Name: isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells
Uploaded: 2022-08-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells at JoVE.com

我々は、ラットの解剖を支援したエジプト英国大学(BUE)薬学部獣医師スペシャリストのRawda Samir Mohamed博士(MSc)に謝意を表します。
また、エジプトの英国大学マスコミュニケーション学部(BUE)のこの原稿のビデオの制作と編集に対する努力に感謝し、感謝したいと思います。
エジプトの英国大学(BUE)の英語アシスタント講師であるファトマ・マスード嬢に、原稿の改訂と英語の校正に感謝します。
この研究は、エジプトのカイロにあるエジプトの英国大学(BUE)の薬学部の医薬品研究開発センター(CDRD)によって部分的に資金提供されました。

すべての実験は承認されたガイドラインに従って実施され、すべての手順はエジプトのカイロにあるエジプトの英国大学(BUE)の薬学部の倫理委員会によって承認されました。Ad-MSC分離プロトコルは、ロペスとスペンサーから採用され、修正15が加えられました。
1. ラット精巣上体脂肪パッドからのAd-MSCの単離
<ol><li>生後1ヶ月以下の体重250?...

<ol>
	<li>Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+for+cancer+therapy.">Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).</li><li>Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+and+therapeutic+strategies+of+mesenchymal+stem+cells+in+regenerative+medicine.">Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine.</a> Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow.">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li><li>De Ugarte, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+stem+cell+mobilization-associated+molecules+on+multi-lineage+cells+from+adipose+tissue+and+bone+marrow.">Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow.</a> Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).</li><li>Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+and+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells:+A+user's+guide.">Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide.</a> Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).</li><li>Camara, B. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+canine+adipose+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells:+Comparison+of+different+culture+medium+compositions.">Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions.</a> Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion,+and+differentiation+of+goat+adipose-derived+stem+cells.">Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells.</a> Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).</li><li>Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-tissue+engineering:+Taking+advantage+of+the+properties+of+human+adipose-derived+stem/stromal+cells.">Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells.</a> Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Gong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+stimulate+intestinal+stem+cells+to+repair+radiation-induced+intestinal+injury.">Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2387 (2016).</li><li>Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. 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O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Lopez, M. J., Spencer, N. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+phenotype+and+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells+aging+in+vitro.">Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 131 (2018).</li><li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stromal+cells+from+human+marrow+home+to+and+promote+repair+of+pancreatic+islets+and+renal+glomeruli+in+diabetic+NOD/scid+mice.">Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).</li><li>Gao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+apelin+in+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cell+reverses+insulin+resistance+and+promotes+pancreatic+&#946;+cell+proliferation+in+type+2+diabetic+rats.">Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic &#946; cell proliferation in type 2 diabetic rats.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 339 (2018).</li><li>Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+mesenchymal+stromal/stem+cells+to+insulin-producing+cells:+Progress+and+challenges.">From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+induce+angiogenesis+and+attenuate+the+remodeling+of+diabetic+cardiomyopathy.">Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy.</a> Experimental and Clinical Endocrinology &amp; Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).</li><li>Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+potential+of+early-+and+late-passage+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+hypoxia+and+normoxia.">Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia.</a> Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).</li><li>Krishnamurthy, H., Cram, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+flow+cytometry.">Basics of flow cytometry.</a> Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).</li><li>Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. 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R., Canikyan, S., Kocak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-step+mechanical+digestion+method+to+harvest+adipose-derived+stromal+vascular+fraction.">A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).</li><li>Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase+impacts+the+quantity+and+quality+of+native+mesenchymal+stem/stromal+cells+derived+during+processing+of+umbilical+cord+tissue.">Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue.</a> Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).</li><li>Kamal, M. M., Kassem, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+for+diabetes:+Achievements+and+challenges.">Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).</li><li>Gabr, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+human+mesenchymal+stem+cells+to+insulin-producing+cells:+Comparison+between+bone+marrow-+and+adipose+tissue-derived+cells.">From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells.</a> BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+differentiated+from+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+vitro+ameliorate+streptozotocin-induced+diabetic+hyperglycemia.">Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia.</a> PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+efficacy+of+umbilical+cord-derived+stem+cells+for+diabetes+mellitus:+A+meta-analysis+study.">Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 484 (2020).</li><li>El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Wharton's+jelly+and+cord+blood+as+a+source+of+mesenchymal+stem+cells+for+diabetes+cell+therapy.">A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy.</a> Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+expression+levels+of+pluripotency/stem+cell+markers+with+the+differentiation+outcome+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin+producing+cells.">Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells.</a> Biochimie. 127, 187-195 (2016).</li><li>El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+can+potentially+differentiate+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells.">Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells.</a> Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).</li><li>Gabr, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+from+adult+human+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells+could+control+chemically+induced+diabetes+in+dogs:+A+preliminary+study.">Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study.</a> Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).</li></ol>

