Name: isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells
Uploaded: 2022-08-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells at JoVE.com

Reconhecemos a Dra. Rawda Samir Mohamed, MSc, Especialista Em Veterinária, Faculdade de Farmácia da Universidade Britânica do Egito (BUE) por ajudar na dissecação dos ratos.
Também gostaríamos de reconhecer e apreciar os esforços da Faculdade de Comunicação de Massa, a Universidade Britânica no Egito (BUE) para a produção e edição do vídeo deste manuscrito.
Gostaríamos de agradecer à Srta. Fatma Masoud, MSc, Professora Assistente de Inglês, Universidade Britânica no Egito (BUE) pela revisão e revisão da língua inglesa do manuscrito.
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculdade de Farmácia, Universidade Britânica no Egito (BUE), Cairo, Egito.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Farmácia, Universidade Britânica no Egito (BUE), Cairo, Egito. O protocolo de isolamento Ad-MSC foi adotado por Lopez e Spencer, com modificações15.
1. Isolamento de Ad-MSCs de almofadas de gordura epidídica de ratos
<ol><li>Use ratos sprague-dawley machos pesando 250-300 g que não têm mai...

<ol>
	<li>Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+for+cancer+therapy.">Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).</li><li>Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+and+therapeutic+strategies+of+mesenchymal+stem+cells+in+regenerative+medicine.">Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine.</a> Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow.">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li><li>De Ugarte, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+stem+cell+mobilization-associated+molecules+on+multi-lineage+cells+from+adipose+tissue+and+bone+marrow.">Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow.</a> Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).</li><li>Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+and+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells:+A+user's+guide.">Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide.</a> Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).</li><li>Camara, B. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+canine+adipose+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells:+Comparison+of+different+culture+medium+compositions.">Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions.</a> Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion,+and+differentiation+of+goat+adipose-derived+stem+cells.">Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells.</a> Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).</li><li>Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-tissue+engineering:+Taking+advantage+of+the+properties+of+human+adipose-derived+stem/stromal+cells.">Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells.</a> Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Gong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+stimulate+intestinal+stem+cells+to+repair+radiation-induced+intestinal+injury.">Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2387 (2016).</li><li>Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine+applications.">Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications.</a> Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).</li><li>Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effect+of+adipose-derived+stem+cells:+The+cutting+edge+of+clinical+application.">Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).</li><li>Karp, J., Leng Teo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+homing:+The+devil+is+in+the+details.">Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details.</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).</li><li>Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Lopez, M. J., Spencer, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+adult+rat+adipose+tissue-derived+stromal+cell+isolation+and+differentiation.">In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).</li><li>Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+insulin-producing+cells+from+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+by+genetic+manipulation.">Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation.</a> Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).</li><li>Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+phenotype+and+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells+aging+in+vitro.">Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 131 (2018).</li><li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stromal+cells+from+human+marrow+home+to+and+promote+repair+of+pancreatic+islets+and+renal+glomeruli+in+diabetic+NOD/scid+mice.">Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).</li><li>Gao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+apelin+in+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cell+reverses+insulin+resistance+and+promotes+pancreatic+&#946;+cell+proliferation+in+type+2+diabetic+rats.">Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic &#946; cell proliferation in type 2 diabetic rats.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 339 (2018).</li><li>Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+mesenchymal+stromal/stem+cells+to+insulin-producing+cells:+Progress+and+challenges.">From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exendin-4+enhances+the+differentiation+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells+through+activation+of+various+&#946;-cell+markers.">Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various &#946;-cell markers.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 108 (2016).</li><li>Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+diabetic+retinopathy+by+engrafted+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+in+streptozotocin+diabetic+rats.">Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).</li><li>Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+induce+angiogenesis+and+attenuate+the+remodeling+of+diabetic+cardiomyopathy.">Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy.</a> Experimental and Clinical Endocrinology &amp; Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).</li><li>Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+potential+of+early-+and+late-passage+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+hypoxia+and+normoxia.">Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia.</a> Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).</li><li>Krishnamurthy, H., Cram, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+flow+cytometry.">Basics of flow cytometry.</a> Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).</li><li>Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exendin-4+enhances+osteogenic+differentiation+of+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+through+the+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappa+B+and+osteoprotegerin+signaling+pathway.">Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+from+obese+mice+prevent+body+weight+gain+and+hyperglycemia.">Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 12 (1), 277 (2021).</li><li>Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-step+mechanical+digestion+method+to+harvest+adipose-derived+stromal+vascular+fraction.">A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).</li><li>Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue-derived+stem+cells:+Enzymatic+digestion+in+combination+with+mechanical+distortion+to+increase+adipose+tissue-derived+stem+cell+yield+from+human+aspirated+fat.">Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).</li><li>Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase+impacts+the+quantity+and+quality+of+native+mesenchymal+stem/stromal+cells+derived+during+processing+of+umbilical+cord+tissue.">Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue.</a> Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).</li><li>Kamal, M. M., Kassem, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+for+diabetes:+Achievements+and+challenges.">Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).</li><li>Gabr, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+human+mesenchymal+stem+cells+to+insulin-producing+cells:+Comparison+between+bone+marrow-+and+adipose+tissue-derived+cells.">From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells.</a> BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+differentiated+from+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+vitro+ameliorate+streptozotocin-induced+diabetic+hyperglycemia.">Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia.</a> PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+efficacy+of+umbilical+cord-derived+stem+cells+for+diabetes+mellitus:+A+meta-analysis+study.">Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 484 (2020).</li><li>El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Wharton's+jelly+and+cord+blood+as+a+source+of+mesenchymal+stem+cells+for+diabetes+cell+therapy.">A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy.</a> Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+expression+levels+of+pluripotency/stem+cell+markers+with+the+differentiation+outcome+of+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin+producing+cells.">Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells.</a> Biochimie. 127, 187-195 (2016).</li><li>El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+can+potentially+differentiate+Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells.">Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells.</a> Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).</li><li>Gabr, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+from+adult+human+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells+could+control+chemically+induced+diabetes+in+dogs:+A+preliminary+study.">Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study.</a> Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).</li></ol>

