Name: therapeutic evaluation of fecal microbiota transplantation in an interleukin 10-deficient mouse model
Uploaded: 2022-04-06T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado, en parte, por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01 HL152683 y R21 AI126097 a Q. Li) y por American Heart Association Grant-in-Aid 17GRNT33460395 (a Q. Li) (heart.org).

Todos los procedimientos realizados en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Rama Médica de la Universidad de Texas en Galveston (Protocolo # 1512071A).
1. Recogida de pellets fecales frescos
<ol><li>Prepare toallas de papel estériles, pinzas romas y tubos cónicos de 50 ml.<ol><li>Coloque algunas toallas de papel y fórceps en bolsas de autoclave separadas y autoclave a 180 °C a fuego seco durante 30 min. Use tubos cón...

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	<li>D'Argenio, V., Salvatore, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+gut+microbiome+in+the+healthy+adult+status.">The role of the gut microbiome in the healthy adult status.</a> Clinica Chimica Acta. 451, 97-102 (2015).</li><li>Baquero, F., Nombela, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+as+a+human+organ.">The microbiome as a human organ.</a> Clinical Microbiology and Infection. 18, 2-4 (2012).</li><li>Hawrelak, J. A., Myers, S. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+tumorigenesis+in+the+Apc(min)+mouse:+down-regulation+of+beta-catenin+signaling+by+a+combination+of+tea+plus+sulindac.">Suppression of tumorigenesis in the Apc(min) mouse: down-regulation of beta-catenin signaling by a combination of tea plus sulindac.</a> Carcinogenesis. 24 (2), 263-267 (2003).</li><li>Kline, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+injury+increases+gut+permeability+by+epigenetically+suppressing+E-Cadherin+in+adulthood.">Neonatal injury increases gut permeability by epigenetically suppressing E-Cadherin in adulthood.</a> The Journal of Immunology. 204 (4), 980-989 (2020).</li><li>DeGruttola, A. 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S., Khanna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+of+fecal+microbiota+transplantation+for+recurrent+clostridioides+difficile+infection.">Long-term safety of fecal microbiota transplantation for recurrent clostridioides difficile infection.</a> Gastroenterology. 160 (6), 1961-1969 (2021).</li><li>Perler, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+efficacy+and+safety+of+fecal+microbiota+transplantation+for+treatment+of+recurrent+clostridioides+difficile+infection.">Long-term efficacy and safety of fecal microbiota transplantation for treatment of recurrent clostridioides difficile infection.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 54 (8), 701-706 (2020).</li><li>Safety alert regarding use of fecal microbiota for transplantation and risk of serious adverse events likely due to transmission of pathogenic organisms. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/safety-availability-biologics/safety-alert-regarding-use-fecal-microbiota-tramsplantation-and-risk-serious-adverse-events-likely">https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/safety-availability-biologics/safety-alert-regarding-use-fecal-microbiota-tramsplantation-and-risk-serious-adverse-events-likely</a> (2020)</li></ol>

Como tratamiento innovador en investigación, el TMF se ha convertido en un tema candente en el tratamiento de diversos trastornos en los últimos años, ya que la disbiosis de la microbiota comensal está implicada en la patogénesis de múltiples enfermedades humanas, incluyendo EII, obesidad, diabetes mellitus, autismo, enfermedades cardíacas y cáncer26. Aunque el mecanismo no se ha determinado, se cree que el FMT funciona construyendo una nueva flora biológica y evitando la pérdida de bact...