このプロトコルでは、ラット精巣上体脂肪からAd-MSCを単離し、これらのAd-MSCをIPCに分化するための詳細なプロトコルを提示することができました。実際、ラット精巣上体脂肪は、Ad-MSCsを得るための脂肪組織の容易に達成可能な供給源であり、収集にも処理にも特別な装置を必要としない15,26,27。単離されたAd-MSCは、優れた...

間葉系幹細胞(MSC)は、間葉系間質細胞としても知られており、再生医療に最も広く使用されている細胞型の1つです1,2。それらは成体幹細胞に分類され、多系統分化能と自己複製能によって特徴付けられる3。MSCは、脂肪組織、骨髄、末梢血、臍帯組織および血液、毛包、および歯を含む様々な供給源から単離および得ることができる4,5。
脂肪組織からの幹細胞の単離は、その容易なアクセス、インビトロでの急速な拡大、および高収率のために、魅力的で有望であると考えられている6。脂肪組織由来間葉系幹細胞(Ad−MSC)は、ヒト、ウシ、マウス、ラット、およびより最近ではヤギなどの異なる種から単離することができる7。Ad-MSCは現在、組織工学および遺伝子/細胞療法の潜在的な候補であり、軟部組織の損傷または欠損の長期修復のための自家的代替手段を開発するためにも使用できることが証明されています7,8。
国際細胞遺伝子治療学会(ISCT)は、完全な特性評価のためにMSCが示さなければならない3つの最小基準を定義しています9。まず、それらはプラスチックに付着していなければなりません。第二に、MSCは、CD73、CD90、およびCD105などの間葉系幹細胞表面マーカーを発現し、造血マーカーCD45、CD34、CD14またはCD11b、CD79αまたはCD19、およびHLA-DRの発現を欠いている。最後に、MSCは、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞の3つの間葉系譜に分化する能力を示すべきである。興味深いことに、MSCはまた、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、および上皮細胞などの他の系統に分化することができる10,11。
実際、MSCは、さまざまな疾患の再生治療における潜在的な治療薬として適用することを可能にするユニークな特性を持っています。MSCsは可溶性因子を分泌して、治療上の利益をもたらす免疫調節環境を誘導することができる12。さらに、MSCは、標的療法を提供するために、傷害部位および腫瘍微小環境に移行することができる。しかし、そのメカニズムは完全には解明されていない13。さらに、MSCは、エキソソーム、非コードRNA、タンパク質、および可溶性因子の積み荷を運ぶナノスケールの細胞外小胞を分泌する能力を有し、これは最近、様々な疾患におけるMSCの治療可能性の新規メカニズムとして浮上した14。
さらに重要なことに、MSCは、遺伝子改変15,16によって、またはin vitro17培養培地中の様々な外因性誘導因子を利用することによって、インスリン産生細胞(IPC)に分化する可能性について顕著な注目を集めている。IPC誘導期間は、使用される誘導プロトコルおよび使用される外因性因子に依存するため、大きく異なる。分化のプロセスは数日から数ヶ月続くことがあり、異なる段階で追加および/または撤回しなければならない外因性誘導因子の組み合わせを必要とする。内分泌膵臓分化に使用されているこれらの因子の多くは、インスリン分泌β細胞の増殖または分化/新生を促進し、および/またはIPCsのインスリン含量を増加させることが示されている生物学的に活性な化合物である18、19、20、21。MSCsは、セクレトームを含むいくつかのメカニズム、ならびに幅広い免疫調節作用を介して糖尿病およびその合併症において治療効果を有することがここでも報告されていることは注目に値する22,23,24。
このプロトコルでは、ラット精巣上体脂肪からのAd-MSCの単離および特性評価のための詳細な段階的プロトコルを提示し、続いてAd-MSCsからのIPCの生成のための単純で比較的短いプロトコルを提示する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin, bovine serum Fraction V</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A3157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Rat CD90, FITC</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60024FI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 Monoclonal Antibody, FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA</td>
			<td>MA1-19594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA</td>
			<td>PA5-85917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I, powder</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher, USA</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose anhydrous, extra pure</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>G/0450/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithizone staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose 4.5 g/L</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low Glucose 1 g/L</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>12-707F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse/RNAse free water</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>24103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exendin-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E7144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, Brazil</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit</td>
			<td>R&#38;D systems Inc., MN, USA</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Insulin ELISA Kit</td>
			<td>Cloud-Clone Corp., USA</td>
			<td>CEA682Ra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Maxima</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>K0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.2 micron</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>431224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene-EDTA, 1X</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verso cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>AB-1453/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells

間葉系幹細胞(MSC)、特に脂肪組織から単離されたもの(Ad-MSC)は、倫理的懸念をもたらさない再生可能で豊富な幹細胞源として特に注目されています。しかし、Ad-MSCを分離する現在の方法は標準化されておらず、特別な機器を必要とする複雑なプロトコルを採用しています。我々は、単純で再現可能な方法を用いて、Sprague-Dawleyラットの精巣上体脂肪からAd-MSCを単離した。単離されたAd-MSCは、通常、接着細胞が線維芽細胞性形態を示すため、単離後3日以内に現れる。これらの細胞は、単離後1週間以内に80%のコンフルエントに達する。その後、継代3-5(P3-5)で、CD90、CD73、およびCD105などの特徴的なMSC分化クラスター(CD)表面マーカーに対するイムノフェノタイピングによる単離Ad-MSCの完全な特性評価を行い、これらの細胞を骨形成、脂肪形成、および軟骨形成系統に分化誘導した。これは、次に、単離された細胞の多能性を意味する。さらに、我々は、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(HG-DMEM)、β-メルカプトエタノール、ニコチンアミド、およびエキセンディン-4を組み込むことによって、単純で比較的短いプロトコールを介して、単離されたAd-MSCをインスリン産生細胞(IPC)系統に向けて誘導した。IPCの分化は、まず、MafA、NKX6.1、Pdx-1、およびIns1などの特異的β細胞マーカーの発現レベルを測定すること、ならびに生成されたIPCに対するジチゾン染色を介して遺伝的に評価された。第二に、評価はグルコース刺激インスリン分泌(GSIS)アッセイによっても機能的に実施された。結論として、Ad-MSCは容易に分離でき、すべてのMSC特性評価基準を示し、糖尿病研究のための実験室で豊富で再生可能なIPC源を提供することができます。

広告MSCの分離と特性評価 図 2に示すように、脂肪組織から単離された細胞は、単離の翌日から始まる丸みを帯びた線維芽細胞様細胞の不均一な集団を示した(図2A)。単離後4日目に、線維芽細胞は、継代1によって均質な集団として増殖し、数およびサイズの増加を始めた(図2B、C)。これらの細胞は、?...

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Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

脂肪組織由来間葉系幹細胞(Ad−MSC)は、インスリン産生細胞(IPC)に分化するMSCの潜在的な供給源となり得る。このプロトコルでは、ラット精巣上体Ad-MSCの単離と特性評価のための詳細な手順を提供し、続いて同じラットAd-MSCからIPCを生成するためのシンプルで短いプロトコルを提供します。

