Name: isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells
Uploaded: 2022-08-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells at JoVE.com

We erkennen Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Dierenarts Specialist, Faculteit Farmacie, De Britse Universiteit van Egypte (BUE) voor het helpen met de dissectie van de ratten.
We willen ook de inspanningen van de Faculteit massacommunicatie, de Britse Universiteit in Egypte (BUE) voor de productie en bewerking van de video van dit manuscript erkennen en waarderen.
We willen graag Miss Fatma Masoud, MSc, Assistant Lecturer of English, The British University in Egypt (BUE) bedanken voor de revisie en het proeflezen in de Engelse taal van het manuscript.
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculteit Farmacie, De Britse Universiteit in Egypte (BUE), Caïro, Egypte.

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde richtlijnen en alle procedures werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Faculteit Farmacie, De Britse Universiteit in Egypte (BUE), Caïro, Egypte. Het Ad-MSC isolatieprotocol is overgenomen van Lopez en Spencer, met wijzigingen15.
1. Isolatie van Ad-MSC's van ratten epididymale vetkussens
<ol><li>Gebruik mannelijke Sprague-Dawley-ratten met een gewicht van 250-300 g die niet oude...

<ol>
	<li>Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+for+cancer+therapy.">Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).</li><li>Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+and+therapeutic+strategies+of+mesenchymal+stem+cells+in+regenerative+medicine.">Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine.</a> Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow.">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li><li>De Ugarte, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+stem+cell+mobilization-associated+molecules+on+multi-lineage+cells+from+adipose+tissue+and+bone+marrow.">Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow.</a> Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).</li><li>Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+and+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells:+A+user's+guide.">Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide.</a> Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).</li><li>Camara, B. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+canine+adipose+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells:+Comparison+of+different+culture+medium+compositions.">Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions.</a> Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion,+and+differentiation+of+goat+adipose-derived+stem+cells.">Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells.</a> Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).</li><li>Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-tissue+engineering:+Taking+advantage+of+the+properties+of+human+adipose-derived+stem/stromal+cells.">Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells.</a> Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Gong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+stimulate+intestinal+stem+cells+to+repair+radiation-induced+intestinal+injury.">Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2387 (2016).</li><li>Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine+applications.">Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications.</a> Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).</li><li>Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effect+of+adipose-derived+stem+cells:+The+cutting+edge+of+clinical+application.">Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).</li><li>Karp, J., Leng Teo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+homing:+The+devil+is+in+the+details.">Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details.</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).</li><li>Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Lopez, M. J., Spencer, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+adult+rat+adipose+tissue-derived+stromal+cell+isolation+and+differentiation.">In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).</li><li>Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+insulin-producing+cells+from+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+by+genetic+manipulation.">Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation.</a> Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).</li><li>Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+phenotype+and+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells+aging+in+vitro.">Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 131 (2018).</li><li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stromal+cells+from+human+marrow+home+to+and+promote+repair+of+pancreatic+islets+and+renal+glomeruli+in+diabetic+NOD/scid+mice.">Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).