El microecosistema intestinal humano es extremadamente complejo, con más de 1000 especies de bacterias en el intestino de una persona sana1. La flora intestinal está involucrada en el mantenimiento de las funciones fisiológicas normales del intestino y la respuesta inmune y tiene una relación inseparable con el cuerpo humano. La evidencia acumulada sugiere que el microbioma intestinal constituye el último órgano humano, que es parte del cuerpo humano, no solo un grupo de parásitos2. Una relación simbiótica "saludable" entre la microbiota intestinal, sus metabolitos y el sistema inmune del huésped establecida en la vida temprana es fundamental para mantener la homeostasis intestinal. En algunas condiciones anormales, como la inflamación crónica, los cambios en el entorno interno y externo del cuerpo alteran seriamente la homeostasis intestinal, lo que resulta en un desequilibrio persistente de la comunidad microbiana del intestino, llamado disbiosis3. De hecho, la exposición a múltiples factores ambientales, incluida la dieta, los medicamentos y los patógenos, puede provocar cambios en la microbiota.
La disbiosis se asocia con la patogénesis de una variedad de enfermedades intestinales, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), el síndrome del intestino irritable (SII) y la enteritis pseudomembranosa, así como una creciente lista de trastornos extraintestinales, incluyendo enfermedades cardiovasculares, obesidad y alergia4. El perfil de la microbiota reveló que los pacientes con EII tienen una disminución dramática de la diversidad bacteriana, así como alteraciones marcadas en las poblaciones de algunas cepas bacterianas específicas 5,6. Estos estudios demostraron menos Lachnospiraceae y Bacteroidetes pero más Proteobacteria y Actinobacteria en pacientes con EII. Se cree que la patogénesis de la EII está relacionada con diversos factores patogénicos, incluyendo flora intestinal anormal, respuesta inmune desregulada, desafíos ambientales y variantes genéticas7. Abundante evidencia sugiere que las bacterias intestinales desempeñan un papel en las fases de inicio y aplicación de la EII8,9, lo que indica que la corrección de la disbiosis intestinal puede representar un enfoque novedoso para la terapia y / o el tratamiento de mantenimiento de la EII.
El prototipo del trasplante de microbiota fecal (TMF) comenzó en la antigua China10. En 1958, el Dr. Eiseman y sus colegas trataron con éxito cuatro casos de enteritis pseudomembranosa severa con materia fecal de donantes sanos a través de enema, abriendo un nuevo capítulo en la medicina occidental moderna utilizando heces humanas para tratar enfermedades humanas11. Se ha encontrado que la infección por Clostridium difficile (ICD) es la principal causa de enteritis pseudomembranosa12 y FMT es altamente efectiva en el tratamiento de la ICD. En los últimos ocho años, el TMF se ha convertido en una terapia estándar para el tratamiento de la ICDrecurrente 13, lo que ha dado lugar a nuevos estudios que investigan el papel del TMF en otros trastornos, como la EII. En los últimos veinte años, numerosos informes de casos y estudios de cohortes han documentado el uso de FMT en pacientes con EII14. Un metanálisis, que incluyó 12 ensayos, mostró que el 62% de los pacientes con enfermedad de Crohn (EC) lograron la remisión clínica después del TMF, y el 69% de los pacientes con EC tuvieron respuesta clínica15. A pesar de estos hallazgos alentadores, el papel del TMF en el tratamiento de la EII sigue siendo incierto, y los mecanismos por los cuales el TMF mejora la inflamación intestinal son poco conocidos. Se necesita más investigación antes de que el TMF pueda unirse al arsenal actual de opciones de tratamiento para la EII en las clínicas.
En este protocolo, aplicamos FMT en ratones IL-10-/-, que desarrollan colitis espontáneamente después del destete y han servido como un estándar de oro para reflejar la naturaleza multifactorial de la EII16,17,18. Los ratones IL-10−/− se han utilizado ampliamente para diseccionar la etiología de la EII porque presentan características moleculares e histológicas similares a las de los pacientes con EII y, al igual que los pacientes, la enfermedad puede mejorarse con terapia anti-TNFα16. Los ratones IL10−/− envejecidos (>9 meses de edad) tienen un mayor tamaño cardíaco y una función cardíaca deteriorada en comparación con los ratones de tipo salvaje de la misma edad19, lo que lo convierte en un excelente modelo para estudiar las enfermedades cardíacas inducidas por colitis. Sin embargo, también se pueden usar otros modelos murinos de colitis, como el modelo de sulfato de sodio de dextrano y el modelo de colitis inducida por células T. Administramos suspensión fecal por sonda oral, que demostró ser una ruta efectiva y mejor que el enema en humanos20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Syringe, 1 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end forceps</td>
			<td>Knipex</td>
			<td>926443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain natriuretic peptide EIA kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RAB0386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved feeding Needles</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>FNC-20-1.5-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLH-115 homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>GLH-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10 knockout mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>004366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Critical care</td>
			<td>NDC66794-017-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP normal saline</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer</td>
			<td>Euthanex Corp.</td>
			<td>EZ-108SA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

therapeutic evaluation of fecal microbiota transplantation in an interleukin 10-deficient mouse model

