Name: modified technique for the use of neonatal murine hearts in the langendorff preparation
Uploaded: 2022-03-04T13:00:00
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NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)

Se obtuvieron las aprobaciones del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Columbia para todos los métodos descritos. Para el estudio se utilizaron ratones machos de tipo salvaje C57Bl / 6 postnatal del día 10.
1. Preparación del aparato de Langendorff
<ol><li>Para minimizar la complejidad, utilice perfusato oxigenado no recirculante dentro del aparato de Langendorff (consulte la Tabla de materiales) ...

<ol>
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El presente trabajo describe la canulación aórtica exitosa y la perfusión retrógrada en el corazón aislado de ratón recién nacido. Es importante destacar que permite a los investigadores superar las barreras que la edad murina joven y el pequeño tamaño del corazón presentaban anteriormente8. Si bien no es complejo en diseño, el enfoque requiere un grado significativo de habilidad técnica. Los pasos clave que inevitablemente desafiarán incluso a los investigadores más competentes téc...

Las preparaciones cardíacas ex-vivo han sido un elemento básico de los estudios fisiológicos, fisiopatológicos y farmacológicos durante más de un siglo. A partir del trabajo de Elias Cyon en la década de 1860, Oskar Langendorff adaptó el modelo de rana aislada para la perfusión retrógrada, presurizando la raíz aórtica para proporcionar flujo coronario con un perfusato oxigenado1. Usando su adaptación, Langendorff pudo demostrar una correlación entre la circulación coronaria y la función mecánica2. El corazón perfundido retrógrado ex vivo, más tarde apodado epónimo la técnica de Langendorff, ha seguido siendo una piedra angular de la investigación fisiológica, aprovechando su simplicidad para estudiar poderosamente el corazón aislado en ausencia de posibles factores de confusión. La preparación de Langendorff se ha modificado aún más para permitir que el corazón se expulse (el llamado "corazón que funciona") y permitir que el perfusato recircule3. Sin embargo, los criterios de valoración fisiológicos primarios de interés se han mantenido sin cambios. Tales criterios de valoración incluyen medidas de la función contráctil, la conducción eléctrica, el metabolismo cardíaco y la resistencia coronaria4.
Para evaluar la función cardíaca en su preparación original de corazón de rana, Langendorff midió la tensión generada por la contracción ventricular en el eje longitudinal utilizando una sutura conectada entre el ápice del corazón y un transductor de fuerza. 5 La contracción isométrica se cuantificó de esta manera con tensión basal aplicada al corazón en ausencia de llenado ventricular. El refinamiento del abordaje ha llevado a balones llenos de líquido colocados en el ventrículo izquierdo a través de la aurícula izquierda para evaluar el rendimiento miocárdico durante la contracción isovolumétrica6. Para evaluar el ritmo cardíaco y la frecuencia cardíaca, se pueden colocar cables superficiales en los polos del corazón para permitir a los investigadores registrar el electrocardiograma. Sin embargo, se puede esperar bradicardia relativa, dada la denervación obligatoria. La estimulación extrínseca puede servir para superar esto y eliminar la variabilidad de la frecuencia cardíaca entre experimentos1. Otra medida de resultado, el metabolismo miocárdico, se puede evaluar midiendo el contenido de oxígeno y sustrato metabólico en el perfusato coronario y el efluente y calculando la diferencia entre ellos7. La cuantificación de lactato en el efluente coronario puede ayudar a caracterizar los períodos de metabolismo anaeróbico, como se observa con la hipoxia, la hipoperfusión, la isquemia-reperfusión o las perturbaciones metabólicas7.
El trabajo original de Langendorff permitió el estudio del corazón de mamífero ex vivo, utilizando gatos como tema principal5. La evaluación del corazón de rata aislado ganó popularidad a mediados de la década de 1900 con Howard Morgan, quien detalló el modelo de rata de "corazón de trabajo" en 19675. El uso de ratones comenzó hace solo 25 años debido a la complejidad técnica, la fragilidad del tejido y el tamaño relativamente pequeño del corazón murino. A pesar de los desafíos asociados con el estudio con ratones, los menores costos y la facilidad de la manipulación genética han aumentado el atractivo y la demanda de tales preparaciones murinas ex-vivo. Desafortunadamente, la aplicación de la técnica se ha limitado a animales adultos, siendo ratones juveniles de 4 semanas de edad los sujetos más jóvenes utilizados para el estudio ex vivo hasta hace muypoco 8,9. Si bien los ratones juveniles son "relativamente inmaduros" en comparación con los adultos, su utilidad como sujetos para los estudios de biología del desarrollo es limitada porque, en general, se han destetado de su presa de nacimiento y pronto comenzarán la pubertad10. La adolescencia ocurre mucho más allá de la transición postnatal en la utilización del sustrato miocárdico de glucosa y lactato a ácidos grasos11. Por lo tanto, la mayor parte de la información sobre los cambios metabólicos en el corazón neonatal ha resultado históricamente del trabajo ex vivo en especies más grandes como conejos y conejillos de indias11.
