Name: modified technique for the use of neonatal murine hearts in the langendorff preparation
Uploaded: 2022-03-04T13:00:00
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NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)

Le approvazioni del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Columbia University Medical Center sono state ottenute per tutti i metodi descritti. Per lo studio sono stati utilizzati topi maschi wild-type C57Bl/6 maschi del giorno 10.
1. Preparazione dell'apparato langendorff
<ol><li>Per ridurre al minimo la complessità, utilizzare perfusato ossigenato non ricircolante all'interno dell'apparato Langendorff (vedere Tabella dei materiali) <...

<ol>
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Il presente lavoro descrive il successo della cannulazione aortica e della perfusione retrograda nel cuore isolato del topo appena nato. È importante sottolineare che consente ai ricercatori di superare le barriere che i giovani di età murina e le piccole dimensioni del cuore hanno precedentemente presentato8. Sebbene non sia complesso nella progettazione, l'approccio richiede un grado significativo di abilità tecnica. I passaggi chiave che inevitabilmente sfideranno anche i ricercatori tecnica...

I preparati cardiaci ex-vivo sono stati un punto fermo degli studi fisiologici, fisiopatologici e farmacologici per oltre un secolo. Derivando dal lavoro di Elias Cyon nel 1860, Oskar Langendorff ha adattato il modello di rana isolata per la perfusione retrograda, pressurizzando la radice aortica per fornire il flusso coronarico con un perfusato ossigenato1. Usando il suo adattamento, Langendorff è stato in grado di dimostrare una correlazione tra circolazione coronarica e funzione meccanica2. Il cuore perfuso retrogrado ex-vivo, in seguito soprannominato la tecnica Langendorff, è rimasto una pietra miliare dell'indagine fisiologica, sfruttando la sua semplicità per studiare potentemente il cuore isolato in assenza di potenziali fattori confondenti. La preparazione di Langendorff è stata ulteriormente modificata per consentire al cuore di espellere (il cosiddetto "cuore di lavoro") e consentire al perfusato di ricircolare3. Tuttavia, gli endpoint fisiologici primari di interesse sono rimasti invariati. Tali endpoint includono misure della funzione contrattile, della conduzione elettrica, del metabolismo cardiaco e della resistenza coronarica4.
Per valutare la funzione cardiaca nella sua preparazione originale del cuore di rana, Langendorff ha misurato la tensione generata dalla contrazione ventricolare nell'asse longitudinale utilizzando una sutura collegata tra l'apice del cuore e un trasduttore di forza. 5 La contrazione isometrica è stata quantificata in questo modo con tensione basale applicata al cuore in assenza di riempimento ventricolare. Il perfezionamento dell'approccio ha portato a palloncini pieni di liquido posizionati nel ventricolo sinistro attraverso l'atrio sinistro per valutare le prestazioni miocardiche durante la contrazione isovolumica6. Per valutare il ritmo cardiaco e la frequenza cardiaca, i cavi superficiali possono essere posizionati sui poli del cuore per consentire agli investigatori di registrare l'elettrocardiogramma. Tuttavia, ci si può aspettare una bradicardia relativa, data la denervazione obbligatoria. La stimolazione estrinseca può servire a superare questo ed eliminare la variabilità della frequenza cardiaca tra gli esperimenti1. Un'altra misura di esito, il metabolismo miocardico, può essere valutata misurando il contenuto di ossigeno e substrato metabolico nel perfusato coronarico e nell'effluente e calcolando la differenza tra loro7. La quantificazione del lattato nell'effluente coronarico può aiutare a caratterizzare i periodi di metabolismo anaerobico come si vede con ipossia, ipoperfusione, ischemia-riperfusione o perturbazioni metaboliche7.
Il lavoro originale di Langendorff ha permesso lo studio del cuore dei mammiferi ex-vivo, utilizzando i gatti come soggetto principale5. La valutazione del cuore di ratto isolato ha guadagnato popolarità a metà del 1900 con Howard Morgan, che ha dettagliato il modello di ratto "cuore funzionante" nel 19675. L'uso dei topi è iniziato solo 25 anni fa a causa della complessità tecnica, della fragilità dei tessuti e delle dimensioni relativamente piccole del cuore murino. Nonostante le sfide associate allo studio sui topi, i costi inferiori e la facilità di manipolazione genetica hanno aumentato l'attrattiva e la domanda di tali preparati murini ex-vivo. Sfortunatamente, l'applicazione della tecnica è stata limitata agli animali adulti, con i topi giovani di 4 settimane che sono i soggetti più giovani utilizzati per lo studio ex-vivo fino a poco tempo fa 8,9. Mentre i topi giovani sono "relativamente immaturi" rispetto agli adulti, la loro utilità come soggetti per gli studi di biologia dello sviluppo è limitata perché, in generale, hanno svezzato dalla loro diga di nascita e presto inizieranno la pubertà10. L'adolescenza si verifica ben oltre la transizione postnatale nell'utilizzo del substrato miocardico da glucosio e lattato agli acidi grassi11. Pertanto, la maggior parte delle informazioni sui cambiamenti metabolici nel cuore neonatale è storicamente il risultato di un lavoro ex-vivo in specie più grandi come conigli e porcellini d'India11.