Con el desarrollo de la microecología en los últimos años, la relación entre las bacterias intestinales y la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) ha atraído una atención considerable. La evidencia acumulada sugiere que la microbiota disbiótica desempeña un papel activo en el desencadenamiento o empeoramiento del proceso inflamatorio en la EII y que el trasplante de microbiota fecal (TMF) es una estrategia terapéutica atractiva, ya que la transferencia de una microbiota sana al paciente con EII podría restaurar la comunicación adecuada entre el huésped y la microbiota. Sin embargo, los mecanismos moleculares no están claros, y la eficacia del TMF no ha sido muy bien establecida. Por lo tanto, se necesitan más estudios en modelos animales de EII. En este método, aplicamos FMT de ratones C57BL / 6J de tipo salvaje a ratones deficientes en IL-10, un modelo de ratón de colitis ampliamente utilizado. El estudio elabora la recolección de gránulos fecales de los ratones donantes, la fabricación de la solución / suspensión fecal, la administración de la solución fecal y el monitoreo de la enfermedad. Encontramos que el FMT mitigó significativamente el deterioro cardíaco en ratones knockout IL-10, lo que subraya su potencial terapéutico para el tratamiento de la EII.

Realizamos FMT de donante sano 3 veces (una vez al mes durante 3 meses) en ratones C57BL / 6J de tipo salvaje (WT) e IL-10 de 2 meses de edad. Los ratones C57BL / 6J de la misma edad (la diferencia de edad debe ser de <2 meses) sirvieron como donantes fecales y se usaron gránulos fecales frescos cada vez. Los ensayos de EIA revelaron que el BNP estaba marcadamente elevado en el plasma de ratones con deficiencia de IL-10 y que el FMT de donante sano mitigó significativamente el aumento en los niveles de BNP (<strong cla...

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Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

La interacción de la susceptibilidad genética, la inmunidad de la mucosa y el entorno microecológico intestinal está involucrada en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). En este estudio, aplicamos el trasplante de microbiota fecal a ratones deficientes en IL-10 e investigamos su impacto en la inflamación del colon y la función cardíaca.

Evaluación terapéutica del trasplante de microbiota fecal en un modelo de ratón deficiente en interleucina 10

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...

Tres experimentos clínicos sugirieron que el trasplante de microbiota fecal tiene el potencial terapéutico para una serie de enfermedades humanas. Otros estudios mecanicistas ayudarán a llevar el FMT del banco a la cabecera. Este método adopta el sonda oral para la ruta de entrega, lo que permite una entrega de volumen más precisa y una absorción rápida.Solo requiere habilidades técnicas moderadas. Demostrando el procedimiento estará Xioying Zhong, un investigador asociado senior de nuestro laboratorio. Comience preparando toallas de papel estériles, pinzas de extremo romo y tubos cónicos de 50 mililitros.Coloque algunas toallas de papel y pinzas en bolsas de autoclave separadas y autoclave a 180 grados centígrados en calor seco durante 30 minutos. Pese los tubos cónicos estériles y anote su peso en los tubos. Encienda el gabinete de bioseguridad en la habitación del animal.Tome una jaula de ratón limpia esterilizada en autoclave sin ropa de cama y colóquela en el gabinete de bioseguridad. Retire la tapa y el estante de comida y colóquelos dentro del gabinete. Coloque algunas toallas de papel estériles en la parte inferior de la jaula y vuelva a colocar la rejilla de metal en la parte superior de la jaula.Identifique a los donantes fecales de la misma edad y coloque la jaula del ratón en el gabinete de bioseguridad. Abra la jaula y agarre suavemente un ratón donante por la cola y colóquelo en la rejilla de metal en la parte superior de la jaula limpia. Coloque la cubierta de la jaula en la parte superior del estante y espere a que el animal defeque.Recoja los gránulos fecales y póngalos en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Tire de los pellets por sexo. Pesa el tubo de nuevo y calcula el peso de los gránulos fecales.Prepare una solución estéril agregando una solución de glicerol al 10% a la solución salina normal. Agregue 10 mililitros de esta solución al tubo cónico por cada gramo de pellets fecales. Homogeneice esta mezcla a baja velocidad tres veces durante 30 segundos usando un homogeneizador de mesa dentro de una campana extractora para resuspender las heces.Filtrar la suspensión fecal a través de dos capas de gasa de algodón estéril. Guarde el filtrado temporalmente en un refrigerador por hasta seis horas, o empaquételo en viales criogénicos estériles y guárdelo en un congelador de menos 80 grados. Limpie a fondo el homogeneizador o la licuadora siguiendo un procedimiento estándar.Descongele la suspensión fecal congelada en hielo si usa muestras congeladas. Mezclar la suspensión fecal descongelada mediante vórtice. Transfiera la suspensión fecal fresca o descongelada a jeringas de un mililitro.Pese los ratones y elija el tamaño correcto de la aguja de sonda y el volumen máximo de dosificación. Pruebe la aguja de sonda medindo la longitud desde la punta de la nariz del ratón hasta la parte inferior del esternón. Llene la jeringa con glicerol al 10% en suspensión salina o fecal y retire las burbujas de aire dentro de la jeringa y la aguja.Coloque una jaula para ratones en el gabinete de bioseguridad. Retire la cubierta de plástico de la jaula y deje la rejilla metálica en su lugar. Abra el estante metálico con una mano.Agarre un mouse por la cola y colóquelo en el estante de metal. Sostenga el mouse por la cola con una mano y use el pulgar y los dedos medios de la otra mano para sujetar al animal agarrando la piel sobre los hombros. Extienda suavemente la cabeza del animal hacia atrás y sostenga la cabeza en su lugar con una mano.Coloque la aguja nasogástrica en la parte superior de la lengua dentro de la boca. Avance suavemente a lo largo de la plataforma superior hasta que la aguja llegue al esófago. Pase la aguja suavemente en un solo movimiento.Una vez que la aguja esté colocada y verificada correctamente, administre lentamente el material empujando la jeringa conectada a la aguja. Después de la dosificación, saque suavemente la aguja. Marque el ratón y devuélvalo a su jaula de origen.Vigile al animal durante cinco a 10 minutos buscando signos de dificultad para respirar o angustia. Monitorizar de nuevo a los ratones entre 12 y 24 horas después del trasplante de microbiota fecal. El inmunoensayo enzimático reveló que el péptido natriurético tipo B estaba marcadamente elevado en el plasma de ratones deficientes en interleucina 10.Un trasplante de microbiota fecal de un donante sano mitigó significativamente el aumento de los niveles de péptidos natriuréticos tipo B. La ecocardiografía detectó una disminución significativa en la fracción de eyección del ventrículo izquierdo en los ratones deficientes en interleucina 10 en comparación con los ratones de tipo salvaje. La disminución fue significativamente anulada por el trasplante de microbiota fecal.Estos hallazgos sugieren que el trasplante de microbiota fecal de un donante sano mitigó la colitis inducida por deterioro cardíaco. Al intentar el protocolo, elegir la aguja de sonda correcta es esencial. Los tubos de alimentación de plástico flexibles podrían ser una mejor opción para los principiantes.También es importante practicar el manejo de animales antes del sonda nasogástrica.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

