glycogen+localization+on+tetanic+relaxation+time+and+endurance+in+mechanically+skinned+rat+skeletal+muscle+fibres.">Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).</li><li>Nielsen, J., Cheng, A. J., &#216;rtenblad, N., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+glycogen+and+decreased+tetanic+Ca2++in+fatigued+single+intact+mouse+muscle+fibres.">Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).</li><li>Mead, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+constraints+in+synchronous+muscle+limit+superfast+motor+control+in+vertebrates.">Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates.</a> eLife. 6, 29425 (2017).</li><li>Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., &#216;rtenblad, N., B&#248;tker, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+subcellular+glycogen+distribution+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling:+effects+of+ischaemia,+reperfusion+and+ischaemic+preconditioning.">Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning.</a> Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).</li><li>Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schr&#248;der, H. D., Saltin, B., &#216;rtenblad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+glycogen+utilization+in+exhaustive+exercise:+role+of+subcellular+localization+and+fibre+type.">Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type.</a> Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).</li><li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new,+simple+and+efficient+stereological+methods+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).</li><li>Saltin, B., Gollnick, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+adaptability:+significance+for+metabolism+and+performance.">Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance.</a> Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).</li><li>Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-dependent+decrements+in+skeletal+muscle+glycogen+and+mitochondria+content+following+short-term+disuse+in+young+and+old+men.">Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men.</a> American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).</li><li>Hokken, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization-+and+fibre+type-dependent+utilization+of+muscle+glycogen+during+heavy+resistance+exercise+in+elite+power+and+Olympic+weightlifters.">Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters.</a> Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).</li><li>Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glycogen+storage+of+a+subcellular+hot+spot+in+human+skeletal+muscle+during+early+recovery+from+eccentric+contractions.">Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions.</a> PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).</li><li>Sj&#246;str&#246;m, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analyses+of+human+muscle+fiber+types.">Morphometric analyses of human muscle fiber types.</a> Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).</li><li>Gejl, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+depletion+of+glycogen+with+supramaximal+exercise+in+human+skeletal+muscle+fibres.">Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).</li><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li></ol>

Det kritiska steget i metoden är användningen av reducerat osmium med kaliumferrocyanid under postfixering. Selektiviteten hos detta modifierade fixeringsmedel för glykogendetektion kan inte helt förklaras av kemi, utan innefattar även experimentella fynd som visar att sådana partiklar inte kan detektioneras i vävnader som är kända för att vara fria från glykogen eller i det extracellulära utrymmet11.
Kritiska parametrar är precisionen i uppskattningarna oc...

Glykogenpartiklar består av grenade polymerer av glukos och olika associerade proteiner1 och utgör ett viktigt bränsle under höga metaboliska krav2. Även om det inte är allmänt erkänt, utgör glykogenpartiklar också ett lokalt bränsle, där vissa subcellulära processer företrädesvis utnyttjar glykogen trots tillgången på andra och mer långvariga bränslen som plasmaglukos och fettsyror3,4.
Vikten av att lagra glykogen som ett subcellulärt specifikt lokaliserat bränsle har diskuterats i flera översikter5,6 huvudsakligen baserat på några av de tidigaste dokumentationerna av den subcellulära fördelningen av glykogen genom transmissionselektronmikroskopi (TEM)7,8. De första studierna använde olika protokoll för att öka kontrasten mellan glykogen från histokemiska färgningstekniker till negativa och positiva färgningar9,10. En viktig metodologisk utveckling var det raffinerade postfixeringsprotokollet med kaliumferrocyanidreducerat osmium11,12,13,14, vilket signifikant förbättrade kontrasten mellan glykogenpartiklar. Detta förfinade protokoll användes inte i något av det banbrytande arbetet med träningsinducerad glykogenutarmning15 men återinfördes av Graham och kollegor16,17.
Baserat på de 2-dimensionella bilderna beskrivs den subcellulära fördelningen av glykogen oftast som glykogenpartiklar belägna i tre pooler: subsarkolemmal (strax under ytmembranet), intermyofibrillär (mellan myofibrillerna) eller intramyofibrillar (inom myofibrillerna). Glykogenpartiklar kan emellertid också beskrivas som associerade med exempelvis sarkoplasmatisk retikulum7 eller kärnor18. Förutom den subcellulära fördelningen är fördelen med TEM-uppskattat glykogeninnehåll också att kvantifiering kan utföras på enstaka fibernivå. Detta möjliggör undersökning av fiber-till-fiber-variabilitet och korrelativa analyser med fibertyper och cellulära komponenter som mitokondrier och lipiddroppar.
Här beskrivs protokollet för det TEM-uppskattade fibertypspecifika volymetriska innehållet i de tre gemensamma subcellulära poolerna av glykogen (subsarkolemmal, intermyofibrillär och intramyofibrillär) i skelettmuskelfibrer. Metoden har tillämpats på skelettmuskler från människor19, råttor20 och möss21; samt fåglar och fiskar22; och kardiomyocyter från råttor23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Propylene oxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-56-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding 812 resin medium kit</td>
			<td>Taab</td>
			<td>T031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04239.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITEM</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM AC20</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Automatic contrasting system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSIS Veleta digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>0972A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM 100 Transmission EM</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455989-245G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4</td>
			<td>Ampliqon.com</td>
			<td>AMPQ40989.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-microtome Leica UC7</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>6159-44-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy

