Name: isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells
Uploaded: 2022-08-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells at JoVE.com

우리는 쥐의 해부를 돕는 Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Veterinarian Specialist, 약학 학부, 이집트 영국 대학 (BUE)을 인정합니다.
우리는 또한이 원고의 비디오 제작 및 편집을위한 이집트의 영국 대학 (BUE)의 매스 커뮤니케이션 학부의 노력을 인정하고 감사하고 싶습니다.
우리는 미스 Fatma Masoud, 석사, 영어의 보조 강사, 이집트의 영국 대학 (BUE) 원고의 개정 및 영어 교정에 감사드립니다.
이 연구는 약물 연구 개발 센터 (CDRD), 약학 학부, 이집트 영국 대학 (BUE), 카이로, 이집트에서 부분적으로 자금을 지원했습니다.

모든 실험은 승인 된 지침에 따라 수행되었으며, 모든 절차는 이집트 카이로, 이집트의 영국 대학 (BUE)의 약학 학부 윤리위원회의 승인을 받았습니다. Ad-MSC 격리 프로토콜은 Lopez 및 Spencer에서 채택되었으며 수정15가 적용되었습니다.
1. 쥐 부고환 지방 패드에서 Ad-MSC의 분리
<ol><li>생후 1 개월 이하의 체중 250-300g의 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 사용하십...

<ol>
	<li>Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+for+cancer+therapy.">Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).</li><li>Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+canine+adipose+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells:+Comparison+of+different+culture+medium+compositions.">Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions.</a> Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion,+and+differentiation+of+goat+adipose-derived+stem+cells.">Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells.</a> Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).</li><li>Vallee, M., Cote, J. 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The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Gong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+stimulate+intestinal+stem+cells+to+repair+radiation-induced+intestinal+injury.">Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2387 (2016).</li><li>Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. 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G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+potential+of+early-+and+late-passage+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+hypoxia+and+normoxia.">Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia.</a> Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).</li><li>Krishnamurthy, H., Cram, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+flow+cytometry.">Basics of flow cytometry.</a> Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).</li><li>Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. 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R., Canikyan, S., Kocak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-step+mechanical+digestion+method+to+harvest+adipose-derived+stromal+vascular+fraction.">A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).</li><li>Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. 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H., Kamal, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+efficacy+of+umbilical+cord-derived+stem+cells+for+diabetes+mellitus:+A+meta-analysis+study.">Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 484 (2020).</li><li>El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Wharton's+jelly+and+cord+blood+as+a+source+of+mesenchymal+stem+cells+for+diabetes+cell+therapy.">A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy.</a> Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+expression+levels+of+pluripotency/stem+cell+markers+with+the+differentiation+outcome+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin+producing+cells.">Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells.</a> Biochimie. 127, 187-195 (2016).</li><li>El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+can+potentially+differentiate+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells.">Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells.</a> Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).</li><li>Gabr, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+from+adult+human+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells+could+control+chemically+induced+diabetes+in+dogs:+A+preliminary+study.">Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study.</a> Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).</li></ol>

이 프로토콜에서, 우리는 쥐 부고환 지방으로부터 Ad-MSCs의 분리 및 이러한 Ad-MSCs를 IPCs로 분화시키는 상세한 프로토콜을 제시 할 수 있었다. 사실, 쥐 epidydimal 지방은 Ad-MSCs를 얻기 위해 지방 조직의 쉽게 얻을 수있는 원천이며 수집 또는15,26,27 처리를 위해 특별한 장비가 필요하지 않습니다. 단리된 Ad-MSCs는 우수한 배양 확장을 ...