</li><li>Gao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+apelin+in+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cell+reverses+insulin+resistance+and+promotes+pancreatic+&#946;+cell+proliferation+in+type+2+diabetic+rats.">Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic &#946; cell proliferation in type 2 diabetic rats.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 339 (2018).</li><li>Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+mesenchymal+stromal/stem+cells+to+insulin-producing+cells:+Progress+and+challenges.">From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exendin-4+enhances+the+differentiation+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells+through+activation+of+various+&#946;-cell+markers.">Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various &#946;-cell markers.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 108 (2016).</li><li>Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+diabetic+retinopathy+by+engrafted+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+in+streptozotocin+diabetic+rats.">Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).</li><li>Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+induce+angiogenesis+and+attenuate+the+remodeling+of+diabetic+cardiomyopathy.">Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy.</a> Experimental and Clinical Endocrinology &amp; Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).</li><li>Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+potential+of+early-+and+late-passage+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+hypoxia+and+normoxia.">Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia.</a> Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).</li><li>Krishnamurthy, H., Cram, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+flow+cytometry.">Basics of flow cytometry.</a> Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).</li><li>Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exendin-4+enhances+osteogenic+differentiation+of+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+through+the+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappa+B+and+osteoprotegerin+signaling+pathway.">Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+from+obese+mice+prevent+body+weight+gain+and+hyperglycemia.">Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 277 (2021).</li><li>Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-step+mechanical+digestion+method+to+harvest+adipose-derived+stromal+vascular+fraction.">A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).</li><li>Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue-derived+stem+cells:+Enzymatic+digestion+in+combination+with+mechanical+distortion+to+increase+adipose+tissue-derived+stem+cell+yield+from+human+aspirated+fat.">Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).</li><li>Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase+impacts+the+quantity+and+quality+of+native+mesenchymal+stem/stromal+cells+derived+during+processing+of+umbilical+cord+tissue.">Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue.</a> Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).</li><li>Kamal, M. M., Kassem, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+for+diabetes:+Achievements+and+challenges.">Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).</li><li>Gabr, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+human+mesenchymal+stem+cells+to+insulin-producing+cells:+Comparison+between+bone+marrow-+and+adipose+tissue-derived+cells.">From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells.</a> BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+differentiated+from+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+vitro+ameliorate+streptozotocin-induced+diabetic+hyperglycemia.">Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia.</a> PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+efficacy+of+umbilical+cord-derived+stem+cells+for+diabetes+mellitus:+A+meta-analysis+study.">Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 484 (2020).</li><li>El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Wharton's+jelly+and+cord+blood+as+a+source+of+mesenchymal+stem+cells+for+diabetes+cell+therapy.">A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy.</a> Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+expression+levels+of+pluripotency/stem+cell+markers+with+the+differentiation+outcome+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin+producing+cells.">Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells.</a> Biochimie. 127, 187-195 (2016).</li><li>El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+can+potentially+differentiate+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells.">Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells.</a> Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).</li><li>Gabr, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+from+adult+human+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells+could+control+chemically+induced+diabetes+in+dogs:+A+preliminary+study.">Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study.</a> Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).</li></ol>