De hecho, existen enfoques alternativos a la preparación de Langendorff. Estos incluyen la experimentación in vitro, que carece de datos funcionales y contexto de todo el órgano, o estudios in vivo. Esto puede ser técnicamente desafiante y complicado al confundir variables como los efectos cardiovasculares y respiratorios de un agente anestésico requerido, la influencia de la entrada neurohumoral, las consecuencias de la temperatura central, el estado nutricional del animal y la disponibilidad de sustrato12,13. Debido a que el enfoque de Langendorff permite el estudio del corazón perfundido aislado de una manera ex-vivo de una manera más controlada en ausencia de tales factores de confusión, ha sido y sigue siendo considerado una poderosa herramienta de investigación. Por lo tanto, la técnica presentada aquí ofrece a los investigadores un enfoque experimental para el estudio ex vivo del corazón murino recién nacido y limita el tiempo de reperfusión.
Investigar el corazón durante los períodos de desarrollo es una consideración importante dadas las amplias transiciones bioquímicas, fisiológicas y anatómicas que ocurren durante la maduración del miocardio. Los cambios del metabolismo anaeróbico a la fosforilación oxidativa, los cambios en la utilización del sustrato y la progresión de la proliferación celular a la hipertrofia son procesos dinámicos que ocurren de manera única en el corazón inmaduro11,14. Otro aspecto crítico del corazón en desarrollo es que los factores estresantes que se encuentran durante los períodos necesarios pueden producir respuestas aumentadas en el corazón del recién nacido y alterar la susceptibilidad futura a los insultos en la edad adulta15. Aunque trabajos anteriores han utilizado ratas, corderos y conejos recién nacidos para estudiar el corazón neonatal perfundido por Langendorff, los avances que permiten el uso de ratones son necesarios dada la importancia de esta especie para la investigación de la biología del desarrollo16. Para abordar esta necesidad, recientemente se estableció el primer modelo de corazón neonatal murino perfundido por Langendorff utilizando animales de 10 díasde edad 6. Aquí se presenta un método para permitir la canulación aórtica exitosa y establecer la perfusión retrógrada del corazón murino recién nacido aislado. Este enfoque se puede utilizar para estudios de farmacología, isquemia-reperfusión o metabolismo centrados en la función de todo el órgano o se puede adaptar para el aislamiento de cardiomiocitos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rodent Langendorff Apparatus</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130102EZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 G catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>381511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G needle on 1 mL syringe combo</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G steel needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Silk Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Amp</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>FE135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLA1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating heating water Bath</td>
			<td>Haake</td>
			<td>DC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved iris scissor</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS10033Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>find spring scissors</td>
			<td>Kent</td>
			<td>INS600127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLT1030/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure tubing</td>
			<td>Edwards Lifesciences</td>
			<td>50P184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iris dressing forceps</td>
			<td>Kent</td>
			<td>INS650915-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jeweler-style curved fine forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>17-307-MLTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight dissecting scissors</td>
			<td>Kent</td>
			<td>INS600393-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temporary cardiac pacing wire</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>TPW30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Range Force Transducer</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLT1030/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified technique for the use of neonatal murine hearts in the langendorff preparation