중간엽 기질 세포로도 알려진 중간엽 줄기 세포 (MSCs)는 재생 의학 1,2에 가장 널리 사용되는 세포 유형 중 하나입니다. 이들은 성체줄기세포로 분류되며 다계보 분화 가능성과 자가재생능력을 특징으로한다3. 중간엽 줄기세포는 지방 조직, 골수, 말초 혈액, 탯줄 조직 및 혈액, 모낭 및 치아 4,5를 포함하는 다양한 공급원으로부터 단리되고 수득될 수 있다.
지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리하는 것은 쉬운 접근, 시험관 내에서의 빠른 팽창 및 높은 수율6으로 인해 매력적이고 유망한 것으로 간주됩니다. 지방조직 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSCs)는 인간, 소, 생쥐, 래트 및 보다 최근에는 염소7과 같은 상이한 종으로부터 분리될 수 있다. Ad-MSC는 이제 조직 공학 및 유전자 / 세포 요법의 잠재적 인 후보자이며 연조직 손상 또는 결함 7,8의 장기적인 복구를위한 자가 대안을 개발하는 데에도 사용할 수 있음이 입증되었습니다.
국제 세포 및 유전자 치료 학회 (ISCT)는 완전한 특성화를 위해 MSC가 전시해야하는 세 가지 최소 기준을 정의했습니다9. 첫째, 그들은 플라스틱 지지자이어야합니다. 둘째, 중간엽 줄기세포 표면 마커, 예컨대 CD73, CD90, 및 CD105를 발현하고 조혈 마커 CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79α 또는 CD19, 및 HLA-DR의 발현이 결여되어야 한다. 마지막으로, MSCs는 세 개의 중간엽 혈통으로 분화 할 수있는 능력을 나타내야합니다 : 지방세포, 골세포 및 연골 세포. 흥미롭게도, MSCs는 또한 신경 세포, 심근 세포, 간세포 및 상피 세포10,11과 같은 다른 혈통으로 분화 할 수 있습니다.
사실, MSC는 다른 질병에 대한 재생 요법에서 잠재적 인 치료제로 적용 될 수있는 독특한 특성을 가지고 있습니다. MSCs는 치료 이점을 제공하는 면역조절 환경을 유도하기 위해 가용성 인자를 분비할 수 있다(12). 또한, MSCs는 표적 치료를 전달하기 위해 손상 부위 및 종양 미세 환경으로 이동할 수 있습니다. 그러나, 메카니즘은 완전히 해명되지 않았다(13). 또한, MSCs는 비코딩 RNAs, 단백질 및 가용성 인자의 화물을 운반하는 나노스케일에서 엑소좀, 세포밖 소포를 분비하는 능력을 가지며, 이는 최근 다양한 질병에서 MSCs의 치료 잠재력의 새로운 메카니즘으로서 등장한다14.
더욱 중요하게는, MSCs는 유전자 변형(15,16) 또는 시험관내 배양 배지 내의 다양한 외인성 유도 인자를 이용함으로써 인슐린 생산 세포(IPCs)로 분화할 수 있는 그들의 잠재력에 대해 뚜렷한 관심을 불러일으켰다. IPC 유도 기간은 사용 된 유도 프로토콜 및 활용 된 외인성 요인에 따라 다르기 때문에 크게 다릅니다. 분화 과정은 며칠에서 수개월까지 지속될 수 있으며, 다른 단계에서 추가 및 / 또는 철회되어야하는 외인성 유도 인자의 조합이 필요합니다. 내분비 췌장 분화에 사용 된 이러한 요인 중 많은 부분은 인슐린 분비 β 세포의 증식 또는 분화 / 신 생성을 촉진하고 IPC18,19,20,21의 인슐린 함량을 증가시키는 것으로 밝혀진 생물학적 활성 화합물입니다. MSCs가 또한 그들의 분비물을 포함한 여러 메커니즘을 통해 당뇨병과 그 합병증에 치료 효과가있는보고뿐만 아니라 면역 조절 작용의 광범위한 배열22,23,24 인 것으로 여기에서 주목할 만하다.
이 프로토콜에서, 우리는 래트 부고환 지방으로부터 Ad-MSCs의 분리 및 특성화를 위한 상세한 단계적 프로토콜을 제시하고, 이어서 Ad-MSCs로부터 IPCs의 생성을 위한 간단하고 비교적 짧은 프로토콜이 뒤따른다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin, bovine serum Fraction V</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A3157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Rat CD90, FITC</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60024FI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 Monoclonal Antibody, FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA</td>
			<td>MA1-19594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA</td>
			<td>PA5-85917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I, powder</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher, USA</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose anhydrous, extra pure</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>G/0450/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithizone staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose 4.5 g/L</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low Glucose 1 g/L</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>12-707F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse/RNAse free water</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>24103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exendin-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E7144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, Brazil</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit</td>
			<td>R&#38;D systems Inc., MN, USA</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Insulin ELISA Kit</td>
			<td>Cloud-Clone Corp., USA</td>
			<td>CEA682Ra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Maxima</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>K0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.2 micron</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>431224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene-EDTA, 1X</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verso cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>AB-1453/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells

중간엽 줄기 세포 (MSCs)-특히 지방 조직 (Ad-MSCs)에서 분리 된 것들 -은 윤리적 인 우려를 제기하지 않는 재생 가능하고 풍부한 줄기 세포 공급원으로 특별한 주목을 받았습니다. 그러나 Ad-MSC를 분리하는 현재의 방법은 표준화되지 않았으며 특수 장비가 필요한 복잡한 프로토콜을 사용합니다. 우리는 간단하고 재현 가능한 방법을 사용하여 Sprague-Dawley 쥐의 부고환 지방으로부터 Ad-MSC를 분리했습니다. 분리된 Ad-MSCs는 부착성 세포가 섬유아세포 형태를 나타내기 때문에 보통 분리 후 3일 이내에 나타난다. 이러한 세포는 격리 후 1 주 이내에 80 %의 합류율에 도달합니다. 그 후, 계대 3-5 (P3-5)에서, CD90, CD73 및 CD105와 같은 특징적인 MSC 클러스터의 분화 표면 마커에 대한 면역표현형에 의해 단리된 Ad-MSCs에 대한 완전한 특성화를 수행하였고, 이들 세포의 분화를 유도할 뿐만 아니라 골형성, 지방형성, 및 연골형성 혈통을 아래로 유도하였다. 이것은 차례로 단리된 세포의 다분화능을 의미한다. 또한, 우리는 고글루코스 둘베코의 변형된 이글 배지 (HG-DMEM), β-메르캅토에탄올, 니코틴아미드 및 엑센딘-4를 통합함으로써 간단하고 비교적 짧은 프로토콜을 통해 인슐린 생산 세포 (IPCs) 계통을 향한 단리된 Ad-MSCs의 분화를 유도하였다. IPCs 분화는 먼저 생성된 IPCs에 대한 디티존 염색뿐만 아니라 MafA, NKX6.1, Pdx-1 및 Ins1과 같은 특이적 β세포 마커의 발현 수준을 측정함으로써 유전적으로 평가되었다. 둘째로, 평가는 또한 글루코스-자극된 인슐린 분비 (GSIS) 검정에 의해 기능적으로 수행되었다. 결론적으로, Ad-MSC는 모든 MSC 특성화 기준을 제시하여 쉽게 분리 될 수 있으며 당뇨병 연구를위한 실험실에서 풍부하고 재생 가능한 IPC 소스를 실제로 제공 할 수 있습니다.

Ad-MSC의 격리 및 특성화 도 2에 나타난 바와 같이, 지방 조직으로부터 분리된 세포는 단리의 다음날부터 시작하여 둥근 섬유아세포와 같은 세포의 이종 집단을 나타내었다(도 2A). 분리 4일 후, 섬유아세포는 수와 크기가 증가하기 시작했고, 계대 1에 의해 동질적인 집단으로 성장하였다(도 2B,C). 이들 세?...

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Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포 (Ad-MSCs)는 인슐린 생산 세포 (IPCs)로 분화되는 MSCs의 잠재적 인 원천이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 래트 부고환 Ad-MSCs의 분리 및 특성화를위한 상세한 단계를 제공하고, 동일한 래트 Ad-MSCs로부터의 IPC의 생성을위한 간단하고 짧은 프로토콜을 제공한다.