In dit protocol zijn we erin geslaagd om een gedetailleerd protocol te presenteren voor de isolatie van Ad-MSC's van rattenepidemaal vet en de differentiatie van deze Ad-MSC's in IPC's. In feite is epidydimaal vet van ratten een gemakkelijk bereikbare bron van vetweefsel voor het verkrijgen van Ad-MSC's en is er geen speciale apparatuur nodig, noch voor verzameling noch voor het verwerken van 15,26,27. De geïsoleerde Ad-MSC's v...

Mesenchymale stamcellen (MSC's), ook bekend als mesenchymale stromale cellen, behoren tot de meest gebruikte celtypen voor regeneratieve geneeskunde 1,2. Ze worden geclassificeerd als volwassen stamcellen en gekenmerkt door multilineaire differentiatiepotentieel en zelfvernieuwingscapaciteit3. MSC's kunnen worden geïsoleerd en verkregen uit verschillende bronnen, waaronder vetweefsel, beenmerg, perifeer bloed, navelstrengweefsel en bloed, haarzakjes en tanden 4,5.
De isolatie van stamcellen uit vetweefsel wordt gezien als zowel aantrekkelijk als veelbelovend vanwege hun gemakkelijke toegang, snelle expansie in vitro en hoge opbrengst6. Vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (Ad-MSC's) kunnen worden geïsoleerd van verschillende soorten zoals mensen, runderen, muizen, ratten en, meer recent, geiten7. Het is bewezen dat Ad-MSC's nu potentiële kandidaten zijn voor tissue engineering en gen/celtherapie die zelfs kunnen worden gebruikt om een autoloog alternatief te ontwikkelen voor het langdurig herstel van wekedelenletsel of defecten 7,8.
De International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) heeft drie minimumcriteria gedefinieerd die door MSC's moeten worden tentoongesteld voor volledige karakterisering9. Ten eerste moeten ze plastic hechten. Ten tweede moeten MSC's mesenchymale stamceloppervlakmarkers zoals CD73, CD90 en CD105 tot expressie brengen en de expressie van de hematopoëtische markers CD45, CD34, CD14 of CD11b, CD79α of CD19 en HLA-DR missen. Ten slotte moeten MSC's het vermogen vertonen om te differentiëren in de drie mesenchymale afstammingslijnen: adipocyten, osteocyten en chondrocyten. Interessant is dat MSC's ook kunnen differentiëren in andere afstammingslijnen zoals neuronale cellen, cardiomyocyten, hepatocyten en epitheelcellen10,11.
In feite bezitten MSC's unieke eigenschappen die het mogelijk maken om ze toe te passen als potentiële therapeutische middelen in regeneratieve therapie voor verschillende ziekten. MSC's kunnen oplosbare factoren afscheiden om een immunomodulerende omgeving te induceren die therapeutische voordelen biedt12. Bovendien kunnen MSC's migreren naar plaatsen van letsel en tumormicro-omgevingen om gerichte therapie te leveren; de mechanismen zijn echter niet volledig opgehelderd13. Bovendien hebben MSC's de mogelijkheid om exosomen, extracellulaire blaasjes op nanoschaal die een lading niet-coderende RNA's, eiwitten en oplosbare factoren dragen, uit te scheiden, die onlangs naar voren kwamen als een nieuw mechanisme van het therapeutische potentieel van de MSC's bij verschillende ziekten14.
Wat nog belangrijker is, msc's hebben duidelijke aandacht gegenereerd voor hun potentieel om te differentiëren in insulineproducerende cellen (IPC's), hetzij door genetische modificatie15,16 of door gebruik te maken van verschillende extrinsieke inducerende factoren binnen de kweekmedia in vitro17. De IPC-inductieperiode varieert sterk, omdat deze afhankelijk is van het gebruikte inductieprotocol en de gebruikte extrinsieke factoren. Het proces van differentiatie kan dagen tot maanden duren en vereist een combinatie van exogene inducerende factoren die in verschillende stadia moeten worden toegevoegd en / of ingetrokken. Veel van deze factoren die zijn gebruikt voor endocriene pancreasdifferentiatie zijn biologisch actieve verbindingen waarvan is aangetoond dat ze de proliferatie of differentiatie / neogenese van insuline-afscheidende β-cellen bevorderen en / of het insulinegehalte van IPC's verhogen 18,19,20,21. Het is hier opmerkelijk dat MSC's ook zijn gemeld met therapeutische effecten bij diabetes en de complicaties ervan via verschillende mechanismen, waaronder hun secretoom, evenals een breed scala aan immunomodulerende acties 22,23,24.
In dit protocol presenteren we een gedetailleerd stapsgewijs protocol voor de isolatie en karakterisering van Ad-MSC's van rattenepitheel vet, gevolgd door een eenvoudig, relatief kort protocol voor het genereren van IPC's van Ad-MSC's.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin, bovine serum Fraction V</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A3157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Rat CD90, FITC</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60024FI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 Monoclonal Antibody, FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA</td>
			<td>MA1-19594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA</td>
			<td>PA5-85917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I, powder</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher, USA</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose anhydrous, extra pure</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>G/0450/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithizone staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose 4.5 g/L</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low Glucose 1 g/L</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>12-707F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse/RNAse free water</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>24103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exendin-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E7144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, Brazil</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit</td>
			<td>R&#38;D systems Inc., MN, USA</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Insulin ELISA Kit</td>
			<td>Cloud-Clone Corp., USA</td>
			<td>CEA682Ra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Maxima</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>K0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.2 micron</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>431224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene-EDTA, 1X</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verso cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>AB-1453/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells

Mesenchymale stamcellen (MSC's) - vooral die geïsoleerd uit vetweefsel (Ad-MSC's) - hebben speciale aandacht gekregen als een hernieuwbare, overvloedige bron van stamcellen die geen ethische problemen oplevert. De huidige methoden om Ad-MSC's te isoleren zijn echter niet gestandaardiseerd en maken gebruik van gecompliceerde protocollen waarvoor speciale apparatuur nodig is. We isoleerden Ad-MSC's uit het epididymale vet van Sprague-Dawley-ratten met behulp van een eenvoudige, reproduceerbare methode. De geïsoleerde Ad-MSC's verschijnen meestal binnen 3 dagen na isolatie, omdat adherente cellen fibroblastische morfologie vertonen. Die cellen bereiken 80% samenvloeiing binnen 1 week na isolatie. Daarna, bij passage 3-5 (P3-5), werd een volledige karakterisering uitgevoerd voor de geïsoleerde Ad-MSC's door immunofenotypering voor karakteristieke MSC cluster van differentiatie (CD) oppervlaktemarkers zoals CD90, CD73 en CD105, evenals het induceren van differentiatie van deze cellen in de osteogene, adipogene en chondrogene afstammingslijnen. Dit impliceert op zijn beurt de multipotentie van de geïsoleerde cellen. Bovendien hebben we de differentiatie van de geïsoleerde Ad-MSC's naar de insulineproducerende cellen (IPC's) -afstamming geïnduceerd via een eenvoudig, relatief kort protocol door het gemodificeerde Eagle-medium (HG-DMEM) van hoge glucose Dulbecco op te nemen, β-mercaptoethanol, nicotinamide en exendin-4. IPC-differentiatie werd genetisch beoordeeld, ten eerste, door het meten van de expressieniveaus van specifieke β-cel markers zoals MafA, NKX6.1, Pdx-1 en Ins1, evenals dithizonkleuring voor de gegenereerde IPC's. Ten tweede werd de beoordeling ook functioneel uitgevoerd door een glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) assay. Kortom, Ad-MSC's kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd, met alle MSC-karakteriseringscriteria, en ze kunnen inderdaad een overvloedige, hernieuwbare bron van IPC's in het laboratorium bieden voor diabetesonderzoek.

Isolatie en karakterisering van Ad-MSC's Zoals te zien is in figuur 2, vertoonden de geïsoleerde cellen uit vetweefsel een heterogene populatie van afgeronde en fibroblastachtige cellen vanaf de volgende dag van isolatie (figuur 2A). 4 dagen na isolatie begonnen de fibroblastcellen in aantal en grootte toe te nemen en groeiden ze als een homogene populatie door passage 1 (figuur 2B,C). Deze cell...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells at JoVE.com

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (Ad-MSC's) kunnen een potentiële bron zijn van MSC's die differentiëren in insulineproducerende cellen (IPC's). In dit protocol bieden we gedetailleerde stappen voor de isolatie en karakterisering van epididymale Ad-MSC's bij ratten, gevolgd door een eenvoudig, kort protocol voor het genereren van IPC's van dezelfde rat Ad-MSC's.

Isolatie van rat vetweefsel Mesenchymale stamcellen voor differentiatie in insulineproducerende cellen