El uso del corazón perfundido retrógrado ex vivo ha sido durante mucho tiempo una piedra angular de la investigación de la isquemia-reperfusión desde su desarrollo por Oskar Langendorff hace más de un siglo. Aunque esta técnica se ha aplicado a ratones en los últimos 25 años, su uso en esta especie se ha limitado a animales adultos. El desarrollo de un método exitoso para cannular consistentemente la aorta murina neonatal permitiría el estudio sistemático del corazón perfundido retrógrado aislado durante un período crítico de desarrollo cardíaco en una especie genéticamente modificable y de bajo costo. La modificación de la preparación de Langendorff permite la canulación y el establecimiento de la reperfusión en el corazón murino neonatal al tiempo que minimiza el tiempo isquémico. La optimización requiere una técnica de dos personas para permitir la canulación exitosa de la aorta de ratón recién nacido utilizando un microscopio de disección y una aguja modificada disponible comercialmente. El uso de este enfoque establecerá de manera confiable la perfusión retrógrada en 3 minutos. Debido a que la fragilidad del corazón del ratón neonatal y el tamaño de la cavidad ventricular impiden la medición directa de la presión intraventricular generada con un balón, es necesario el uso de un transductor de fuerza conectado por una sutura al ápice del ventrículo izquierdo para cuantificar la tensión contráctil longitudinal. Este método permite a los investigadores establecer con éxito una preparación aislada del corazón murino del recién nacido perfundido por flujo constante, lo que permite el estudio de la biología cardíaca del desarrollo de manera ex vivo . Es importante destacar que este modelo será una herramienta poderosa para investigar las respuestas fisiológicas y farmacológicas a la isquemia-reperfusión en el corazón neonatal.

Se utilizaron ratones P10 para modelar un punto de tiempo en la infancia humana26,27. Quince corazones de ratón recién nacidos C57Bl/6 aislados fueron cosechados y canulados con éxito. Los corazones fueron perfundidos con un flujo continuo de 2.5 mL min-1 de KHB oxigenado calentado. Se midieron los parámetros metabólicos, incluida la extracción de glucosa, el consumo de oxígeno, la producción de lactato y los parámetros fisiológicos como la f...

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Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation

El presente protocolo describe la canulación aórtica y la perfusión retrógrada del corazón murino neonatal ex vivo . Una estrategia de dos personas, utilizando un microscopio de disección y una aguja de calibre pequeño embotada, permite una canulación confiable. La cuantificación de la tensión contráctil longitudinal se logra utilizando un transductor de fuerza conectado al ápice del ventrículo izquierdo.

Técnica modificada para el uso de corazones murinos neonatales en la preparación de Langendorff

The use of the ex-vivo retrograde perfused heart has long been a cornerstone of ischemia-reperfusion investigation since its development by Oskar ...