In effetti, esistono approcci alternativi alla preparazione di Langendorff. Questi includono la sperimentazione in vitro, che manca dei dati funzionali e del contesto dell'intero organo, o studi in vivo. Questo può essere tecnicamente impegnativo e complicato confondendo variabili come gli effetti cardiovascolari e respiratori di un agente anestetico richiesto, l'influenza dell'input neuroumorale, le conseguenze della temperatura interna, lo stato nutrizionale dell'animale e la disponibilità del substrato12,13. Poiché l'approccio di Langendorff consente lo studio del cuore isolato-perfuso in modo ex-vivo in modo più controllato in assenza di tali fattori confondenti, è stato e continua ad essere considerato un potente strumento sperimentale. Pertanto, la tecnica qui presentata offre ai ricercatori un approccio sperimentale per lo studio ex-vivo del cuore murino appena nato e limita il tempo alla riperfusione.
Studiare il cuore durante i periodi di sviluppo è una considerazione importante date le transizioni biochimiche, fisiologiche e anatomiche ad ampio raggio che si verificano durante la maturazione miocardica. I passaggi dal metabolismo anaerobico alla fosforilazione ossidativa, i cambiamenti nell'utilizzo del substrato e la progressione dalla proliferazione cellulare all'ipertrofia sono processi dinamici che si verificano in modo univoco nel cuore immaturo11,14. Un altro aspetto critico del cuore in via di sviluppo è che i fattori di stress incontrati durante i periodi necessari possono produrre risposte intensificate nel cuore neonato e alterare la futura suscettibilità agli insulti in età adulta15. Sebbene il lavoro precedente abbia utilizzato ratti appena nati, agnelli e conigli per studiare il cuore neonatale perfuso di Langendorff, i progressi che consentono l'uso di topi sono necessari data l'importanza di questa specie per la ricerca sulla biologia dello sviluppo16. Per rispondere a questa esigenza, il primo modello murino di cuore neonato perfuso di Langendorff che utilizza animali di 10 giorni è stato recentemente istituito6. Qui viene presentato un metodo per consentire il successo della cannulazione aortica e stabilire la perfusione retrograda del cuore murino neonato isolato. Questo approccio può essere utilizzato per la farmacologia, l'ischemia-riperfusione o studi sul metabolismo incentrati sulla funzione dell'intero organo o può essere adattato per l'isolamento dei cardiomiociti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rodent Langendorff Apparatus</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130102EZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 G catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>381511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G needle on 1 mL syringe combo</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G steel needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Silk Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Amp</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>FE135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLA1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating heating water Bath</td>
			<td>Haake</td>
			<td>DC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved iris scissor</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS10033Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>find spring scissors</td>
			<td>Kent</td>
			<td>INS600127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLT1030/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure tubing</td>
			<td>Edwards Lifesciences</td>
			<td>50P184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iris dressing forceps</td>
			<td>Kent</td>
			<td>INS650915-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jeweler-style curved fine forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>17-307-MLTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight dissecting scissors</td>
			<td>Kent</td>
			<td>INS600393-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temporary cardiac pacing wire</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>TPW30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Range Force Transducer</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLT1030/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified technique for the use of neonatal murine hearts in the langendorff preparation