인슐린 생성 세포로 분화를 위한 쥐 지방조직 중간엽 줄기세포의 분리

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 적색 지방 조직을 분리하고 특성화하고, 건조 된 중간엽 줄기 세포를 간단한 방법을 사용하여 인슐린 생산 세포로 분화시키는 것입니다. 중간엽 줄기 세포는 유전학 분야에서 방법을 발견했습니다. 그들은 골수, 지방 조직 및 주산기 조직과 같은 다양한 출처에서 분리 될 수 있습니다.그들은 우수한 문화적 특성을 받아들입니다. 그들은 다 강력하며 잠재적으로 다양한 질병을 치료할 수 있습니다. 지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 풍부한 공급원을 제공합니다.이러한 지방 MSCs는 골수와 같은 다른 공급원에 비해 높은 수율로 리포 흡인물로부터 쉽게 분리될 수 있다. 그리고 그들은 자가 이식과 동종 이식 모두에 대한 좋은 소스를 제공 할 수 있습니다. 이 비디오에서는 쥐 부고환 지방으로부터 지방 중간엽 줄기 세포의 분리 및 특성화를위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.이 절차는 격리를위한 간단한 매우 효율적인 방법입니다. 분리 후, 우리는 간단하고 비교적 짧은 프로토콜을 사용하여 이러한 지방 중간엽 줄기 세포를 인슐린 생산 세포로 분화시키는 것을 견딜 것입니다. 우리는 더 강한 혈관 분획을 얻기 위해 부고환 지방의 콜라겐 소화에 의한 지방 중간엽 줄기 세포의 분리로 시작할 것입니다.그 다음 중간엽 줄기 세포는 그들의 플라스틱 부착뿐만 아니라 CD 마커의 발현 및 다중 중배엽 혈통으로의 분화를 특징으로 할 것이다. 동물을 마취 한 다음 자궁 경부 탈구를 사용하여 안락사하십시오. 70 % 에탄올로 몸 전체에 뿌리고 복부 아래 부분의 피부와 근육을 절제하는 것으로 시작하십시오.그런 다음 부고환 지방으로 고환을 노출시킵니다. 부고환 지방을 부드럽게 자릅니다. 지방으로 혈관을 자르지 않도록주의하십시오.바이오 안전 캐비닛에서 포셉과 메스를 사용하여 지방 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 지방 조직을 10 밀리리터의 멸균 PBS를 함유하는 원심분리 튜브 내로 옮긴다. 팔콘 튜브를 45 초 동안 기울여 세탁을 시작하십시오.그런 다음 튜브를 다섯 분 동안 서 두어 두 층으로 분리하십시오. 10 밀리리터 주사기를 사용하여 주입된 PBS를 제거한다. PBS가 명확해질 때까지 이 세척 단계를 네 번에서 다섯 번 반복하십시오.세척 후, 지방 조직을 콜라겐 용액에 재현탁시킨 다음, 조직이 거의 균질해질 때까지 진탕 수조에서 인큐베이션한다. 그 후, 조직 콜라겐 혼합물을 15초 동안 와류시킨 다음, 이후 5분 동안 원심분리한다. 원심 분리 후, 당신은 세 개의 층을 갖게됩니다.기질 혈관 분획 위에 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 먼저 상단의 오일층을 조심스럽게 버리고, 이어서 기질 혈관 분획 펠릿을 방해하지 않고 에코층을 버린다. 기질 혈관 분획을 멸균 BSA에 재현탁시키고 다섯 분 동안 다시 원심분리한다.전체 원심분리, 완전한 DMEM F-12 배지를 25 센티미터 평방 플라스크에 넣으십시오. 원심분리 후, 상층액을 버리고 기질 혈관 펠릿을 완전한 DMEM F-12 배지에 재현탁시킨다. 배양 플라스크로 옮긴다.37도 5 % 이산화탄소 인큐베이터에 두십시오. 다음 날, 부착되지 않은 세포를 제거하고 배지를 새로운 배지로 교체하십시오. 격리 다음 날부터 섬유아세포와 같은 세포가 나타나기 시작합니다.그런 다음 시간이 지남에 따라 점차적으로 숫자와 크기가 증가합니다. 통과에 의해, 세포는 더욱 균질해질 것이다. 이들 세포는 모든 중간엽 줄기 세포 특성화 기준을 나타낸다.이들 세포는 니코틴아미드 베타 머캅토에탄올 및 엑센딘-4를 함유하는 이 간단한 프로토콜을 사용하여 인슐린 생산 세포로 분화되었다. 분화 단계 전반에 걸쳐, 세포는 섬유아세포 형태를 잃기 시작하고, 나는 형태학처럼 군집을 생각한다. 인슐린 생산 세포가 양성 진홍색 디시톤 염색을 보이면 인슐린 생산 세포가 Pdx-1, mafA 및 인슐린과 같은 다양한 베타 세포 마커를 발현합니다.또한, 유도된 인슐린 생성 세포는 더 높은 글루코스 농도로 도전받을 때 상청액에서 더 높은 수준의 인슐린을 분비한다. 우리는 지방 중간엽 줄기 세포의 분리 및 특성화를위한 상세하고 단계적인 프로토콜을 제공했습니다. 우리는 또한 지방 중간엽 줄기 세포를 인슐린 생산 세포로 분화시키기위한 비교적 짧고 간단하며 효율적인 프로토콜을 제공합니다.이것은 연구자가 중간엽 줄기 세포 분야에 진입하여 인슐린 생산 세포로의 분화를 연구 할 수있는 관문을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

연구

발생학

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

원심 중력에 의해 지방이 유래 줄기 세포의 연골 분화 유도

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

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The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

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Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

파생 및 개 난소 중간 엽 줄기 세포의 분화

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...