Name: isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells
Uploaded: 2022-08-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells at JoVE.com

Nous remercions le Dr Rawda Samir Mohamed, MSc, vétérinaire spécialiste, Faculté de pharmacie, Université britannique d’Égypte (BUE) pour son aide à la dissection des rats.
Nous tenons également à remercier et à apprécier les efforts de la Faculté de communication de masse de l’Université britannique en Égypte (BUE) pour la production et le montage de la vidéo de ce manuscrit.
Nous tenons à remercier Mlle Fatma Masoud, MSc, maître de conférences en anglais, The British University in Egypt (BUE) pour la révision et la relecture en anglais du manuscrit.
Ce travail a été partiellement financé par le Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculté de pharmacie, Université britannique en Égypte (BUE), Le Caire, Égypte.

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives approuvées et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique de la Faculté de pharmacie de l’Université britannique en Égypte (BUE), au Caire, en Égypte. Le protocole d’isolement Ad-MSC a été adopté par Lopez et Spencer, avec les modifications15.
1. Isolement des Ad-MSC des coussinets de graisse épididymiques de rat
<ol><li>Utilisez des ra...

<ol>
	<li>Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+for+cancer+therapy.">Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).</li><li>Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+and+therapeutic+strategies+of+mesenchymal+stem+cells+in+regenerative+medicine.">Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine.</a> Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow.">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li><li>De Ugarte, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+stem+cell+mobilization-associated+molecules+on+multi-lineage+cells+from+adipose+tissue+and+bone+marrow.">Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow.</a> Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).</li><li>Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+and+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells:+A+user's+guide.">Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide.</a> Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).</li><li>Camara, B. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+canine+adipose+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells:+Comparison+of+different+culture+medium+compositions.">Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions.</a> Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion,+and+differentiation+of+goat+adipose-derived+stem+cells.">Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells.</a> Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).</li><li>Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-tissue+engineering:+Taking+advantage+of+the+properties+of+human+adipose-derived+stem/stromal+cells.">Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells.</a> Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Gong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+stimulate+intestinal+stem+cells+to+repair+radiation-induced+intestinal+injury.">Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2387 (2016).</li><li>Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine+applications.">Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications.</a> Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).</li><li>Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effect+of+adipose-derived+stem+cells:+The+cutting+edge+of+clinical+application.">Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).</li><li>Karp, J., Leng Teo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+homing:+The+devil+is+in+the+details.">Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details.</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).</li><li>Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Lopez, M. J., Spencer, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+adult+rat+adipose+tissue-derived+stromal+cell+isolation+and+differentiation.">In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).</li><li>Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+insulin-producing+cells+from+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+by+genetic+manipulation.">Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation.</a> Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).</li><li>Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+phenotype+and+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells+aging+in+vitro.">Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 131 (2018).</li><li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stromal+cells+from+human+marrow+home+to+and+promote+repair+of+pancreatic+islets+and+renal+glomeruli+in+diabetic+NOD/scid+mice.">Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).