Med användning av transmissionselektronmikroskopi kan högupplösta bilder av fasta prover innehållande enskilda muskelfibrer erhållas. Detta möjliggör kvantifieringar av ultrastrukturella aspekter såsom volymfraktioner, förhållandet mellan yta och volym, morfometri och fysiska kontaktställen för olika subcellulära strukturer. På 1970-talet utvecklades ett protokoll för förbättrad färgning av glykogen i celler och banade väg för en rad studier om subcellulär lokalisering av glykogen och glykogenpartikelstorlek med hjälp av transmissionselektronmikroskopi. Medan de flesta analyser tolkar glykogen som om det är homogent fördelat i muskelfibrerna, vilket endast ger ett enda värde (t.ex. en genomsnittlig koncentration), har transmissionselektronmikroskopi avslöjat att glykogen lagras som diskreta glykogenpartiklar belägna i distinkta subcellulära fack. Här beskrivs steg-för-steg-protokollet från vävnadsinsamling till kvantitativ bestämning av volymfraktionen och partikeldiametern för glykogen i de distinkta subcellulära facken i enskilda skelettmuskelfibrer. Överväganden om hur man 1) samlar in och fläckar vävnadsprover, 2) utför bildanalyser och datahantering, 3) utvärderar precisionen i uppskattningar, 4) diskriminerar mellan muskelfibertyper och 5) metodologiska fallgropar och begränsningar ingår.

Med hjälp av detta protokoll verkar glykogenpartiklar svarta och distinkta (figur 1 och figur 2). De normala värdena för glykogen visas i figur 3. Dessa data är baserade på totalt 362 fibrer från 41 friska unga män som samlats in i olika tidigare studier19,24,29,30,31.</...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Ett modifierat efterfixeringsförfarande ökar kontrasten mellan glykogenpartiklar i vävnad. Detta dokument ger ett steg-för-steg-protokoll som beskriver hur man hanterar vävnaden, utför avbildningen och använder stereoologiska metoder för att erhålla opartiska och kvantitativa data om fibertypspecifik subcellulär glykogenfördelning i skelettmuskeln.