Este enfoque establece de manera confiable la perfusión retrógrada del corazón de ratón neonatal ex vivo en menos de tres minutos. Reduciendo así la edad más joven posible de estudio de varias semanas a 10 días postnatales. Este modelo perfundido retrógrado aislado permite el estudio del corazón neonatal durante un período crítico de desarrollo cardíaco en una especie genéticamente modificable y de bajo costo.Mientras que este modelo se presta al estudio de las respuestas fisiológicas y farmacológicas a la isquemia-reperfusión en el corazón neonatal. También podría ser utilizado para el aislamiento de cardiomiocitos. Para fabricar la cánula aórtica de ratón recién nacido, use tijeras afiladas para cortar la punta y embotar el extremo de una aguja de acero inoxidable de calibre 26, teniendo cuidado de no engarzar o restringir el diámetro de la luz de la aguja.Luego alise el borde cortado para eliminar cualquier rebaba raspando suavemente el extremo embotado en la mesa de trabajo del laboratorio con un movimiento de ida y vuelta. A continuación, conecte la cánula fabricada al aparato de Langendorff y evalúe el flujo y la resistencia. Mida los caudales a través de la cánula recogiendo y midiendo la cantidad de tampón durante un intervalo de un minuto.Para cuantificar el diferencial de presión a través de la cánula mientras fluye el amortiguador Krebs-Heneseleit, mida la presión en el sistema con y sin la cánula conectada. A continuación, calcule la resistencia de la cánula utilizando la siguiente fórmula. A continuación, retire la cánula de calibre 26 del aparato de Langendorff y conecte un tubo de alta presión al sitio de canulación del aparato.A continuación, fije la cánula aórtica en el extremo distal del tubo y airee el tubo y la cánula con tampón oxigenado, asegurándose de que se eliminen todas las burbujas. Para prevenir la formación de microtrombis coronarios, administre una inyección intraperitoneal de heparina a un cachorro de ratón de 10 días de edad utilizando una aguja de calibre 26 en una jeringa de un mililitro. Deje que la heparina circule varios minutos antes de proceder con la inyección de cualquier anestésico.A continuación, coloque el ratón anestesiado en posición supina y asegure las extremidades inmediatamente después de la pérdida del conocimiento. Comience la cosecha tan pronto como el animal no responda al pellizco del dedo del pie, ya que el animal respira espontáneamente durante la disección inicial. Usando tijeras de disección rectas hacer una incisión subxifoidea transversal a través del ancho de los animales exponiendo la cavidad abdominal.Pídale a un asistente que agarre el proceso xifoideo con fórceps, luego corte la caja torácica bilateralmente a lo largo de la línea axilar media en dirección cefálica y refleje el esternón y las costillas cranealmente para exponer los órganos torácicos. Después de identificar el diafragma superiormente, incise la porción anterior por completo. Identificar la vena cava inferior infradiafragmática por encima del hígado y transectarla con una tijera curvada de Iris manteniendo un ligero interior en tensión cefálica en el segmento proximal con pinzas iris.Luego, corte posteriormente a lo largo de la superficie interior de la columna vertebral con tijeras curvas de Iris mientras tira de la vena cava inferior hacia arriba y fuera de la cavidad torácica. A medida que el corazón se moviliza, incline las tijeras hacia arriba y corte los grandes vasos de manera superior para eliminar completamente el corazón y los pulmones. Sumerja inmediatamente el espécimen en un tampón o solución salina Krebs-Henseleit helada.El corazón debe dejar de latir en cuestión de segundos. Coloque un trozo de toalla de papel en el fondo de una placa de Petri poco profunda para proporcionar fricción para estabilizar el corazón durante la canulación. Humedezca la toalla de papel con un tampón Krebs-Henseleit helado para evitar que el corazón se adhiera a ella.Coloque la placa de Petri preparada bajo el microscopio de disección y ajuste el foco. Ahora, coloque la cánula aórtica unida al tubo de extensión de alta presión bajo el microscopio de disección, junto con una sutura de seda 5-0 atada libremente alrededor de su cubo. Después de colocar los órganos torácicos extirpados en la placa de Petri, identifique el timo por su brillo blanco y dos lóbulos y oriente el espécimen de tal manera que el timo sea anterior y superior.A continuación, el uso de fórceps separa sin rodeos los lóbulos del timo exponiendo los grandes vasos. Luego identifique la aorta localizando las características ramificadas distintivas del arco aórtico y transecte solo proximal al despegue de la arteria subclavia utilizando tijeras finas y afiladas. Ahora agarre suavemente la aorta transectada con fórceps curvas finas estilo joyero y cannulate cuidadosamente la aorta con una aguja roma de calibre 26, teniendo cuidado de no dañar la válvula aórtica.Usando fórceps curvas finas, agarre la aorta alrededor de la cánula e inicie la perfusión retrógrada para limitar el tiempo isquémico. Pídale al asistente que agarre los extremos de la sutura poco atada y que enganche cuidadosamente la aorta alrededor de la cánula. Cinte la sutura por encima o por debajo de las finas pinzas curvas y luego apriete la sutura y confirme la adecuación del flujo coronario.Desconecte el tubo de alta presión del aparato de Langendorff, agarre el cubo de la cánula y desconecte la aguja roma del tubo de extensión de alta presión. Luego conecte rápidamente el centro de la cánula al aparato. Una vez que el corazón se cuelga en el aparato de Langendorff en la posición habitual, se confirma una perfusión adecuada.Recorte cuidadosamente el pulmón, el timo y el exceso de tejido. Luego incite la aurícula derecha para permitir que el efluente del seno coronario gotee libremente. Haga un pequeño nudo al final de una sutura de seda 5-0, luego perfore un pequeño trozo de película de parafina con la aguja y deslice la parafina hasta el extremo anudado.Pase cuidadosamente la aguja a través del ápice del ventrículo y tire de la sutura a través del corazón hasta que la película de parafina se ajuste contra la pared lateral del ventrículo. Pase la aguja a través de la abertura de la chaqueta de calentamiento llena de agua del aparato de Langendorff para que el corazón pueda encerrarse y calentarse. Luego conecte la aguja al transductor de fuerza evitando el goteo del seno coronario.Ajuste la sutura para aplicar de uno a dos gramos de tensión basal según lo indicado por la tensión diastólica o el rastreo de intención nadir. Luego coloque electrodos de superficie en los polos superior e inferior del corazón para registrar el electrocardiograma. Finalmente, muestree el efluente del seno coronario para su análisis utilizando un catéter intravenoso de calibre 24.Se utilizaron electrodos de superficie para registrar un electrocardiograma continuo, lo que permitió determinar la velocidad y el ritmo intrínsecos. Todos los corazones adecuadamente perfundidos laten espontáneamente en ritmo sinusal. Esta estrategia de perfusión satisfizo las necesidades metabólicas del corazón de ratón recién nacido, dada la insignificante producción de lactato y el bajo porcentaje de extracción de oxígeno y consumo de glucosa.También se registraron y calcularon las medias variables fisiológicas, como la frecuencia cardíaca intrínseca denervada media denervada y las presiones medias de perfusión aórtica observadas. Se deben considerar algunos criterios excluyentes, como el tiempo necesario para iniciar la reperfusión, la duración de la arritmia y la presión de perfusión aórtica, para garantizar la consistencia de la preparación neonatal. Después del establecimiento de la perfusión, pueden ocurrir intervenciones como la administración de fármacos, la inducción de la lesión por isquemia-reperfusión, las alteraciones de los metabolitos o la administración de agentes enzimáticos para el aislamiento de cardiomiocitos.