インスリン産生細胞への分化のためのラット脂肪組織間葉系幹細胞の単離

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

このプロトコルの全体的な目標は、赤色脂肪組織、乾燥間葉系幹細胞を単離および特徴付け、簡単な方法を使用してインスリン産生細胞に向けて分化させることである。間葉系幹細胞は、遺伝学の分野でその道を見いだしてきた。それらは、骨髄、脂肪組織および周産期組織などの様々な供給源から単離することができる。彼らは優れた文化的特徴を受け入れます。それらは多能であり、潜在的に様々な疾患を治療することができる。脂肪組織は、間葉系幹細胞の豊富な供給源を提供する。これらの脂肪MSCは、骨髄のような他の供給源と比較して高収率で容易に脂肪吸引液から単離することができる。そして、それらは自家移植と同種異系移植の両方に良い情報源を提供することができます。このビデオでは、ラット精巣上体脂肪からの脂肪間葉系幹細胞の単離および特性評価のための簡単なプロトコルを提示している。この手順は、単離のための簡単で非常に効率的な方法です。単離後、我々はこれらの脂肪間葉系幹細胞からインスリン産生細胞への分化を、単純で比較的短いプロトコールを用いて耐える。精巣上体脂肪のコラーゲン消化による脂肪間葉系幹細胞の単離から始めて、より強い血管画分を得る。その後、間葉系幹細胞は、その可塑性接着、ならびにCDマーカーの発現および複数の中胚葉系への分化によって特徴付けられるであろう。動物を麻酔し、子宮頸部脱臼を用いて安楽死させる。全身に70%エタノールをスプレーし、腹部下部の皮膚と筋肉の切除から始めます。その後、精巣上体脂肪で精巣を露出させます。精巣上体脂肪を優しくカットする。脂肪で血管を切らないように注意してください。バイオ安全キャビネットで、鉗子とメスを使用して脂肪組織を細かく切ります。脂肪組織を10ミリリットルの滅菌PBSを含む遠沈管に移す。ファルコンチューブを45秒間傾けて洗浄を開始します。その後、チューブを5分間放置して2層に分離します。10ミリリットルのシリンジを使用して注入PBSを取り除きます。PBSが透明になるまで、この洗浄手順を4〜5回繰り返します。洗浄後、脂肪組織をコラーゲン溶液に再懸濁し、次いで組織がほぼ均質になるまで振とう水浴中でインキュベートする。その後、コラーゲン状混合物を15秒間組織に渦巻き、その後5分間遠心分離した。遠心分離後、3つの層があります。間質血管画分の上の上清を慎重に捨てる。最初に上部の油層を慎重に廃棄し、続いて間質血管画分ペレットを乱すことなくエコー層を廃棄する。間質血管画分を滅菌BSAに再懸濁し、5分間再遠心分離する。全遠心分離を行い、完全なDMEM F-12培地を25センチメートル四方のフラスコに入れる。遠心分離後、上清を捨て、間質血管ペレットを完全なDMEM F-12培地に再懸濁する。培養フラスコに移す。37度5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。翌日、付着していない細胞を取り除き、培地を新鮮な培地と交換する。単離の翌日から開始すると、線維芽細胞様細胞が出現し始める。それから徐々に時間が経つにつれて、彼らは数とサイズが増加します。継代することにより、細胞はより均質になります。これらの細胞は、全ての間葉系幹細胞特徴付け基準を示す。これらの細胞は、ニコチンアミドベータメルカプトエタノールおよびエキセンディン−4を含むこの単純なプロトコールを用いてインスリン産生細胞に向けて分化させた。分化の段階を通して、細胞は線維芽細胞の形を失い始め、クラスターのような形態だと思います。インスリン産生細胞を用いると、陽性の真紅赤色ジシトン染色を示し、次いで、使用インスリン産生細胞は、Pdx-1、mafAおよびインスリンのような様々なベータ細胞マーカーを発現する。さらに、誘導されたインスリン産生細胞は、より高いグルコース濃度で挑戦されると、上清中のより高いレベルのインスリンを分泌する。我々は、脂肪間葉系幹細胞の単離および特性評価のための詳細で段階的なプロトコールを提供した。我々はまた、脂肪間葉系幹細胞をインスリン産生細胞に分化させるための比較的短く、単純かつ効率的なプロトコールをここで提供する。これは、研究者が間葉系幹細胞の分野に参入し、インスリン産生細胞への分化を研究するためのゲートウェイを提供します。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

ブタ皮下脂肪組織から分離し、脂肪由来幹細胞の分化

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

導出とイヌの卵巣間葉系幹細胞の分化

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...