Kvantifiering av subcellulär glykogenfördelning i skelettmuskelfibrer med hjälp av transmissionselektronmikroskopi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Måttet på glykogeninnehåll i enskilda celler och subcellulära organisationer är viktigt eftersom enskilda celler i de flesta celltyper anpassar sig annorlunda till förändrade fysiologiska tillstånd och sjukdomar. Så den största fördelen med denna teknik är den mycket höga upplösningen i transmissionselektronmikroskopet. Detta förbättrar möjligheten att ha lokaliserade subcellulära strukturer och även i detta innehåll i denna teknik här är det viktigt att glykogenfärgningen är antikroppsfri.Så vi har ingen specificitet att oroa oss för. För att få en bättre kontrast på glykogen, använd bara kaliumferrocyanid 1,5% istället för kaliumferrocyanid. Förbered 1,6 ml av den primära fixativa lösningen genom tillsats av 2,5 % glutaraldehyd i 0,1 molär natriumkakodylatbuffert i ett mikrocentreringsrör på två milliliter.Förvara den vid fem grader Celsius i högst 14 dagar. Isolera ett litet prov från muskelbioptin eller hela muskeln som har en maximal diameter på en millimeter i vilken riktning som helst och är längre i längdriktningen än tvärsnittet. Placera provet i röret som innehåller den kalla primära fixeringslösningen.Förvara den vid fem grader Celsius i 24 timmar. Tvätta sedan provet fyra gånger i 0,1 molär natriumkacodylatbuffert. Använd överföringspipetter, ta bort den använda bufferten från röret och lämna provet orört och tillsätt den färska bufferten.Efterfixera provet med 1% osmiumtetroxid och 1,5% kaliumferrocyanid i 0,1 molär natriumkakodylatbuffert i 120 minuter vid fyra grader Celsius. Skölj provet två gånger i dubbeldestillerat vatten vid rumstemperatur. Dehydrera genom nedsänkning i en graderad serie etanol vid rumstemperatur.Infiltrera provet med propylenoxid och epossidiska hartsgraderade blandningar vid rumstemperatur med användning av de nämnda volymförhållandena. Följande dag, bädda in prover i 100% färskt epossidiskt harts i formar och polymerisera vid 60 grader Celsius i 48 timmar. Montera blocket av ett prov på ultramikrotomhållaren.Trimma blocket på ytan med ett rakblad för att nå vävnadsnivån. Montera en diamantkniv framför provet och rikta in provytan parallellt med kniven. Producera en halvtunn sektion med en mikrometertjocklek med diamantkniven för att kontrollera provets orientering.Fläcka den halvtunna sektionen med toluidinblå för observation med ljusmikroskopi. Trimma sedan blocket ytterligare för att minska intresseområdet för att få ordentliga ultratunna sektioner. Skär ultratunna sektioner med en tjocklek på 60 till 70 nanometer med en andra diamantkniv.Samla en till två sektioner på ett helt kopparnät med en perfekt slinga. För att kontrastera sektionerna, sänk ner gallren i uranylacetatlösning i 20 minuter och tvätta gallret i dubbelt destillerat vatten och sänk sedan ner gallret i blycitrat i 15 minuter och tvätta gallret igen i dubbelt destillerat vatten. Slå på överföringselektronmikroskopdatorn och bildinspelningsprogramvaran, spela in digitala bilder med en digital Slow Scan CCD-kamera och tillhörande bildprogramvara.Efter att ha satt in gallret med flera sektioner i mikroskopsteget, skärma gallret initialt vid låg förstoring för att välja sektioner av bästa kvalitet och bestämma muskelfibrernas riktning. Nästa fokus, bilden vid förstoring över 30 000 med strålen centrerad på en perifer fiber i sektionen och spela in bilder med en sekunds exponeringstid vid önskad förstoring. Se till att bilderna fördelas över fiberns längd och bredd i en randomiserad bot systematisk ordning för att få opartiska resultat och upprepa avbildningen tills sex till 10 fibrer avbildas.Importera bilder till bild J genom att klicka på filen följt av öppna. Ställ in global skala så att den matchar bildens ursprungliga storlek genom att klicka på analysera och sedan ställa in skala. För att zooma in 100% klicka på bilden, gå till zooma och klicka på in.Mät tjockleken på en Z-skiva per bild av det myofibrillära utrymmet med hjälp av det raka linjeverktyget från verktygsmenyn och beräkna den genomsnittliga Z-skivtjockleken för var och en av de sex till 10 fibrerna. Använd det segmenterade linjeverktyget för att mäta längden på den yttersta myofibril som syns strax under den subsarkolemmala regionen. För att infoga ett rutnät, klicka på analysera, välj verktyg och välj sedan rutnät.Ställ nu in området per punkt på 32 400 kvadrat nanometer. Räkna antalet träffar inom den tillgängliga längden i de 12 subsarcolemmala bilderna där ett kors träffar subsarcolemmal glykogen. Sätt in ett rutnät genom att klicka på analysera, välj sedan verktyg, följt av rutnät och ställ in yta per punkt på 160 000 kvadrat nanometer.Räkna antalet träffar i de 12: e myofibrillära bilderna där ett kors träffar det intramyofibrillära utrymmet. Återigen, för att infoga ett rutnät, klicka på analysera, välj verktyg och välj sedan rutnät. Ställ nu in området per punkt på 3 600 kvadrat nanometer.Räkna antalet träffar i de 12: e myofibrillära bilderna där ett kors träffar intramyofibrillärt glykogen. Infoga ett rutnät genom att klicka på analysera, välj sedan verktyg, följt av rutnät och ställ in yta per punkt på 32 400 kvadrat nanometer. Räkna antalet träffar i de 12: e myofibrillära bilderna där ett kors träffar den intermyofibrillära glykogenen.Använd rutnätet på 32 400 kvadratcentimeter för att slumpmässigt välja glykogenpartiklarna, börja med den övre vänstra kvadraten och flytta åt vänster om det behövs. Med hjälp av ett linjärt verktyg mäter du diametern på fem slumpmässigt utvalda glykogenpartiklar i varje pool för var och en av de 12 bilderna för att erhålla i genomsnitt 60 partiklar per pool per fiber. Denna figur visar de normala värdena för de tre glykogenpoolerna.Det kan observeras att intermyofibrillära glykogenvärden fördelas nära det normala, medan både intramyofibrillärt och subsarkolemmalt glykogen visar skev fördelning där fibrer ibland har en överdriven mängd glykogen. Bland alla steg är det mycket viktigt att använda kaliumferrocyanid. Analysen av glykogen kan kombineras med analys av mitokondrion och lipiddroppar som kan förbättra vår förståelse för hur andra viktiga metaboliska komponenter korrelerar med glykogen och muskelhälsa.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Förbättrat protokoll för kromatin Immunoprecipitation från mus skelettmuskulatur

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analys av β-Amyloid-inducerad avvikelser på Fibrin Clot struktur av spektroskopi och svepelektronmikroskopi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Förberedelse av provstödsfilmer i transmissionselektronmikroskopi med hjälp av ett stödflötblock

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropapper transmission elektronmikroskopinät till direkt cellpositionering inom arbetsflöden för hela cell cryo-elektrontomografi

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mätning av proteinimportkapacitet av skelettmuskulatur mitokondrier

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

Bestämning av glukankedjelängdsfördelning av glykogen med hjälp av fluoroforassisterad kolhydratelektroforesmetod (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Bildbaserad kvantifiering av mitokondriell DNA-syntes och distribution med hög kapacitet

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...