Neste protocolo, conseguimos apresentar um protocolo detalhado para o isolamento dos Ad-MSCs da gordura epidídica de ratos e a diferenciação desses Ad-MSCs em IPCs. De fato, a gordura epidídimal de rato é uma fonte facilmente atingível de tecido adiposo para a obtenção de Ad-MSCs e não requer nenhum equipamento especial, nem para coleta nem para processamentode 15,26,27. Os Ad-MSCs isolados apresentaram excelente expans...

As células-tronco mesenquimais (MSCs), também conhecidas como células estromais mesenquimais, estão entre os tipos de células mais amplamente utilizados para a medicina regenerativa 1,2. São classificadas como células-tronco adultas e caracterizadas pelo potencial de diferenciação multilineagem e capacidade de auto-renovação3. Os MSCs podem ser isolados e obtidos de várias fontes, incluindo tecido adiposo, medula óssea, sangue periférico, tecido do cordão umbilical e sangue, folículos capilares e dentes 4,5.
O isolamento das células-tronco do tecido adiposo é visto como atraente e promissor devido ao seu fácil acesso, rápida expansão in vitro e alto rendimento6. As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser isoladas de diferentes espécies, como humanos, bovinos, ratos, ratos e, mais recentemente, cabras7. Foi comprovado que os Ad-MSCs são agora potenciais candidatos à engenharia de tecidos e terapia gene/célula que podem até ser usados para desenvolver uma alternativa autóloga para a reparação a longo prazo de lesões de tecido mole ou defeitos 7,8.
A Sociedade Internacional de Terapia Celular e Genética (ISCT) definiu três critérios mínimos que devem ser apresentados pelos MSCs para caracterização completa9. Primeiro, eles devem ser adeptos de plástico. Em segundo lugar, os MSCs devem expressar marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais como CD73, CD90 e CD105 e falta de expressão dos marcadores hematopoiéticos CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA-DR. Finalmente, os MSCs devem exibir a capacidade de diferenciar-se nas três linhagens mesenquimais: adipócitos, osteocitos e condrócitos. Curiosamente, os MSCs também podem se diferenciar em outras linhagens, como células neuronais, cardiomiócitos, hepatócitos e células epiteliais10,11.
De fato, os MSCs possuem propriedades únicas que lhes permitem ser aplicados como potenciais agentes terapêuticos na terapia regenerativa para diferentes doenças. Os MSCs podem segregar fatores solúveis para induzir um ambiente imunomodulatório que proporciona benefícios terapêuticos12. Além disso, os MSCs podem migrar para locais de lesões e microambientes tumorais para fornecer terapia direcionada; no entanto, os mecanismos não são totalmente elucidados13. Além disso, os MSCs têm a capacidade de segregar exosósmos, vesículas extracelulares na nanoescala que carregam uma carga de RNAs não codificantes, proteínas e fatores solúveis, que recentemente surgiram como um novo mecanismo do potencial terapêutico dos MSCs em várias doenças14.
Mais importante, os MSCs têm gerado atenção marcante para seu potencial de diferenciação em células produtoras de insulina (IPCs), seja por modificação genética15,16 ou através da utilização de vários fatores indutores extrínsecos dentro da mídia cultural in vitro17. O período de indução do IPC varia muito, pois depende do protocolo de indução utilizado e dos fatores extrínsecos utilizados. O processo de diferenciação pode durar de dias a meses, e requer uma combinação de fatores indutores exógenos que devem ser adicionados e/ou retirados em diferentes estágios. Muitos desses fatores que têm sido utilizados para a diferenciação pancreática endócrina são compostos biologicamente ativos que têm sido mostrados para promover a proliferação ou diferenciação/neogênese de células β e/ou aumentar o teor de insulina dos IPCs 18,19,20,21. Vale ressaltar aqui que os MSCs também têm tido efeitos terapêuticos no diabetes e suas complicações através de diversos mecanismos, incluindo seu secretome, bem como uma ampla gama de ações imuno-modulatórias 22,23,24.
Neste protocolo, apresentamos um protocolo passo detalhado para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs a partir de gordura epidídica de ratos, seguido por um protocolo simples e relativamente curto para a geração de IPCs a partir de Ad-MSCs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin, bovine serum Fraction V</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A3157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Rat CD90, FITC</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60024FI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 Monoclonal Antibody, FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA</td>
			<td>MA1-19594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA</td>
			<td>PA5-85917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I, powder</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher, USA</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose anhydrous, extra pure</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>G/0450/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithizone staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose 4.5 g/L</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low Glucose 1 g/L</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>12-707F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse/RNAse free water</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>24103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exendin-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E7144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, Brazil</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit</td>
			<td>R&#38;D systems Inc., MN, USA</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Insulin ELISA Kit</td>
			<td>Cloud-Clone Corp., USA</td>
			<td>CEA682Ra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Maxima</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>K0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.2 micron</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>431224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco Thermo Fisher, USA</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene-EDTA, 1X</td>
			<td>Lonza, Switzerland</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verso cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>AB-1453/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells

