Name: isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells
Uploaded: 2022-08-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells at JoVE.com

Riconosciamo il Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Specialista Veterinario, Facoltà di Farmacia, Università Britannica d'Egitto (BUE) per aver aiutato con la dissezione dei ratti.
Vorremmo anche riconoscere e apprezzare gli sforzi della Facoltà di Comunicazione di Massa, The British University in Egypt (BUE) per la produzione e l'editing del video di questo manoscritto.
Vorremmo ringraziare Miss Fatma Masoud, MSc, Assistant Lecturer of English, The British University in Egypt (BUE) per la revisione e la correzione di bozze in lingua inglese del manoscritto.
Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Center for Drug Research and Development (CDRD), Facoltà di Farmacia, The British University in Egypt (BUE), Cairo, Egitto.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida approvate e tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico della Facoltà di Farmacia, The British University in Egypt (BUE), Cairo, Egitto. Il protocollo di isolamento Ad-MSC è stato adottato da Lopez e Spencer, con modifiche15.
1. Isolamento di Ad-MSC da cuscinetti di grasso epididimale di ratto
<ol><li>Utilizzare ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 250-300 g che non h...

<ol>
	<li>Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+for+cancer+therapy.">Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).</li><li>Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+stem+cell+mobilization-associated+molecules+on+multi-lineage+cells+from+adipose+tissue+and+bone+marrow.">Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow.</a> Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).</li><li>Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+and+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells:+A+user's+guide.">Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide.</a> Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).</li><li>Camara, B. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+canine+adipose+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells:+Comparison+of+different+culture+medium+compositions.">Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions.</a> Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion,+and+differentiation+of+goat+adipose-derived+stem+cells.">Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells.</a> Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).</li><li>Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-tissue+engineering:+Taking+advantage+of+the+properties+of+human+adipose-derived+stem/stromal+cells.">Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells.</a> Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Gong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+stimulate+intestinal+stem+cells+to+repair+radiation-induced+intestinal+injury.">Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2387 (2016).</li><li>Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. 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O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Lopez, M. J., Spencer, N. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+phenotype+and+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells+aging+in+vitro.">Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 131 (2018).</li><li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stromal+cells+from+human+marrow+home+to+and+promote+repair+of+pancreatic+islets+and+renal+glomeruli+in+diabetic+NOD/scid+mice.">Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).</li><li>Gao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+apelin+in+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cell+reverses+insulin+resistance+and+promotes+pancreatic+&#946;+cell+proliferation+in+type+2+diabetic+rats.">Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic &#946; cell proliferation in type 2 diabetic rats.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 339 (2018).</li><li>Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+mesenchymal+stromal/stem+cells+to+insulin-producing+cells:+Progress+and+challenges.">From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exendin-4+enhances+the+differentiation+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells+through+activation+of+various+&#946;-cell+markers.">Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various &#946;-cell markers.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 108 (2016).</li><li>Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+diabetic+retinopathy+by+engrafted+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+in+streptozotocin+diabetic+rats.">Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).</li><li>Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. 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G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+potential+of+early-+and+late-passage+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+hypoxia+and+normoxia.">Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia.</a> Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).</li><li>Krishnamurthy, H., Cram, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+flow+cytometry.">Basics of flow cytometry.</a> Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).</li><li>Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exendin-4+enhances+osteogenic+differentiation+of+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+through+the+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappa+B+and+osteoprotegerin+signaling+pathway.">Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+from+obese+mice+prevent+body+weight+gain+and+hyperglycemia.">Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 277 (2021).</li><li>Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-step+mechanical+digestion+method+to+harvest+adipose-derived+stromal+vascular+fraction.">A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).</li><li>Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase+impacts+the+quantity+and+quality+of+native+mesenchymal+stem/stromal+cells+derived+during+processing+of+umbilical+cord+tissue.">Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue.</a> Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).</li><li>Kamal, M. M., Kassem, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+for+diabetes:+Achievements+and+challenges.">Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).</li><li>Gabr, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+human+mesenchymal+stem+cells+to+insulin-producing+cells:+Comparison+between+bone+marrow-+and+adipose+tissue-derived+cells.">From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells.</a> BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+differentiated+from+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+vitro+ameliorate+streptozotocin-induced+diabetic+hyperglycemia.">Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia.</a> PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+efficacy+of+umbilical+cord-derived+stem+cells+for+diabetes+mellitus:+A+meta-analysis+study.">Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 484 (2020).</li><li>El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Wharton's+jelly+and+cord+blood+as+a+source+of+mesenchymal+stem+cells+for+diabetes+cell+therapy.">A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy.</a> Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+expression+levels+of+pluripotency/stem+cell+markers+with+the+differentiation+outcome+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin+producing+cells.">Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells.</a> Biochimie. 127, 187-195 (2016).</li><li>El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+can+potentially+differentiate+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells.">Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells.</a> Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).</li><li>Gabr, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+from+adult+human+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells+could+control+chemically+induced+diabetes+in+dogs:+A+preliminary+study.">Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study.</a> Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).</li></ol>