L'uso del cuore perfuso retrogrado ex-vivo è stato a lungo una pietra miliare dell'indagine sull'ischemia-riperfusione sin dal suo sviluppo da parte di Oskar Langendorff oltre un secolo fa. Sebbene questa tecnica sia stata applicata ai topi negli ultimi 25 anni, il suo uso in questa specie è stato limitato agli animali adulti. Lo sviluppo di un metodo di successo per cannulare costantemente l'aorta murina neonatale consentirebbe lo studio sistematico del cuore perfuso retrogrado isolato durante un periodo critico di sviluppo cardiaco in una specie geneticamente modificabile e a basso costo. La modifica della preparazione di Langendorff consente la cannulazione e l'instaurazione della riperfusione nel cuore murino neonatale riducendo al minimo il tempo ischemico. L'ottimizzazione richiede una tecnica a due persone per consentire il successo della cannulazione dell'aorta del topo appena nato utilizzando un microscopio di dissezione e un ago modificato disponibile in commercio. L'uso di questo approccio stabilirà in modo affidabile la perfusione retrograda entro 3 minuti. Poiché la fragilità del cuore del topo neonatale e delle dimensioni della cavità ventricolare impedisce la misurazione diretta della pressione intraventricolare generata utilizzando un palloncino, è necessario l'uso di un trasduttore di forza collegato da una sutura all'apice del ventricolo sinistro per quantificare la tensione contrattile longitudinale. Questo metodo consente ai ricercatori di stabilire con successo una preparazione isolata di cuore murino neonato retrogrado perfuso a flusso costante, consentendo lo studio della biologia cardiaca dello sviluppo in modo ex-vivo . È importante sottolineare che questo modello sarà un potente strumento per studiare le risposte fisiologiche e farmacologiche all'ischemia-riperfusione nel cuore neonatale.

I topi P10 sono stati utilizzati per modellare un timepoint nell'infanzia umana26,27. Quindici cuori di topo appena nati C57Bl/6 isolati sono stati raccolti e cannulati con successo. I cuori sono stati perfusi con un flusso continuo di 2,5 ml min-1 di KHB ossigenato riscaldato. Sono stati misurati i parametri metabolici, tra cui l'estrazione del glucosio, il consumo di ossigeno, la produzione di lattato e parametri fisiologici come la frequenza cardiac...

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Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation

Il presente protocollo descrive la cannulazione aortica e la perfusione retrograda del cuore murino neonatale ex-vivo . Una strategia per due persone, utilizzando un microscopio di dissezione e un ago smussato di piccolo calibro, consente una cannulazione affidabile. La quantificazione della tensione contrattile longitudinale si ottiene utilizzando un trasduttore di forza collegato all'apice del ventricolo sinistro.

Tecnica modificata per l'uso di cuori murini neonatali nella preparazione di Langendorff

The use of the ex-vivo retrograde perfused heart has long been a cornerstone of ischemia-reperfusion investigation since its development by Oskar ...