Un modelo de cultivo por lotes In Vitro para estimar los efectos de los regímenes intervencionistas en la microbiota fecal humana

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Investigación

Inmunología e Infección

An Immunological Model for Heterotopic Heart and Cardiac Muscle Cell Transplantation in Rats

Un modelo inmunológico para el trasplante heterotópico de células musculares cardíacas y cardíacas en ratas

Heterotopic heart transplantation in rats has been a commonly used model for diverse immunological studies for more than 50 years. Several modifications ...

Optimization of the Cuff Technique for Murine Heart Transplantation

Optimización de la Técnica del Manguito para el Trasplante cardíaco murino

Murine cardiac transplantation has been performed for more than 40 years. With advancements in microsurgery, certain new techniques have been used to ...

Experimental Autoimmune Uveitis: An Intraocular Inflammatory Mouse Model

Uveítis autoinmune experimental: un modelo de ratón inflamatorio intraocular

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular ...

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Purificación y expansión de células T asesinas naturales invariantes de ratón para estudios in vitro e in vivo

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Partial Heterotopic Hindlimb Transplantation Model in Rats

Modelo de trasplante parcial de extremidades posteriores heterotópicas en ratas

Vascularized composite allotransplantations (VCA) represent the most advanced reconstruction option for patients without autologous surgical possibilities ...

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

Un sistema de cultivo de órganos intestinales intestinales para analizar las interacciones huésped-microbiota

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Análisis de la dinámica de la microbiota fecal en ratones propensos al lupus utilizando un método de aislamiento de ADN simple y rentable

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

Evaluation of a Reliable Biomarker in a Cecal Ligation and Puncture-Induced Mouse Model of Sepsis

Evaluación de un biomarcador fiable en un modelo de sepsis de sepsis inducida por punción cecal y ligadura cecal

Sepsis is a severe life-threatening and rapidly developing disease that causes millions of deaths annually worldwide. Researchers have made tremendous ...

A Mouse Ear Model for Allergic Contact Dermatitis Evaluation

Un modelo de oreja de ratón para la evaluación de la dermatitis alérgica de contacto

Skin is the human body&#39;s first line of defense and one of the most exposed organs to environmental chemicals. Allergic contact dermatitis (ACD) is a ...