As células-tronco mesenquimais (MSCs)- especialmente aquelas isoladas do tecido adiposo (Ad-MSCs)-ganharam atenção especial como uma fonte renovável e abundante de células-tronco que não representam nenhuma preocupação ética. No entanto, os métodos atuais para isolar os Ad-MSCs não são padronizados e empregam protocolos complicados que requerem equipamentos especiais. Isolamos os Ad-MSCs da gordura epidídimamal dos ratos de Sprague-Dawley usando um método simples e reprodutível. Os Ad-MSCs isolados geralmente aparecem dentro de 3 dias após o isolamento, já que as células aderentes apresentam morfologia fibroblástica. Essas células atingem 80% de confluência em 1 semana de isolamento. Posteriormente, na passagem 3-5 (P3-5), foi realizada uma caracterização completa para os Ad-MSCs isolados por imunofenofoteping para aglomerados característicos de marcadores de superfície msc de diferenciação (CD), como CD90, CD73 e CD105, bem como induzir diferenciação dessas células pelas linhagenias osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas. Isso, por sua vez, implica a multipotência das células isoladas. Além disso, induzimos a diferenciação dos Ad-MSCs isolados em relação à linhagem de células produtoras de insulina (IPCs) através de um protocolo simples e relativamente curto, incorporando o meio eagle modificado de alta glicose Dulbecco (HG-DMEM), β-mercaptoetanol, nicotinamida e exendin-4. A diferenciação dos IPCs foi geneticamente avaliada, em primeiro lugar, através da medição dos níveis de expressão de marcadores específicos de células β, como MafA, NKX6.1, Pdx-1 e Ins1, bem como a coloração de dithizone para os IPCs gerados. Em segundo lugar, a avaliação também foi realizada funcionalmente por um ensaio de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS). Em conclusão, os Ad-MSCs podem ser facilmente isolados, exibindo todos os critérios de caracterização do MSC, e eles podem de fato fornecer uma fonte abundante e renovável de IPCs no laboratório para pesquisa de diabetes.

Isolamento e caracterização de Ad-MSCs Como mostrado na Figura 2, as células isoladas do tecido adiposo mostraram uma população heterogênea de células arredondadas e semelhantes a fibroblastos a partir do dia seguinte de isolamento (Figura 2A). 4 dias após o isolamento, as células do fibroblasto começaram a aumentar em número e tamanho e crescer como uma população homogênea pela passagem 1 (Figura 2B,C</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells at JoVE.com

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser uma fonte potencial de MSCs que se diferenciam em células produtoras de insulina (IPCs). Neste protocolo, fornecemos passos detalhados para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs epidímicas de ratos, seguidos de um protocolo simples e curto para a geração de IPCs a partir dos mesmos Ad-MSCs de ratos.