Questo approccio stabilisce in modo affidabile la perfusione retrograda del cuore neonatale ex vivo del topo in meno di tre minuti. Riducendo così l'età di studio più giovane possibile da diverse settimane a 10 giorni postnatali. Questo modello isolato retrogrado perfuso consente lo studio del cuore neonatale durante un periodo critico di sviluppo cardiaco in una specie geneticamente modificabile e a basso costo.Mentre questo modello si presta allo studio delle risposte fisiologiche e farmacologiche all'ischemia-riperfusione nel cuore neonatale. Potrebbe anche essere utilizzato per l'isolamento dei cardiomiociti. Per fabbricare la cannula aortica del topo appena nato utilizzare forbici affilate per tagliare la punta e smussare l'estremità di un ago in acciaio inossidabile calibro 26, facendo attenzione a non crimpare o limitare il diametro del lume dell'ago.Quindi levigare il bordo tagliato per rimuovere eventuali sbavature raschiando delicatamente l'estremità smussata sul piano di lavoro del laboratorio con un movimento avanti e indietro. Quindi, collegare la cannula fabbricata all'apparato Langendorff e valutare il flusso e la resistenza. Misurare le portate attraverso la cannula raccogliendo e misurando la quantità del buffer in un intervallo di un minuto.Per quantificare il differenziale di pressione attraverso la cannula mentre scorre il tampone Krebs-Heneseleit, misurare la pressione nel sistema con e senza la cannula attaccata. Quindi calcolare la resistenza della cannula utilizzando la seguente formula. Quindi, rimuovere la cannula a 26 gauge dall'apparecchio Langendorff e collegare un tubo ad alta pressione al sito di cannulazione sull'apparecchio.Quindi collegare la cannula aortica all'estremità distale del tubo e arieggiare il tubo e la cannula con tampone ossigenato, assicurandosi che tutte le bolle vengano rimosse. Per prevenire la formazione di microtrombi coronarici, somministrare un'iniezione intraperitoneale di eparina a un cucciolo di topo di 10 giorni utilizzando un ago calibro 26 su una siringa da un millilitro. Lasciare circolare diversi minuti affinché l'eparina circoli prima di procedere con l'iniezione di qualsiasi anestetico.Quindi, posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina e fissare gli arti immediatamente dopo la perdita di coscienza. Inizia la raccolta non appena l'animale non risponde al pizzico della punta mentre l'animale respira spontaneamente durante la dissezione iniziale. Usando le forbici da dissezione diritte si crea un'incisione subssifoidea trasversale attraverso la larghezza degli animali esponendo la cavità addominale.Chiedi a un assistente di afferrare il processo xifoideo con una pinza, quindi taglia la gabbia toracica bilateralmente lungo la linea ascellare media in direzione cefalade e rifletti lo sterno e le costole cranicamente per esporre gli organi toracici. Dopo aver identificato il diaframma in modo superiore, incidere completamente la porzione anteriore. Identificare la vena cava inferiore infradiaframmatica sopra il fegato e transettarla con una forbice dell'iride curva mantenendo un leggero interno nella tensione cefalacea sul segmento prossimale con pinza dell'iride.Quindi, tagliare posteriormente lungo la superficie interna della colonna vertebrale usando forbici dell'iride curve mentre si tira la vena cava inferiore su e fuori dalla cavità toracica. Mentre il cuore viene mobilitato, inclina le forbici anteriormente e taglia i grandi vasi in modo superiore per rimuovere completamente il cuore e i polmoni. Immergere immediatamente l'esemplare in un tampone Krebs-Henseleit ghiacciato o in una soluzione salina.Il cuore dovrebbe smettere di battere in pochi secondi. Posizionare un pezzo di carta assorbente sul fondo di una capsula di Petri poco profonda per fornire attrito per stabilizzare il cuore durante la cannulazione. Inumidire il tovagliolo di carta con un tampone Krebs-Henseleit ghiacciato per evitare che il cuore aderisca ad esso.Posizionare la capsula di Petri preparata sotto il microscopio di dissezione e regolare la messa a