</li><li>Gao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+apelin+in+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cell+reverses+insulin+resistance+and+promotes+pancreatic+&#946;+cell+proliferation+in+type+2+diabetic+rats.">Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic &#946; cell proliferation in type 2 diabetic rats.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 339 (2018).</li><li>Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+mesenchymal+stromal/stem+cells+to+insulin-producing+cells:+Progress+and+challenges.">From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exendin-4+enhances+the+differentiation+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells+through+activation+of+various+&#946;-cell+markers.">Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various &#946;-cell markers.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 108 (2016).</li><li>Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+diabetic+retinopathy+by+engrafted+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+in+streptozotocin+diabetic+rats.">Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).</li><li>Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+induce+angiogenesis+and+attenuate+the+remodeling+of+diabetic+cardiomyopathy.">Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy.</a> Experimental and Clinical Endocrinology &amp; Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).</li><li>Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+potential+of+early-+and+late-passage+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+hypoxia+and+normoxia.">Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia.</a> Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).</li><li>Krishnamurthy, H., Cram, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+flow+cytometry.">Basics of flow cytometry.</a> Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).</li><li>Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exendin-4+enhances+osteogenic+differentiation+of+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+through+the+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappa+B+and+osteoprotegerin+signaling+pathway.">Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+from+obese+mice+prevent+body+weight+gain+and+hyperglycemia.">Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 277 (2021).</li><li>Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-step+mechanical+digestion+method+to+harvest+adipose-derived+stromal+vascular+fraction.">A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).</li><li>Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue-derived+stem+cells:+Enzymatic+digestion+in+combination+with+mechanical+distortion+to+increase+adipose+tissue-derived+stem+cell+yield+from+human+aspirated+fat.">Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).</li><li>Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase+impacts+the+quantity+and+quality+of+native+mesenchymal+stem/stromal+cells+derived+during+processing+of+umbilical+cord+tissue.">Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue.</a> Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).</li><li>Kamal, M. M., Kassem, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+for+diabetes:+Achievements+and+challenges.">Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).</li><li>Gabr, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+human+mesenchymal+stem+cells+to+insulin-producing+cells:+Comparison+between+bone+marrow-+and+adipose+tissue-derived+cells.">From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells.</a> BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+differentiated+from+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+vitro+ameliorate+streptozotocin-induced+diabetic+hyperglycemia.">Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia.</a> PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+efficacy+of+umbilical+cord-derived+stem+cells+for+diabetes+mellitus:+A+meta-analysis+study.">Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 484 (2020).</li><li>El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Wharton's+jelly+and+cord+blood+as+a+source+of+mesenchymal+stem+cells+for+diabetes+cell+therapy.">A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy.</a> Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+expression+levels+of+pluripotency/stem+cell+markers+with+the+differentiation+outcome+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin+producing+cells.">Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells.</a> Biochimie. 127, 187-195 (2016).</li><li>El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+can+potentially+differentiate+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells.">Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells.</a> Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).</li><li>Gabr, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+from+adult+human+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells+could+control+chemically+induced+diabetes+in+dogs:+A+preliminary+study.">Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study.</a> Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).</li></ol>

