Name: modified technique for the use of neonatal murine hearts in the langendorff preparation
Uploaded: 2022-03-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation at JoVE.com

NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)

Institutional Animal Care and Use Committee of Columbia University Medical Centers godkännanden erhölls för alla beskrivna metoder. Vildtyp C57Bl/6 hane postnatal dag 10 möss användes för studien.
1. Beredning av Langendorff-apparater
<ol><li>För att minimera komplexiteten, använd icke-recirkulerande syresatt perfusat i Langendorff-apparaten (se materialtabell) via konstant flöde eller konstant tryck.<ol>
<li>Använd Krebs-Henseleit-buffert...

<ol>
	<li>Bell, R., Mocanu, M., Yellon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+heart+perfusion:+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion.">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li><li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szel&#261;g, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff-still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+models:+Cardiovascular+system+studies+and+technological+advances.">Isolated heart models: Cardiovascular system studies and technological advances.</a> Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (7), 669-678 (2015).</li><li>D&#246;ring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+heart+according+to+Langendorff+technique--function--application.">The isolated perfused heart according to Langendorff technique--function--application.</a> Physiologia Bohemoslovaca. 39 (6), 481-504 (1990).</li><li>Liao, R., Podesser, B., Lim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+continuing+evolution+of+the+Langendorff+and+ejecting+murine+heart:+New+advances+in+cardiac+phenotyping.">The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: New advances in cardiac phenotyping.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).</li><li>Barajas, M., Yim, P., Gallos, G., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isolated+retrograde-perfused+newborn+mouse+heart+preparation.">An isolated retrograde-perfused newborn mouse heart preparation.</a> MethodsX. 7, 101058 (2020).</li><li>De Leiris, J., Harding, D., Pestre, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+rat+heart:+A+model+for+studying+myocardial+hypoxia+or+ischaemia.">The isolated perfused rat heart: A model for studying myocardial hypoxia or ischaemia.</a> Basic Research in Cardiology. 79 (3), 313-321 (1984).</li><li>Liaw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+shifts+in+ischemic+tolerance+and+cell+survival+signaling+in+murine+myocardium.">Postnatal shifts in ischemic tolerance and cell survival signaling in murine myocardium.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 305 (10), 1171-1181 (2013).</li><li>Chaudhary, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+soluble+epoxide+hydrolase+inhibition+and+CYP2J2+overexpression+on+postischemic+cardiac+function+in+aged+mice.">Differential effects of soluble epoxide hydrolase inhibition and CYP2J2 overexpression on postischemic cardiac function in aged mice.</a> Prostaglandins and Other Lipid Mediators. 104, 8-17 (2013).</li><li>Dutta, S., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Men+and+mice:+Relating+their+ages.">Men and mice: Relating their ages.</a> Life Sciences. 152, 244-248 (2016).</li><li>Onay-Besikci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+energy+metabolism+in+newborn.">Regulation of cardiac energy metabolism in newborn.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 287 (1), 1-11 (2006).</li><li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+Advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: Advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Kaese, S., Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+electrophysiology+in+mice:+A+matter+of+size.">Cardiac electrophysiology in mice: A matter of size.</a> Frontiers in Physiology. 3 (345), 00345 (2012).</li><li>Tan, C., Lewandowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transitional+heart:+From+early+embryonic+and+fetal+development+to+neonatal+life.">The transitional heart: From early embryonic and fetal development to neonatal life.</a> Fetal Diagnosis and Therapy. 47 (5), 373-386 (2020).</li><li>Zhang, P., Lv, J., Li, Y., Zhang, L., Xiao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+lipopolysaccharide+exposure+gender-dependently+increases+heart+susceptibility+to+ischemia/reperfusion+injury+in+male+rats.">Neonatal lipopolysaccharide exposure gender-dependently increases heart susceptibility to ischemia/reperfusion injury in male rats.</a> International Journal of Medical Sciences. 14 (11), 1163 (2017).</li><li>Ziyatdinova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+If+Current+Blockade+on+Newborn+Rat+Heart+Isolated+According+to+Langendorff.">Effect of If Current Blockade on Newborn Rat Heart Isolated According to Langendorff.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 167 (4), 424-427 (2019).</li><li>Teng, B., Tilley, S., Ledent, C., Mustafa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+coronary+flow+and+cardiac+function+after+bolus+adenosine+injection+in+adenosine+receptor+knockout+mice.">In vivo assessment of coronary flow and cardiac function after bolus adenosine injection in adenosine receptor knockout mice.</a> Physiological reports. 4 (11), 12818 (2016).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+cardiomyopathy+in+mice+lacking+transferrin+receptor+in+the+heart.">Lethal cardiomyopathy in mice lacking transferrin receptor in the heart.</a> Cell Reports. 13 (3), 533-545 (2015).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+care,+Part+I:+Anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: Anesthetic considerations in preclinical research.</a> Institute for Laboratory Animal Research. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+care,+Part+I:+Anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: Anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR Journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Bl&#252;mel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+with+various+anesthetics+in+mice+(pentobarbitone,+ketamine-xylazine,+carfentanyl-etomidate).">A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone, ketamine-xylazine, carfentanyl-etomidate).</a> Research in Experimental Medicine. 184 (3), 159-169 (1984).</li><li>Janssen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+anesthetics+on+systemic+hemodynamics+in+mice.">Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).</li><li>Zuurbier, C., Koeman, A., Houten, S., Hollmann, M., Florijn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+anesthetic+regimen+for+surgery+in+mice+through+minimization+of+hemodynamic,+metabolic,+and+inflammatory+perturbations.">Optimizing anesthetic regimen for surgery in mice through minimization of hemodynamic, metabolic, and inflammatory perturbations.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (6), 737-746 (2014).</li><li>Hard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymectomy+in+the+neonatal+rat.">Thymectomy in the neonatal rat.</a> Laboratory Animals. 9 (2), 105-110 (1975).</li><li>Sun, Z., Ambrosi, E., Bricalli, A., Ielmini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Logic+computing+with+stateful+neural+networks+of+resistive+switches.">Logic computing with stateful neural networks of resistive switches.</a> Advanced Materials. 30 (38), 1802554 (2018).</li><li>Clancy, B., Finlay, B., Darlington, R., Anand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrapolating+brain+development+from+experimental+species+to+humans.">Extrapolating brain development from experimental species to humans.</a> Neurotoxicology. 28 (5), 931-937 (2007).</li><li>Hornig, M., Chian, D., Lipkin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+effects+of+postnatal+thimerosal+are+mouse+strain+dependent.">Neurotoxic effects of postnatal thimerosal are mouse strain dependent.</a> Molecular Psychiatry. 9 (9), 833-845 (2004).</li><li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchungen+am+&#252;berlebenden+S&#228;ugethierherzen.">Untersuchungen am &#252;berlebenden S&#228;ugethierherzen.</a> Archiv f&#252;r die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 61 (6), 291-332 (1895).</li><li>Edlund, A., Wennmalm, &. #. 1. 9. 7. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+in+rabbit+Langendorff+hearts+perfused+with+a+saline+medium.">Oxygen consumption in rabbit Langendorff hearts perfused with a saline medium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 113 (1), 117-122 (1981).</li><li>Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Wengrowski, A., Kay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+demand+of+perfused+heart+preparations:+How+electromechanical+function+and+inadequate+oxygenation+affect+physiology+and+optical+measurements.">Oxygen demand of perfused heart preparations: How electromechanical function and inadequate oxygenation affect physiology and optical measurements.</a> Experimental Physiology. 100 (6), 603-616 (2015).</li><li>Wiesmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+of+cardiac+function+and+mass+assessed+with+MRI+in+neonatal,+juvenile,+and+adult+mice.">Developmental changes of cardiac function and mass assessed with MRI in neonatal, juvenile, and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 278 (2), 652-657 (2000).</li><li>Le, V., Kovacs, A., Wagenseil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+left+ventricular+pressure+in+late+embryonic+and+neonatal+mice.">Measuring left ventricular pressure in late embryonic and neonatal mice.</a> Journal of visualized experiments. (60), e3756 (2012).</li><li>Bednarczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+dynamic+assessment+of+fluid+responsiveness+into+goal-directed+therapy:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Incorporating dynamic assessment of fluid responsiveness into goal-directed therapy: A systematic review and meta-analysis.</a> Critical Care Medicine. 45 (9), 1538 (2017).</li><li>Louch, W., Sheehan, K., Wolska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li><li>Ackers-Johnson, M., Foo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langendorff-free+isolation+and+propagation+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Langendorff-free isolation and propagation of adult mouse cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 193-204 (2019).</li><li>Peng, Y., Buller, C., Charpie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+N-acetylcysteine+on+neonatal+cardiomyocyte+ischemia-reperfusion+injury.">Impact of N-acetylcysteine on neonatal cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury.</a> Pediatric Research. 70 (1), 61-66 (2011).</li><li>Jarmakani, J., Nakazawa, M., Nagatomo, T., Langer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hypoxia+on+mechanical+function+in+the+neonatal+mammalian+heart.">Effect of hypoxia on mechanical function in the neonatal mammalian heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 235 (5), 469-474 (1978).</li><li>Podesser, B., Hausleithner, V., Wollenek, G., Seitelberger, R., Wolner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langendorff+and+ischemia+in+immature+and+neonatal+myocardia:+Two+essential+key-words+in+Today's+cardiothoracic+research.">Langendorff and ischemia in immature and neonatal myocardia: Two essential key-words in Today's cardiothoracic research.</a> Acta Chirurgica Austriaca. 25 (6), 434-437 (1993).</li><li>Popescu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+an+early+start+in+understanding+perinatal+asphyxia+impact+on+the+cardiovascular+system.">Getting an early start in understanding perinatal asphyxia impact on the cardiovascular system.</a> Frontiers in Pediatrics. 8, 68 (2020).</li></ol>