fuoco. Ora, posiziona la cannula aortica attaccata al tubo di estensione ad alta pressione sotto il microscopio di dissezione, insieme a una sutura di seta 5-0 liberamente legata attorno al suo mozzo. Dopo aver posizionato gli organi toracici asportati nella capsula di Petri, identificare il timo dalla sua lucentezza bianca e due lobi e orientare l'esemplare in modo tale che il timo sia anteriore e superiore.Successivamente, usando una pinza separa senza mezzi termini i lobi del timo esponendo i grandi vasi. Quindi identificare l'aorta individuando le caratteristiche distintive di ramificazione dell'arco aortico e transettarla appena prossimale al decollo dell'arteria succlavia usando forbici affilate e fini. Ora afferra delicatamente l'aorta transettata usando una pinza curva fine stile gioielliere e cannulare con cura l'aorta con un ago smussato calibro 26, facendo attenzione a non danneggiare la valvola aortica.Usando una pinza curva fine, afferrare l'aorta attorno alla cannula e iniziare la perfusione retrograda per limitare il tempo ischemico. Chiedi all'assistente di afferrare le estremità della sutura legata liberamente e di intrappolare con cura l'aorta attorno alla cannula. Stringere la sutura sopra o sotto la pinza curva fine, quindi stringere la sutura e confermare l'adeguatezza del flusso coronarico.Scollegare il tubo ad alta pressione dall'apparecchio Langendorff, afferrare il mozzo della cannula e scollegare l'ago smussato dal tubo di estensione ad alta pressione. Quindi collegare rapidamente il mozzo della cannula all'apparecchio. Una volta che il cuore è appeso all'apparato di Langendorff nella posizione abituale, viene confermata un'adeguata perfusione.Tagliare con cura il polmone, il timo e il tessuto in eccesso. Quindi incidere l'atrio destro per consentire all'effluente del seno coronarico di gocciolare liberamente. Fai un piccolo nodo alla fine di una sutura di seta 5-0, quindi fora un piccolo pezzo di pellicola di paraffina con l'ago e fai scorrere la paraffina fino all'estremità annodata.Passare con attenzione l'ago attraverso l'apice del ventricolo e tirare la sutura attraverso il cuore fino a quando il film di paraffina è aderente alla parete laterale del ventricolo. Passare l'ago attraverso l'apertura della camicia riscaldante riempita d'acqua dell'apparato Langendorff in modo che il cuore possa essere racchiuso e riscaldato. Quindi collegare l'ago al trasduttore di forza evitando la flebo del seno coronarico.Regolare la sutura per applicare da uno a due grammi di tensione basale come indicato dalla tensione diastolica o dal tracciamento dell'intenzione del nadir. Quindi posizionare gli elettrodi di superficie sui poli superiore e inferiore del cuore per registrare l'elettrocardiogramma. Infine, campionare l'effluente del seno coronarico per l'analisi utilizzando un catetere endovenoso a 24 gauge.Gli elettrodi di superficie sono stati utilizzati per registrare un elettrocardiogramma continuo, che ha permesso di determinare la velocità e il ritmo intrinseci. Tutti i cuori adeguatamente perfusi battono spontaneamente a ritmo sinusale. Questa strategia di perfusione ha soddisfatto le esigenze metaboliche del cuore di topo appena nato, data la produzione trascurabile di lattato e la bassa percentuale di estrazione di ossigeno e consumo di glucosio.Sono state registrate e calcolate anche le medie variabili fisiologiche, come la frequenza cardiaca intrinseca media denervata e le pressioni medie di perfusione aortica osservate. Alcuni criteri di esclusione come il tempo necessario per iniziare la riperfusione, la durata dell'aritmia e la pressione di perfusione aortica devono essere considerati per garantire la coerenza della preparazione neonatale. Dopo l'instaurazione della perfusione, possono verificarsi interventi come la somministrazione di farmaci, l'induzione di danno da ischemia-riperfusione, alterazioni dei metaboliti o la somministrazione di agenti enzimatici per l'isolamento dei cardiomiociti.

Research

JoVE Journal

Medicine

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