Dans ce protocole, nous avons réussi à présenter un protocole détaillé pour l’isolement des Ad-MSC de la graisse épididymale de rat et la différenciation de ces Ad-MSC en IPC. En fait, la graisse épidydimale de rat est une source facilement accessible de tissu adipeux pour l’obtention d’Ad-MSC et ne nécessite aucun équipement spécial, ni pour la collecte ni pour le traitement 15,26,27. Les Ad-MSC isolés ont mon...

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM), également connues sous le nom de cellules stromales mésenchymateuses, sont parmi les types de cellules les plus largement utilisés pour la médecine régénérative 1,2. Elles sont classées comme cellules souches adultes et caractérisées par un potentiel de différenciation multiligne et une capacité d’auto-renouvellement3. Les CSM peuvent être isolés et obtenus à partir de diverses sources, y compris le tissu adipeux, la moelle osseuse, le sang périphérique, le tissu et le sang du cordon ombilical, les follicules pileux et les dents 4,5.
L’isolement des cellules souches du tissu adipeux est considéré comme à la fois attrayant et prometteur en raison de leur accès facile, de leur expansion rapide in vitro et de leur rendement élevé6. Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSAd) peuvent être isolées de différentes espèces telles que les humains, les bovins, les souris, les rats et, plus récemment, les chèvres7. Il a été prouvé que les Ad-MSC sont maintenant des candidats potentiels pour l’ingénierie tissulaire et la thérapie génique / cellulaire qui peuvent même être utilisés pour développer une alternative autologue pour la réparation à long terme des lésions ou des défauts des tissus mous 7,8.
L’International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) a défini trois critères minimaux qui doivent être présentés par les MSC pour une caractérisation complète9. Tout d’abord, ils doivent être adhérents au plastique. Deuxièmement, les CSM devraient exprimer des marqueurs mésenchymateux de la surface des cellules souches tels que CD73, CD90 et CD105 et manquer d’expression des marqueurs hématopoïétiques CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 et HLA-DR. Enfin, les CSM devraient présenter la capacité de se différencier en trois lignées mésenchymateuses: adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Fait intéressant, les CSM peuvent également se différencier en d’autres lignées telles que les cellules neuronales, les cardiomyocytes, les hépatocytes et les cellules épithéliales10,11.
En fait, les CSM possèdent des propriétés uniques qui leur permettent d’être appliquées en tant qu’agents thérapeutiques potentiels dans la thérapie régénérative pour différentes maladies. Les CSM peuvent sécréter des facteurs solubles pour induire un environnement immunomodulateur qui procure des avantages thérapeutiques12. En outre, les CSM peuvent migrer vers des sites de blessures et des microenvironnements tumoraux pour administrer un traitement ciblé; toutefois, les mécanismes ne sont pas entièrement élucidés13. En outre, les CSM ont la capacité de sécréter des exosomes, des vésicules extracellulaires à l’échelle nanométrique qui transportent une cargaison d’ARN non codants, de protéines et de facteurs solubles, qui ont récemment émergé comme un nouveau mécanisme du potentiel thérapeutique des CSM dans diverses maladies14.
Plus important encore, les CSM ont suscité une attention marquée pour leur potentiel à se différencier en cellules productrices d’insuline (IPC), soit par modification génétique15,16, soit en utilisant divers facteurs extrinsèques dans les milieux de culture in vitro17. La période d’induction de l’IPC varie considérablement, car elle dépend du protocole d’induction utilisé et des facteurs extrinsèques utilisés. Le processus de différenciation peut durer de quelques jours à plusieurs mois, et il nécessite une combinaison de facteurs exogènes qui doivent être ajoutés et / ou retirés à différentes étapes. Bon nombre de ces facteurs qui ont été utilisés pour la différenciation pancréatique endocrinienne sont des composés biologiquement actifs dont il a été démontré qu’ils favorisent la prolifération ou la différenciation/néogenèse des cellules β sécrétant de l’insuline et/ou augmentent la teneur en insuline des IPC 18,19,20,21. Il convient de noter ici que les CSM ont également été signalés pour avoir des effets thérapeutiques dans le diabète et ses complications via plusieurs mécanismes, y compris leur sécrétome, ainsi qu’un large éventail d’actions immunomodulatrices 22,23,24.