Det aktuella arbetet beskriver framgångsrik aortakannulering och retrograd perfusion i det isolerade nyfödda mushjärtat. Det är viktigt att det gör det möjligt för forskare att övervinna de hinder som ung murin ålder och liten hjärtstorlek tidigare presenterat8. Även om det inte är komplicerat i design, kräver tillvägagångssättet en betydande grad av teknisk skicklighet. Viktiga steg som oundvikligen kommer att utmana även de mest tekniskt skickliga utredarna kommer att vara cannu...

Ex-vivo hjärtpreparat har varit en häftklammer i fysiologiska, patofysiologiska och farmakologiska studier i över ett sekel. Oskar Langendorff härrörde från Elias Cyons arbete på 1860-talet och anpassade den isolerade grodmodellen för retrograd perfusion och trycksatte aortaroten för att ge kranskärlsflöde med ett syresatt perfusat1. Med hjälp av sin anpassning kunde Langendorff visa en korrelation mellan koronarcirkulation och mekanisk funktion2. Det ex-vivo retrograda perfuserade hjärtat, senare eponymously kallat Langendorff-tekniken, har förblivit en hörnsten i fysiologisk undersökning och utnyttjat sin enkelhet för att kraftfullt studera det isolerade hjärtat i frånvaro av potentiella confounders. Langendorffpreparatet har modifierats ytterligare för att låta hjärtat spruta ut (det så kallade "arbetshjärtat") och låta perfusatet återcirkulera3. De primära fysiologiska effektmåtten av intresse har dock varit oförändrade. Sådana slutpunkter inkluderar mått på kontraktil funktion, elektrisk ledning, hjärtmetabolism och koronarresistens4.
För att utvärdera hjärtfunktionen i sitt ursprungliga grodhjärtpreparat mätte Langendorff spänningen som genererades av ventrikulär sammandragning i längdaxeln med hjälp av en sutur kopplad mellan hjärtats topp och en kraftgivare. 5 Isometrisk sammandragning kvantifierades på detta sätt med basal spänning applicerad på hjärtat i frånvaro av ventrikulär fyllning. Förfining av tillvägagångssättet har lett till vätskefyllda ballonger placerade i vänster kammare via vänster förmak för att utvärdera myokardiell prestanda under isovolumisk sammandragning6. För att bedöma hjärtrytmen och hjärtfrekvensen kan ytledningar placeras på hjärtats poler för att göra det möjligt för utredare att registrera elektrokardiogrammet. Relativ bradykardi kan dock förväntas, med tanke på den obligatoriska denervationen. Extrinsisk pacing kan tjäna till att övervinna detta och eliminera hjärtfrekvensvariationen mellan experiment1. Ett annat utfallsmått, myokardiell metabolism, kan bedömas genom att mäta syre- och metabolisk substrathalt i koronarperfusat och avloppsvatten och beräkna skillnaden mellan dem7. Laktatkvantifiering i koronaravloppsvattnet kan hjälpa till att karakterisera perioder av anaerob metabolism som ses med hypoxi, hypoperfusion, ischemi-reperfusion eller metaboliska störningar7.
Langendorffs ursprungliga arbete möjliggjorde studier av däggdjurshjärtat ex-vivo, med katter som det primära ämnet5. Utvärdering av det isolerade råtthjärtat blev populärt i mitten av 1900-talet hos Howard Morgan, som redogjorde för råttmodellen "arbetshjärta" 19675. Användningen av möss började för bara 25 år sedan på grund av den tekniska komplexiteten, vävnadsbräckligheten och relativt liten murin hjärtstorlek. Trots de utmaningar som är förknippade med mössstudier har de lägre kostnaderna och lättheten för genetisk manipulation ökat överklagandet och efterfrågan på sådana murina ex vivo-preparat. Tyvärr har tillämpningen av tekniken begränsats till vuxna djur, med juvenila 4 veckor gamla möss som de yngsta försökspersonerna som användes för ex-vivo-studier fram till ganska nyligen 8,9. Medan juvenila möss är "relativt omogna" jämfört med vuxna, är deras användbarhet som ämnen för utvecklingsbiologiska studier begränsad eftersom de i stort sett har avvänt från sin födelsedamm och snart kommer att börja puberteten10. Tonåren sker långt bortom den postnatala övergången i myokardiellt substratutnyttjande från glukos och laktat till fettsyror11. Således har den mesta informationen om de metaboliska förändringarna i neonatalhjärtat historiskt resulterat från ex-vivo-arbete hos större arter som kaniner och marsvin11.