In questo protocollo, siamo riusciti a presentare un protocollo dettagliato per l'isolamento di Ad-MSC dal grasso epididimale di ratto e la differenziazione di questi Ad-MSC in IPC. Infatti, il grasso epididico di ratto è una fonte facilmente raggiungibile di tessuto adiposo per ottenere Ad-MSC e non richiede alcuna attrezzatura speciale, né per la raccolta né per la lavorazione 15,26,27. Gli Ad-MSC isolati hanno mostrato un'...

Le cellule staminali mesenchimali (MSC), note anche come cellule stromali mesenchimali, sono tra i tipi di cellule più utilizzati per la medicina rigenerativa 1,2. Sono classificate come cellule staminali adulte e caratterizzate da potenziale di differenziazione multilineare e capacità di auto-rinnovamento3. Le MSC possono essere isolate e ottenute da varie fonti, tra cui tessuto adiposo, midollo osseo, sangue periferico, tessuto e sangue del cordone ombelicale, follicoli piliferi e denti 4,5.
L'isolamento delle cellule staminali dal tessuto adiposo è visto come attraente e promettente grazie al loro facile accesso, alla rapida espansione in vitro e all'alta resa6. Le cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (Ad-MSC) possono essere isolate da diverse specie come esseri umani, bovini, topi, ratti e, più recentemente, capre7. È stato dimostrato che gli Ad-MSC sono ora potenziali candidati per l'ingegneria tissutale e la terapia genica / cellulare che possono anche essere utilizzati per sviluppare un'alternativa autologa per la riparazione a lungo termine di lesioni o difetti dei tessuti molli 7,8.
L'International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) ha definito tre criteri minimi che devono essere esibiti dalle MSC per la caratterizzazione completa9. In primo luogo, devono essere aderenti alla plastica. In secondo luogo, le MSC dovrebbero esprimere marcatori di superficie delle cellule staminali mesenchimali come CD73, CD90 e CD105 e mancare di espressione dei marcatori ematopoietici CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79α o CD19 e HLA-DR. Infine, le MSC dovrebbero mostrare la capacità di differenziarsi nei tre lignaggi mesenchimali: adipociti, osteociti e condrociti. È interessante notare che le MSC possono anche differenziarsi in altri lignaggi come cellule neuronali, cardiomiociti, epatociti e cellule epiteliali 10,11.
Infatti, le MSC possiedono proprietà uniche che consentono loro di essere applicate come potenziali agenti terapeutici nella terapia rigenerativa per diverse malattie. Le MSC possono secernere fattori solubili per indurre un ambiente immunomodulatore che fornisce benefici terapeutici12. Inoltre, le MSC possono migrare verso siti di lesioni e microambienti tumorali per fornire una terapia mirata; tuttavia, i meccanismi non sono completamente chiariti13. Inoltre, le MSC hanno la capacità di secernere esosomi, vescicole extracellulari su scala nanometrica che trasportano un carico di RNA non codificanti, proteine e fattori solubili, che ultimamente sono emersi come un nuovo meccanismo del potenziale terapeutico delle MSC in varie malattie14.
Ancora più importante, le MSC hanno generato una notevole attenzione per il loro potenziale di differenziazione in cellule produttrici di insulina (IPC), sia mediante modificazione genetica15,16 o attraverso l'utilizzo di vari fattori estrinseci all'interno dei terreni di coltura in vitro17. Il periodo di induzione IPC varia notevolmente, in quanto dipende dal protocollo di induzione utilizzato e dai fattori estrinseci utilizzati. Il processo di differenziazione può durare da giorni a mesi e richiede una combinazione di fattori che inducono esogeni che devono essere aggiunti e / o ritirati in diverse fasi. Molti di questi fattori che sono stati utilizzati per il differenziamento pancreatico endocrino sono composti biologicamente attivi che hanno dimostrato di promuovere la proliferazione o differenziazione/neogenesi delle cellule β secernenti insulina e/o aumentare il contenuto di insulina delle IPC 18,19,20,21. È interessante notare qui che le MSC sono state anche segnalate per avere effetti terapeutici nel diabete e nelle sue complicanze attraverso diversi meccanismi, incluso il loro secretoma, così come una vasta gamma di azioni immuno-modulatorie 22,23,24.
In questo protocollo, presentiamo un protocollo graduale dettagliato per l'isolamento e la caratterizzazione di Ad-MSC da grasso epididimale di ratto, seguito da un protocollo semplice e relativamente breve per la generazione di IPC da Ad-MSC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin, bovine serum Fraction V</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A3157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Rat CD90, FITC</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60024FI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 Monoclonal Antibody, FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA</td>
			<td>MA1-19594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA</td>
			<td>PA5-85917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I, powder</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher, USA</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose anhydrous, extra pure</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>G/0450/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithizone staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose 4.5 g/L</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low Glucose 1 g/L</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>12-707F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse/RNAse free water</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>24103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exendin-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E7144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, Brazil</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit</td>
			<td>R&#38;D systems Inc., MN, USA</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Insulin ELISA Kit</td>
			<td>Cloud-Clone Corp., USA</td>
			<td>CEA682Ra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Maxima</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>K0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.2 micron</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>431224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene-EDTA, 1X</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verso cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>AB-1453/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells

Le cellule staminali mesenchimali (MSC), in particolare quelle isolate dal tessuto adiposo (Ad-MSC), hanno guadagnato particolare attenzione come fonte rinnovabile e abbondante di cellule staminali che non pone alcuna preoccupazione etica. Tuttavia, i metodi attuali per isolare gli Ad-MSC non sono standardizzati e impiegano protocolli complicati che richiedono attrezzature speciali. Abbiamo isolato gli Ad-MSC dal grasso epididimale dei ratti Sprague-Dawley usando un metodo semplice e riproducibile. Le Ad-MSC isolate di solito compaiono entro 3 giorni dall'isolamento, poiché le cellule aderenti mostrano morfologia fibroblastica. Queste cellule raggiungono l'80% di confluenza entro 1 settimana dall'isolamento. Successivamente, al passaggio 3-5 (P3-5), è stata effettuata una caratterizzazione completa per le Ad-MSC isolate mediante immunofenotipizzazione per marcatori di superficie caratteristici del cluster di differenziazione MSC (CD) come CD90, CD73 e CD105, oltre a indurre la differenziazione di queste cellule lungo i lignaggi osteogenici, adipogenici e condrogeni. Questo, a sua volta, implica la multipotenza delle cellule isolate. Inoltre, abbiamo indotto la differenziazione delle Ad-MSC isolate verso il lignaggio delle cellule produttrici di insulina (IPC) attraverso un protocollo semplice e relativamente breve incorporando il mezzo Eagle modificato di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio (HG-DMEM), β-mercaptoetanolo, nicotinamide ed exendin-4. La differenziazione degli IPC è stata valutata geneticamente, in primo luogo, misurando i livelli di espressione di specifici marcatori a cellule β come MafA, NKX6.1, Pdx-1 e Ins1, nonché la colorazione del ditizone per gli IPC generati. In secondo luogo, la valutazione è stata effettuata anche funzionalmente mediante un test di secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS). In conclusione, gli Ad-MSC possono essere facilmente isolati, esibendo tutti i criteri di caratterizzazione MSC, e possono effettivamente fornire un'abbondante fonte rinnovabile di IPC in laboratorio per la ricerca sul diabete.

Isolamento e caratterizzazione di Ad-MSC Come mostrato nella Figura 2, le cellule isolate dal tessuto adiposo hanno mostrato una popolazione eterogenea di cellule arrotondate e simili ai fibroblasti a partire dal giorno successivo di isolamento (Figura 2A). 4 giorni dopo l'isolamento, le cellule dei fibroblasti hanno iniziato ad aumentare in numero e dimensioni e a crescere come popolazione omogenea entro il passaggio 1 (...

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Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Le cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (Ad-MSC) possono essere una potenziale fonte di MSC che si differenziano in cellule produttrici di insulina (IPC). In questo protocollo, forniamo passaggi dettagliati per l'isolamento e la caratterizzazione di Ad-MSC epididimali di ratto, seguiti da un protocollo semplice e breve per la generazione di IPC dallo stesso Rat Ad-MSCs.