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

Het algemene doel van dit protocol is om rood vetweefsel, gedroogde mesenchymale stamcellen te isoleren en te karakteriseren en te differentiëren naar insulineproducerende cellen met behulp van eenvoudige methoden. Mesenchymale stamcellen hebben de wegen gevonden op het gebied van genetica. Ze kunnen worden geïsoleerd uit verschillende bronnen zoals beenmerg, vetweefsel en perinataal weefsel.Ze accepteren uitstekende culturele kenmerken. Ze zijn multi-potent en kunnen mogelijk verschillende ziekten behandelen. Vetweefsel biedt een rijke bron van mesenchymale stamcellen.Deze vetachtige MSC's kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit lipo-aspiraten met een hoge opbrengst in vergelijking met andere bronnen zoals beenmerg. En ze kunnen een goede bron zijn voor zowel autologe als allogene transplantatie. In deze video presenteren we een eenvoudig protocol voor isolatie en karakterisering van vet mesenchymale stamcellen uit rattenepidemaal vet.Deze procedure is een eenvoudige, zeer efficiënte methode voor isolatie. Na isolatie zullen we de differentiatie van deze vet mesenchymale stamcellen in insulineproducerende cellen doorstaan met behulp van een eenvoudig, relatief kort protocol. We zullen beginnen met isolatie van vet mesenchymale stamcellen door collageenachtige vertering van epididymal vet om een sterkere vasculaire fractie te verkrijgen.Dan zullen mesenchymale stamcellen worden gekenmerkt door hun plastic hechting, evenals expressie van CD-markers en differentiatie in meerdere mesodermale afstammingslijnen. Anesthiseer het dier en euthanaseer vervolgens met behulp van cervicale dislocatie. Spray over het hele lichaam met 70% ethanol en begin met excisie van de huid en de spieren aan de onderkant van de buik.Stel vervolgens de teelballen bloot met het epididymale vet. Snijd voorzichtig het epididymale vet. Pas op dat je de bloedvaten niet doorsnijdt met de vetten.Snijd in een bioveiligheidskast het vetweefsel in kleine stukjes met behulp van een tang en scalpel. Breng het vetweefsel over in een centrifugebuis met 10 milliliter steriel PBS. Begin met wassen door de Falcon-buis gedurende 45 seconden te kantelen.Houd de buis vervolgens vijf minuten staan om in twee lagen te scheiden. Verwijder de infranated PBS met een spuit van 10 milliliter. Herhaal deze wasstappen vier tot vijf keer totdat PBS duidelijk is.Na het wassen, suspensieer vetweefsel opnieuw in collageenoplossing en incubeer vervolgens in schudwaterbad totdat het weefsel bijna homogeen is. Vortex daarna het weefselcollageenmengsel gedurende 15 seconden en centrifugeer daarna gedurende vijf minuten. Na centrifugatie heb je drie lagen.Gooi het supernatant voorzichtig weg over de stromale vasculaire fractie. Gooi eerst de olielaag aan de bovenkant voorzichtig weg, gevolgd door de echolaag zonder de stromale vasculaire fractiekorrel te verstoren. Suspensie de stromale vasculaire fractie opnieuw in steriel BSA en centrifugeer gedurende vijf minuten opnieuw.Hele centrifugatie, plaats complete DMEM F-12 media in een vierkante kolf van 25 centimeter. Gooi na centrifugatie het supernatant weg en suspensie de stromale vasculaire pellet opnieuw in volledige DMEM F-12-media. En overhevel naar de kweekfles.Plaats in 37 graden 5% kooldioxide incubator. Verwijder de volgende dag niet-losse cellen en vervang de media door nieuwe media. Vanaf de volgende dag van isolatie zullen de fibroblastachtige cellen beginnen te verschijnen.Geleidelijk aan naarmate de tijd verstrijkt, zullen ze in aantal en grootte toenemen. Door passaging worden cellen homogener. Deze cellen vertonen alle mesenchymale stamcelkarakteriseringscriteria.Deze cellen werden gedifferentieerd naar insulineproducerende cellen met behulp van dit eenvoudige protocol dat nicotinamide bèta-mercaptoethanol en Exendin-4 bevat. Tijdens de differentiatiestappen beginnen de cellen hun fibroblastische vorm te verliezen en ik denk clusterachtige morfologie. Wanneer gebruikte insulineproducerende cellen positieve karmozijnrode disithone-kleuring vertonen, waarna gebruikte insulineproducerende cellen verschillende bètacelmarkers tot expressie brengen, zoals Pdx-1, mafA en insuline.Bovendien scheiden geïnduceerde insulineproducerende cellen hogere niveaus van insuline in het supernatant af wanneer ze worden uitgedaagd met een hogere glucoseconcentratie. We hebben een gedetailleerd, stapsgewijs protocol verstrekt voor isolatie en karakterisering van vetmensachtige mesenchymale stamcellen. We bieden hier ook een relatief kort, eenvoudig en efficiënt protocol voor differentiatie van vet mesenchymale stamcellen in insulineproducerende cellen.Dit biedt een toegangspoort voor onderzoekers om het veld van mesenchymale stamcellen te betreden en hun differentiatie in insulineproducerende cellen te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen / stromale cellen afkomstig van menselijke placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Chondrogene differentiatie Inductie van vetcellen afgeleide stamcellen door Centrifugaal Zwaartekracht

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Afleiding en differentiatie van Canine ovariële mesenchymale stamcellen

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...