Det finns faktiskt alternativa tillvägagångssätt för Langendorff-preparatet. Dessa inkluderar in vitro-experiment, som saknar hela organets funktionella data och sammanhang, eller in vivo-studier. Detta kan vara tekniskt utmanande och komplicerat av förvirrande variabler som kardiovaskulära och respiratoriska effekter av ett nödvändigt bedövningsmedel, påverkan av neurohumoral input, konsekvenserna av kärntemperatur, djurets näringsstatus och substrattillgänglighet12,13. Eftersom Langendorff-metoden tillåter studier av det isolerade perfuserade hjärtat på ett ex-vivo-sätt på ett mer kontrollerat sätt i avsaknad av sådana confounders, har det varit och fortsätter att betraktas som ett kraftfullt undersökningsverktyg. Därför ger tekniken som presenteras här forskare ett experimentellt tillvägagångssätt för ex-vivo-studien av det nyfödda murina hjärtat och begränsar tiden till reperfusion.
Att undersöka hjärtat under utvecklingsperioder är ett viktigt övervägande med tanke på de omfattande biokemiska, fysiologiska och anatomiska övergångar som uppstår under myokardiell mognad. Skiften från anaerob metabolism till oxidativ fosforylering, förändringar i substratutnyttjande och progression från cellproliferation till hypertrofi är dynamiska processer som unikt förekommer i det omogna hjärtat11,14. En annan kritisk aspekt av det utvecklande hjärtat är att stressfaktorer som uppstår under nödvändiga perioder kan ge ökade svar i det nyfödda hjärtat och förändra framtida mottaglighet för förolämpningar i vuxen ålder15. Även om tidigare arbete har använt nyfödda råttor, lamm och kaniner för att studera Det Langendorff-perfuserade neonatala hjärtat, är framsteg som tillåter mössanvändning nödvändiga med tanke på denna arts betydelse för utvecklingsbiologisk forskning16. För att tillgodose detta behov etablerades nyligen den första murina Langendorff-perfuserade nyfödda hjärtmodellen med 10 dagar gamla djur6. Här presenteras en metod för att möjliggöra framgångsrik aortakannulering och etablera retrograd perfusion av det isolerade nyfödda murina hjärtat. Detta tillvägagångssätt kan användas för farmakologi, ischemi-reperfusion eller metabolismstudier med fokus på hela organfunktionen eller kan anpassas för isolering av kardiomyocyter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rodent Langendorff Apparatus</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130102EZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 G catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>381511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G needle on 1 mL syringe combo</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G steel needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Silk Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Amp</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>FE135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLA1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating heating water Bath</td>
			<td>Haake</td>
			<td>DC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved iris scissor</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS10033Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>find spring scissors</td>
			<td>Kent</td>
			<td>INS600127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLT1030/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure tubing</td>
			<td>Edwards Lifesciences</td>
			<td>50P184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iris dressing forceps</td>
			<td>Kent</td>
			<td>INS650915-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jeweler-style curved fine forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>17-307-MLTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight dissecting scissors</td>
			<td>Kent</td>
			<td>INS600393-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temporary cardiac pacing wire</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>TPW30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Range Force Transducer</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLT1030/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified technique for the use of neonatal murine hearts in the langendorff preparation