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo de rato para diferenciação em células produtoras de insulina

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

O objetivo geral deste protocolo é isolar e caracterizar tecido adiposo vermelho, células-tronco mesenquimais secas e diferenciá-las para células produtoras de insulina usando métodos simples. Células-tronco mesenquimais encontraram caminhos no campo da genética. Eles podem ser isolados de várias fontes, como medula óssea, tecido adiposo e tecido perinatal.Eles aceitam excelentes características culturais. Eles são multipotentes e podem potencialmente tratar várias doenças. O tecido adiposo fornece uma rica fonte de células-tronco mesenquimais.Estes MSCs adiposos podem ser isolados de lipo aspira facilmente com alto rendimento em comparação com outras fontes como medula óssea. E eles podem fornecer uma boa fonte para transplantes autólogos e aogênicos. Neste vídeo estão apresentando um protocolo simples para isolamento e caracterização de células-tronco mesenquimais adiposas de gordura epidídica de ratos.Este procedimento é um método simples e altamente eficiente para o isolamento. Após o isolamento, suportaremos a diferenciação dessas células-tronco mesenquimais adiposas em células produtoras de insulina usando um protocolo simples e relativamente curto. Começaremos com o isolamento de células-tronco mesenquimais adiposas por digestão colágena de gordura epidídica para obter uma fração vascular mais forte.Em seguida, as células-tronco mesenquimais serão caracterizadas por sua adesão plástica, bem como expressão de marcadores de CD e diferenciação em múltiplas linhagens mesodérmicas. Anestesiar o animal, depois eutanásia usando luxação cervical. Espirre todo o corpo com 70% de etanol e comece com excisão da pele e dos músculos na parte inferior do abdômen.Em seguida, exponha os testículos com a gordura epidímica. Corte suavemente a gordura epidídica. Tenha cuidado para não cortar os vasos sanguíneos com as gorduras.Em um armário de segurança biológica, corte o tecido adiposo em pequenos pedaços usando fórceps e bisturi. Transfira o tecido adiposo para tubo de centrífuga contendo 10 mililitros estéreis PBS. Comece a lavar inclinando o tubo falcão por 45 segundos.Em seguida, mantenha o tubo em pé por cinco minutos para separar em duas camadas. Remova o PBS infraado usando uma seringa de 10 mililitros. Repita estas etapas de lavagem quatro a cinco vezes até que o PBS esteja limpo.Após a lavagem, suspenda novamente o tecido adiposo em solução colágena e, em seguida, incubar no banho de água tremendo até que o tecido esteja quase homogêneo. Depois, o vórtice a mistura de tecido colágeno por 15 segundos, depois centrífuga depois por cinco minutos. Após a centrifugação, você terá três camadas.Descarte cuidadosamente o sobrenante sobre a fração vascular estromica. Primeiro descarte a camada de óleo na parte superior cuidadosamente, seguido pela camada de ecos sem perturbar a pelota de fração vascular estromida. Suspenda a fração vascular stromal em BSA estéril e re-centrífuga por cinco minutos.Centrifugação inteira, coloque mídia DMEM F-12 completa em frasco quadrado de 25 centímetros. Após a centrifugação, descarte o supernasciente e suspenda a pelota vascular estromica em toda a mídia DMEM F-12. E transferir para o frasco de cultura.Coloque em incubadora de dióxido de carbono de 37 graus 5%. No dia seguinte, remova células nãoectadas e substitua a mídia por mídia fresca. A partir do próximo dia de isolamento, as células semelhantes ao fibroblasto começarão a aparecer.Em seguida, gradualmente, com o passar do tempo, eles aumentarão em número e tamanho. Ao passar, as células se tornarão mais homogêneas. Essas células exibem todos os critérios de caracterização de células-tronco mesenquimais.Estas células foram diferenciadas para células produtoras de insulina usando este protocolo simples contendo nicotinamida beta mercaptoetanol e Exendin-4. Ao longo dos passos de diferenciação, as células começam a perder sua forma fibroblástica e eu acho que aglomerado como morfologia. Quando as células produtoras de insulina usadas mostram uma coloração de dissimundo vermelha positiva, então as células produtoras de insulina expressam vários marcadores de células beta como Pdx-1, mafA e insulina.Além disso, as células produtoras de insulina induzidas secretam níveis mais altos de insulina no supernante quando desafiados com maior concentração de glicose. Fornecemos um protocolo detalhado e passo a passo para o isolamento e caracterização das células-tronco mesenquimais adiposas. Também fornecemos aqui um protocolo relativamente curto, simples e eficiente para diferenciação de células-tronco mesenquimais adiposas em células produtoras de insulina.Isso fornece uma porta de entrada para o pesquisador entrar no campo das células-tronco mesenquimais e estudar sua diferenciação em células produtoras de insulina.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolamento e diferenciação de células tronco derivadas de tecido adiposo de Suínos Subcutânea tecidos adiposos

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Condrogênica Diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Derivação e diferenciação de células-tronco mesenquimais ovário canina

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...