Isolamento delle cellule staminali mesenchimali del tessuto adiposo di ratto per la differenziazione in cellule produttrici di insulina

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di isolare e caratterizzare il tessuto adiposo rosso, le cellule staminali mesenchimali essiccate e differenziarle verso le cellule produttrici di insulina utilizzando metodi semplici. Le cellule staminali mesenchimali hanno trovato la strada nel campo della genetica. Possono essere isolati da varie fonti come il midollo osseo, il tessuto adiposo e il tessuto perinatale.Accettano eccellenti caratteristiche culturali. Sono multi potenti e possono potenzialmente trattare varie malattie. Il tessuto adiposo fornisce una ricca fonte di cellule staminali mesenchimali.Queste MSC adipose possono essere isolate facilmente dagli aspirati lipo con alta resa rispetto ad altre fonti come il midollo osseo. E possono fornire una buona fonte sia per il trapianto autologo che allogenico. In questo video vengono presentati un semplice protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali adipose da grasso epididimale di ratto.Questa procedura è un metodo semplice e altamente efficiente per l'isolamento. Dopo l'isolamento, sopporteremo la differenziazione di queste cellule staminali mesenchimali adipose in cellule produttrici di insulina utilizzando un protocollo semplice e relativamente breve. Inizieremo con l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali adipose mediante digestione collagenosa del grasso epididimale per ottenere una frazione vascolare più forte.Quindi le cellule staminali mesenchimali saranno caratterizzate dalla loro aderenza plastica, nonché dall'espressione di marcatori CD e dalla differenziazione in più lignaggi mesodermici. Anaesthise l'animale, quindi eutanasia usando la lussazione cervicale. Spruzzare su tutto il corpo con etanolo al 70% e iniziare con l'escissione della pelle e dei muscoli nella parte inferiore dell'addome.Quindi esporre i testicoli con il grasso epididimale. Tagliare delicatamente il grasso epididimale. Fare attenzione a non tagliare i vasi sanguigni con i grassi.In un armadietto di sicurezza bio, tagliare il tessuto adiposo in piccoli pezzi usando pinze e bisturi. Trasferire il tessuto adiposo in tubo centrifugo contenente 10 millilitri di PBS sterile. Inizia il lavaggio inclinando il tubo Falcon per 45 secondi.Quindi tenere il tubo in piedi per cinque minuti per separarlo in due strati. Rimuovere il PBS infranato utilizzando una siringa da 10 millilitri. Ripeti questa procedura di lavaggio da quattro a cinque volte fino a quando PBS non è chiaro.Dopo il lavaggio, sospendere nuovamente il tessuto adiposo in soluzione collagenosa, quindi incubare a bagno d'acqua tremante fino a quando il tessuto è quasi omogeneo. Successivamente, ruotare la miscela collagenosa tissutale per 15 secondi, quindi centrifugare successivamente per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, avrai tre strati.Scartare con attenzione il surnatante sulla frazione vascolare stromale. Per prima cosa scartare con attenzione lo strato di olio nella parte superiore, seguito dallo strato di echi senza disturbare il pellet della frazione vascolare stromale. Sospendere nuovamente la frazione vascolare stromale in BSA sterile e ricentrare per cinque minuti.Centrifugazione intera, posizionare il supporto DMEM F-12 completo in un pallone quadrato di 25 centimetri. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet vascolare stromale in un mezzo DMEM F-12 completo. E trasferisci al pallone di coltura.Posizionare in 37 gradi 5% incubatore di anidride carbonica. Il giorno successivo, rimuovere le celle non attaccate e sostituire il supporto con un supporto nuovo. A partire dal giorno successivo di isolamento, le cellule simili ai fibroblasti inizieranno ad apparire.Poi gradualmente con il passare del tempo aumenteranno di numero e dimensioni. Passando, le cellule diventeranno più omogenee. Queste cellule presentano tutti i criteri di caratterizzazione delle cellule staminali mesenchimali.Queste cellule sono state differenziate verso le cellule produttrici di insulina utilizzando questo semplice protocollo contenente nicotinamide beta mercaptoetanolo ed Exendin-4. Durante le fasi di differenziazione, le cellule iniziano a perdere la loro forma fibroblastica e penso che la morfologia sia simile a un cluster. Quando le cellule produttrici di insulina utilizzate mostrano una colorazione positiva del disitone rosso cremisi, quindi le cellule produttrici di insulina utilizzate esprimono vari marcatori delle cellule beta come Pdx-1, mafA e insulina.Inoltre, le cellule produttrici di insulina indotte secernono livelli più elevati di insulina nel surnatante quando sfidate con una maggiore concentrazione di glucosio. Abbiamo fornito un protocollo dettagliato e graduale per l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule staminali mesenchimali adipose. Forniamo anche qui un protocollo relativamente breve, semplice ed efficiente per la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali adipose in cellule produttrici di insulina.Ciò fornisce un gateway per il ricercatore per entrare nel campo delle cellule staminali mesenchimali e studiare la loro differenziazione in cellule produttrici di insulina.

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Isolamento e l&#39;espansione delle staminali mesenchimali stromali derivate / cellule da placenta umana Tissue

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