Användningen av det ex-vivo retrograda perfuserade hjärtat har länge varit en hörnsten i ischemi-reperfusionsutredning sedan dess utveckling av Oskar Langendorff för över ett sekel sedan. Även om denna teknik har tillämpats på möss under de senaste 25 åren, har dess användning i denna art varit begränsad till vuxna djur. Utveckling av en framgångsrik metod för att konsekvent kannulera den neonatala murina aortan skulle möjliggöra en systematisk studie av det isolerade retrograda perfuserade hjärtat under en kritisk period av hjärtutveckling i en genetiskt modifierbar och billig art. Modifiering av Langendorff-preparatet möjliggör kannulering och etablering av reperfusion i det neonatala murina hjärtat samtidigt som ischemisk tid minimeras. Optimering kräver en teknik med två personer för att möjliggöra framgångsrik kannulering av den nyfödda musaortan med hjälp av ett dissekerande mikroskop och en modifierad kommersiellt tillgänglig nål. Användningen av detta tillvägagångssätt kommer på ett tillförlitligt sätt att fastställa retrograd perfusion inom 3 minuter. Eftersom bräckligheten hos det neonatala mushjärtat och ventrikelhålans storlek förhindrar direkt mätning av intraventrikulärt tryck som genereras med hjälp av en ballong, är användning av en kraftgivare ansluten med en sutur till toppen av vänster ventrikel för att kvantifiera längsgående kontraktil spänning nödvändig. Denna metod gör det möjligt för utredare att framgångsrikt etablera ett isolerat retrogradt perfuserat nyfött murinhjärtpreparat med konstant flöde, vilket möjliggör studier av utvecklings hjärtbiologi på ett ex-vivo-sätt . Viktigt är att denna modell kommer att vara ett kraftfullt verktyg för att undersöka de fysiologiska och farmakologiska svaren på ischemi-reperfusion i neonatalhjärtat.

P10-möss användes för att modellera en tidpunkt i människans spädbarn26,27. Femton isolerade C57Bl/6 nyfödda mushjärtan skördades och kannulerades framgångsrikt. Hjärtan perfuserades med ett kontinuerligt flöde på 2,5 ml min-1 av uppvärmd syresatt KHB. Metaboliska parametrar, inklusive glukosextraktion, syreförbrukning, laktatproduktion och fysiologiska parametrar som hjärtfrekvens, perfusionstryck och koronarresistens, mättes. Ytelektr...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation at JoVE.com

Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation

Det nuvarande protokollet beskriver aortakannulering och retrograd perfusion av ex-vivo neonatal murinhjärta. En tvåpersonsstrategi, med hjälp av ett dissekerande mikroskop och en trubbig liten mätnål, möjliggör tillförlitlig kannulering. Kvantifiering av längsgående kontraktil spänning uppnås med hjälp av en kraftgivare ansluten till toppen av vänster ventrikel.

Modifierad teknik för användning av neonatala murina hjärtan i Langendorff-preparatet

The use of the ex-vivo retrograde perfused heart has long been a cornerstone of ischemia-reperfusion investigation since its development by Oskar ...