Dans ce protocole, nous présentons un protocole détaillé par étapes pour l’isolement et la caractérisation des CSAd à partir de graisse épididymale de rat, suivi d’un protocole simple et relativement court pour la génération de CPI à partir d’Ad-MSC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin, bovine serum Fraction V</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A3157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Rat CD90, FITC</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60024FI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 Monoclonal Antibody, FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA</td>
			<td>MA1-19594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA</td>
			<td>PA5-85917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I, powder</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher, USA</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose anhydrous, extra pure</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>G/0450/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithizone staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose 4.5 g/L</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low Glucose 1 g/L</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>12-707F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse/RNAse free water</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>24103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exendin-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E7144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, Brazil</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit</td>
			<td>R&#38;D systems Inc., MN, USA</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Insulin ELISA Kit</td>
			<td>Cloud-Clone Corp., USA</td>
			<td>CEA682Ra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Maxima</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>K0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.2 micron</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>431224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene-EDTA, 1X</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verso cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>AB-1453/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM), en particulier celles isolées du tissu adipeux (CSA) , ont fait l’objet d’une attention particulière en tant que source renouvelable et abondante de cellules souches qui ne pose aucun problème éthique. Cependant, les méthodes actuelles pour isoler les Ad-MSC ne sont pas normalisées et utilisent des protocoles compliqués qui nécessitent un équipement spécial. Nous avons isolé les CSAd de la graisse épididymale de rats Sprague-Dawley à l’aide d’une méthode simple et reproductible. Les Ad-MSC isolés apparaissent généralement dans les 3 jours suivant l’isolement, car les cellules adhérentes présentent une morphologie fibroblastique. Ces cellules atteignent 80% de confluence dans les 1 semaine suivant l’isolement. Par la suite, au passage 3-5 (P3-5), une caractérisation complète a été effectuée pour les CSA isolés par immunophénotypage des marqueurs de surface du groupe de différenciation (CD) MSC caractéristiques tels que CD90, CD73 et CD105, ainsi que par induction de la différenciation de ces cellules dans les lignées ostéogéniques, adipogènes et chondrogènes. Ceci, à son tour, implique la multipotence des cellules isolées. De plus, nous avons induit la différenciation des Ad-MSC isolés vers la lignée des cellules productrices d’insuline (IPC) via un protocole simple et relativement court en incorporant le milieu Eagle modifié de Dulbecco (HG-DMEM), le β-mercaptoéthanol, le nicotinamide et l’exendine-4. La différenciation des IPC a été évaluée génétiquement, tout d’abord, en mesurant les niveaux d’expression de marqueurs β cellulaires spécifiques tels que MafA, NKX6.1, Pdx-1 et Ins1, ainsi que la coloration à la dithizone pour les IPC générés. Deuxièmement, l’évaluation a également été réalisée fonctionnellement par un test de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS). En conclusion, les Ad-MSC peuvent être facilement isolés, présentant tous les critères de caractérisation des CSM, et ils peuvent en effet fournir une source abondante et renouvelable de PIC en laboratoire pour la recherche sur le diabète.