Research

JoVE Journal

Medicine

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

NADH fluorescencia de imágenes de biventricular aislada Trabajo corazones de conejo

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Investigación

Medicina

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Murino Cervical Trasplante Cardiaco Modelo Usando una técnica de Cuff Modificado

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Intramiocárdica celular de la entrega: Las observaciones en murinos Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Inducción y Evaluación de la isquemia-reperfusión en perfundidos Langendorff corazones de ratas

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como<em&gt; In Vitro</em&gt; Herramienta de detección en la investigación de la audición

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Manejo avanzado del ritmo cardíaco mediante la aplicación de fotoestimulación optogenética multisitio en corazones murinos

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

Creating Radio-cephalic Arteriovenous Fistula in the Forearm with a Modified No-Touch Technique

Creación de fístula arteriovenosa radiocefálica en el antebrazo con una técnica modificada sin contacto

Autologous arteriovenous fistula (AVF) is the primary and best option to obtain vascular access for hemodialysis treatment; other options are ...

A Modified Simple Method for Induction of Myocardial Infarction in Mice

Un método simple modificado para la inducción de infarto de miocardio en ratones

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI ...

Modified Posterior Vertebral Column Resection for Patients with Thoracolumbar Kyphotic Deformity

Resección modificada de la columna vertebral posterior para pacientes con deformidad cifótica toracolumbar

Old compression vertebrae fracture or congenital kyphoscoliosis with abnormal vertebral body development and other diseases that invade the spine may ...