Detta tillvägagångssätt etablerar på ett tillförlitligt sätt retrograd perfusion av det neonatala ex vivo-mushjärtat på under tre minuter. Således minskar den yngsta möjliga studieåldern från flera veckor till 10 postnatala dagar. Denna isolerade retrograda perfuserade modell möjliggör studier av det neonatala hjärtat under en kritisk period av hjärtutveckling i en genetiskt modifierbar och billig art.Medan denna modell lämpar sig för studier av fysiologiska och farmakologiska svar på ischemi-reperfusion i neonatalhjärtat. Det kan också användas för kardiomyocytisolering. För att tillverka den nyfödda musens aortakanyl använd en skarp sax för att skära av spetsen och trubba av änden på en 26 gauge rostfri nål, var noga med att inte krympa eller begränsa nållumenets diameter.Jämna sedan ut skärkanten för att ta bort eventuella grader genom att försiktigt skrapa den trubbiga änden på laboratoriebänkskivan med en fram och tillbaka-rörelse. Fäst sedan den tillverkade kanylen på Langendorff-apparaten och bedöma flöde och motstånd. Mät flödeshastigheter genom kanylen genom att samla upp och mäta buffertmängden under ett minuts intervall.För att kvantifiera tryckskillnaden över kanylen medan Krebs-Heneseleit-bufferten flyter, mät trycket i systemet med och utan kanylen fäst. Beräkna sedan kanylmotståndet med följande formel. Ta sedan bort den 26 gauge kanylen från Langendorff-apparaten och fäst en högtrycksslang på kannuleringsstället på apparaten.Fäst sedan aortakanylen i den distala änden av slangen och lufta slangen och kanylen med syresatt buffert, så att alla bubblor tas bort. För att förhindra bildandet av koronar mikrotrombi, administrera en intraperitoneal injektion av heparin till en 10 dagar gammal musvalp med en 26 gauge nål på en en milliliter spruta. Låt flera minuter för heparinet cirkulera innan du fortsätter med injektionen av något bedövningsmedel.Placera sedan den bedövade musen i ryggläge och säkra lemmar omedelbart vid medvetslöshet. Börja skörda så snart djuret inte svarar på tånypning när djuret andas spontant under den första dissektionen. Med hjälp av rak dissekerande sax gör du ett tvärgående subxiphoid snitt över djurens bredd som exponerar bukhålan.Be en assistent att förstå xiphoidprocessen med pincett, skär sedan bröstkorgen bilateralt längs den mellersta axillära linjen i cephaladriktning och reflektera bröstbenet och revbenen kranialt för att exponera bröstorganen. Efter att ha identifierat membranet överlägset, snitta den främre delen helt. Identifiera den infradiafragmatiska underlägsna vena cava ovanför levern och transektera den med en krökt Iris sax samtidigt som den bibehåller lätt inre i cephaladspänningen på det proximala segmentet med Iris-pincett.Skär sedan bakre längs ryggradens inre yta med böjd Iris sax medan du drar den underlägsna vena cava upp och ut ur brösthålan. När hjärtat mobiliseras, vinkla saxen framåt och skär de stora kärlen överlägset för att helt ta bort hjärtat och lungorna. Sänk omedelbart provet i iskall Krebs-Henseleit-buffert eller saltlösning.Hjärtat ska sluta slå inom några sekunder. Placera en bit pappershandduk i botten av en grund petriskål för att ge friktion för att stabilisera hjärtat under kannulering. Fukta pappershandduken med iskall Krebs-Henseleit-buffert för att förhindra att hjärtat fäster vid det.Placera den beredda petriskålen under dissekeringsmikroskopet och justera fokus. Placera nu aortakanylen fäst vid högtrycksförlängningsslangen under dissekeringsmikroskopet, tillsammans med en 5-0 silkesutur löst bunden runt navet. Efter att ha placerat de utskurna bröstorganen i petriskålen, identifiera tymusen med sin vita glans och två lober och orientera provet så att tymus är främre och överlägsen.Därefter separerar du tången trubbigt tymusens lober som exponerar de stora kärlen. Identifiera sedan aortan genom att lokalisera särskiljande förgreningsegenskaper hos aortabågen och transektera den bara proximal till den subklaviska artärstarten med hjälp av fina vassa saxar. Ta nu försiktigt tag i den transekterade aortan med hjälp av fina böjda pincett i juvelerarstil och kannera försiktigt aortan med en 26 gauge trubbig nål, var noga med att inte skada aortaklaffen.Använd fina böjda pincett, ta tag i aortan runt kanylen och initiera retrograd perfusion för att begränsa den ischemiska tiden. Be assistenten att ta tag i ändarna på den löst bundna suturen och försiktigt snärja aortan runt kanylen. Cinch suturen över eller under de fina krökta tångarna dra sedan åt suturen och bekräfta tillräckligheten av koronarflödet.Koppla bort högtrycksslangen från Langendorff-apparaten, ta tag i kanylens nav och koppla bort den trubbiga nålen från högtrycksförlängningsslangen. Fäst sedan snabbt kanylens nav på apparaten. När hjärtat hängs på Langendorff-apparaten i vanligt läge bekräftas en adekvat perfusion.Klipp försiktigt av lungan, tymus och överflödig vävnad. Skär sedan det högra förmaket så att koronar sinusavlopp kan droppa fritt. Gör en liten knut i slutet av en 5-0 silkesutur, genomborra sedan en liten bit paraffinfilm med nålen och skjut paraffinet till den knutna änden.För försiktigt nålen genom ventrikelns topp och dra suturen genom hjärtat tills paraffinfilmen sitter tätt mot ventrikelns sidovägg. För nålen genom öppningen av Langendorffapparatens vattenfyllda värmemantel så att hjärtat kan inneslutas och värmas. Fäst sedan nålen på kraftgivaren och undvik koronar sinusdropp.Justera suturen för att applicera ett till två gram basal spänning som indikeras av den diastoliska spänningen eller nadir avsiktsspårningen. Placera sedan ytelektroder på hjärtans överlägsna och underlägsna poler för att registrera elektrokardiogrammet. Slutligen provta koronar sinusavloppsvattnet för analys med en 24 gauge intravenös kateter.Ytelektroder användes för att registrera ett kontinuerligt elektrokardiogram, vilket möjliggjorde bestämning av inneboende hastighet och rytm. Alla tillräckligt perfuserade hjärtan slår spontant i sinusrytm. Denna perfusionsstrategi uppfyllde de metaboliska behoven hos det nyfödda mushjärtat, med tanke på den försumbara laktatproduktionen och lågprocentig syreutvinning och glukosförbrukning.Fysiologiska variabelmedel, som den genomsnittliga denerverade inneboende hjärtfrekvensen och det genomsnittliga observerade aortaperfusionstrycket, registrerades och beräknades också. Vissa exkluderande kriterier såsom den tid som krävs för att initiera reperfusion, arytmi varaktighet och aortaperfusionstryck måste beaktas för att säkerställa konsistens av det neonatala preparatet. Efter etablering av perfusion kan intervention såsom läkemedelsleverans, induktion av ischemi-reperfusionsskada, förändringar av metaboliter eller leverans av enzymatiska medel för kardiomyocytisolering förekomma.