Isolement et caractérisation des Ad-MSC Comme le montre la figure 2, les cellules isolées du tissu adipeux ont montré une population hétérogène de cellules arrondies et ressemblant à des fibroblastes à partir du jour suivant de l’isolement (figure 2A). 4 jours après l’isolement, les cellules fibroblastiques ont commencé à augmenter en nombre et en taille et à croître en tant que population homogène au passage 1 (<strong clas...

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Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSAd) peuvent être une source potentielle de CSM qui se différencient en cellules productrices d’insuline (IPC). Dans ce protocole, nous fournissons des étapes détaillées pour l’isolement et la caractérisation des Ad-MSC épididymiques de rat, suivies d’un protocole simple et court pour la génération d’IPC à partir des mêmes Ad-MSC de rat.

Isolement de cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux de rat pour la différenciation en cellules productrices d’insuline

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

L’objectif global de ce protocole est d’isoler et de caractériser le tissu adipeux rouge, les cellules souches mésenchymateuses séchées et de les différencier en cellules productrices d’insuline à l’aide de méthodes simples. Les cellules souches mésenchymateuses ont trouvé les voies dans le domaine de la génétique. Ils peuvent être isolés à partir de diverses sources telles que la moelle osseuse, le tissu adipeux et le tissu périnatal.Ils acceptent d’excellentes caractéristiques culturelles. Ils sont multi-puissants et peuvent potentiellement traiter diverses maladies. Le tissu adipeux fournit une riche source de cellules souches mésenchymateuses.Ces CSM adipeux peuvent être isolés facilement des lipoaspirats avec un rendement élevé par rapport à d’autres sources comme la moelle osseuse. Et ils peuvent fournir une bonne source pour la transplantation autologue et allogénique. Dans cette vidéo présentent un protocole simple pour l’isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses adipeuses de la graisse épididymale de rat.Cette procédure est une méthode simple et très efficace pour l’isolement. Après isolement, nous subirons la différenciation de ces cellules souches mésenchymateuses adipeuses en cellules productrices d’insuline à l’aide d’un protocole simple et relativement court. Nous commencerons par l’isolement des cellules souches mésenchymateuses adipeuses par digestion collagène de la graisse épididymale pour obtenir une fraction vasculaire plus forte.Ensuite, les cellules souches mésenchymateuses seront caractérisées par leur adhérence plastique, ainsi que par l’expression de marqueurs CD et la différenciation en plusieurs lignées mésodermiques. Anesthésier l’animal, puis l’euthanasier en utilisant la luxation cervicale. Vaporisez sur tout le corps avec 70% d’éthanol et commencez par l’excision de la peau et des muscles de la partie inférieure de l’abdomen.Ensuite, exposez les testicules avec la graisse épididymale. Coupez doucement la graisse épididymale. Veillez à ne pas couper les vaisseaux sanguins avec les graisses.Dans une armoire de biosécurité, coupez le tissu adipeux en petits morceaux à l’aide d’une pince et d’un scalpel. Transférer le tissu adipeux dans un tube centrifuge contenant 10 millilitres de PBS stérile. Commencez le lavage en inclinant le tube Falcon pendant 45 secondes.Ensuite, gardez le tube debout pendant cinq minutes pour le séparer en deux couches. Retirez le PBS infrané à l’aide d’une seringue de 10 millilitres. Répétez ces étapes de lavage quatre à cinq fois jusqu’à ce que PBS soit clair.Après le lavage, remettez en suspension le tissu adipeux dans une solution collagène, puis incubez au bain-marie jusqu’à ce que le tissu soit presque homogène. Ensuite, vortex le mélange de collagène tissulaire pendant 15 secondes, puis centrifuger ensuite pendant cinq minutes. Après centrifugation, vous aurez trois couches.Jetez soigneusement le surnageant sur la fraction vasculaire stromale. Jetez d’abord soigneusement la couche d’huile en haut, suivie de la couche d’échos sans perturber la pastille de fraction vasculaire stromale. Re-suspendre la fraction vasculaire stromale dans le BSA stérile et re-centrifuger pendant cinq minutes.Centrifugation entière, placez le support DMEM F-12 complet dans une fiole carrée de 25 centimètres. Après centrifugation, jeter le surnageant et suspendre à nouveau la pastille vasculaire stromale dans un milieu DMEM F-12 complet. Et transfert dans la fiole de culture.Placer dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés 5%. Le lendemain, retirez les cellules non attachées et remplacez le média par un support frais. À partir du lendemain de l’isolement, les cellules de type fibroblaste commenceront à apparaître.Puis, progressivement, au fil du temps, leur nombre et leur taille augmenteront. En passant, les cellules deviendront plus homogènes. Ces cellules présentent tous les critères de caractérisation des cellules souches mésenchymateuses.Ces cellules ont été différenciées en cellules productrices d’insuline en utilisant ce protocole simple contenant du nicotinamide bêta-mercaptoéthanol et de l’exendine-4. Tout au long des étapes de différenciation, les cellules commencent à perdre leur forme fibroblastique et je pense que la morphologie des grappes. Lorsqu’elles sont utilisées, les cellules productrices d’insuline présentent une coloration positive de la disithone rouge cramoisi, puis les cellules productrices d’insuline utilisées expriment divers marqueurs de cellules bêta comme Pdx-1, mafA et insuline.En outre, les cellules productrices d’insuline induites sécrètent des niveaux plus élevés d’insuline dans le surnageant lorsqu’elles sont confrontées à une concentration de glucose plus élevée. Nous avons fourni un protocole détaillé et par étapes pour l’isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses adipeuses. Nous fournissons également ici un protocole relativement court, simple et efficace pour la différenciation des cellules souches mésenchymateuses adipeuses en cellules productrices d’insuline.Cela fournit une passerelle aux chercheurs pour entrer dans le domaine des cellules souches mésenchymateuses et étudier leur différenciation en cellules productrices d’insuline.

Research

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Developmental Biology

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Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

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