Research

JoVE Journal

Medicine

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

NADH Fluorescens avbildning av isolerade biventrikulär Arbeta kaninhjärtan

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Murina Cervical Heart Transplantation Modell hjälp av en modifierad Cuff Technique

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Intramyocardial Cell Leverans: Observationer i Murina Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion och Bedömning av ischemi-reperfusion skada i Langendorff-perfusion Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Optokardiografi och elektrofysiologi studier av ex vivo Langendorff-parfymera hjärtan

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Avancerad hjärtrytmhantering genom att tillämpa optogenetisk fotostimulering på flera platser i murina hjärtan

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

Creating Radio-cephalic Arteriovenous Fistula in the Forearm with a Modified No-Touch Technique

Skapa radiocefalisk arteriovenös fistel i underarmen med en modifierad beröringsfri teknik

Autologous arteriovenous fistula (AVF) is the primary and best option to obtain vascular access for hemodialysis treatment; other options are ...

A Modified Simple Method for Induction of Myocardial Infarction in Mice

En modifierad enkel metod för induktion av hjärtinfarkt hos möss

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI ...

Modified Posterior Vertebral Column Resection for Patients with Thoracolumbar Kyphotic Deformity

Modifierad bakre ryggradsresektion för patienter med thoracolumbal kyphotic deformitet

Old compression vertebrae fracture or congenital kyphoscoliosis with abnormal vertebral body development and other diseases that invade the spine may ...