Name: computational reconstruction of pancreatic islets as a tool for structural and functional analysis
Uploaded: 2022-03-09T13:30:00
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G.J. Félix-Martínez agradece ao CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México) e ao Departamento de Engenharia Elétrica da Universidad Autónoma Metropolitana (Cidade do México) pelo apoio dado a este projeto. Agradecemos ao Dr. Danh-Tai Hoang, ao Dr. Manami Hara e ao Dr. Junghyo Jo pelo excelente trabalho e generosidade em compartilhar as arquiteturas de ilhotas que tornaram esse trabalho possível com a comunidade de pesquisa.

NOTA: Um diagrama esquemático do protocolo é mostrado na Figura 1. Uma descrição passo a passo é dada da seguinte forma (consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter detalhes sobre os painéis de controle usados em cada etapa do protocolo).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63351/63351fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de fluxo. Um diagrama...

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	<li>Chen, L., Pan, X., Zhang, Y. H., Huang, T., Cai, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gene+Expression+Differences+between+Different+Pancreatic+Cells.">Analysis of Gene Expression Differences between Different Pancreatic Cells.</a> ACS Omega. 4 (4), 6421-6435 (2019).</li><li>Longnecker, D. S., Gorelick, F., Thompson, E. D., Histology, H. G., Beger, A. L., Warshaw, R. H., Hruban, M. W., Buchler, M. M., Lerch, J. P., Neoptolemos, T., Shimosegawa, D. C., Whitcomb, C., GroB, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Histology,+and+Fine+Structure+of+the+Pancreas.">Anatomy, Histology, and Fine Structure of the Pancreas.</a> The Pancreas. , (2018).</li><li>Liao, E. 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T., Hara, M., Jo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Pancreatic+Islets:+Glucose-Dependent+Coordination+of+Hormone+Pulses.">Design Principles of Pancreatic Islets: Glucose-Dependent Coordination of Hormone Pulses.</a> PloS One. 11 (4), 0152446 (2016).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>F&#233;lix-Martinez, G. J., God&#237;nez-Fern&#225;ndez, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+hubs+maintain+Ca2++oscillations+in+human+and+mouse+islet+simulations.">Beta-cell hubs maintain Ca2+ oscillations in human and mouse islet simulations.</a> Islets. 10 (4), 151-167 (2018).</li><li>Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+glucagon+secretion:+the+&#946;/&#945;/&#948;+model.">Paracrine regulation of glucagon secretion: the &#946;/&#945;/&#948; model.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 310 (8), 597-611 (2016).</li><li>F&#233;lix-Mart&#237;nez, G. J., Mata, A., God&#237;nez-Fern&#225;ndez, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsletLab:+an+application+to+reconstruct+and+analyze+islet+architectures.">IsletLab: an application to reconstruct and analyze islet architectures.</a> Islets. 14 (1), 36-39 (2022).</li><li>F&#233;lix-Mart&#237;nez, G. J., God&#237;nez-Fern&#225;ndez, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+reconstructed+architectures+from+mice+and+human+islets.">Comparative analysis of reconstructed architectures from mice and human islets.</a> Islets. 14 (1), 23-35 (2022).</li></ol>

O protocolo acima descreve uma abordagem prática para reconstruir e analisar arquiteturas de ilhotas pancreáticas usando novos algoritmos computacionais. O principal objetivo deste trabalho é permitir que a comunidade de pesquisa de ilhotas obtenha métricas quantitativas para caracterizar as propriedades morfológicas e conectividade das arquiteturas de ilhotas pancreáticas e avaliar as possíveis implicações funcionais dessas propriedades através de simulações computacionais.
<p class="jove_conten...

O pâncreas é dividido em regiões referidas como cabeça, pescoço, corpo e cauda, cada uma com estruturas, funções e posição anatômicadiferentes 1,2. Do ponto de vista funcional, o pâncreas pode ser dividido em sistemas endócrinos e exócrinos com o primeiro responsável pela secreção de hormônios criticamente envolvidos na regulação da homeostase glicemia, enquanto este último contribui para a digestão alimentar através da secreção de enzimas no duodeno1. As ilhotas pancreáticas constituem o tecido endócrino do pâncreas e são responsáveis pela secreção de glucagon, insulina e somatostatina, secretadas de células de β, e δ, respectivamente3. Além de seus mecanismos de regulação intrínseca, essas células são reguladas via comunicação elétrica direta (entre células β e prováveis β e δ células), e também por sinalização paracrina e autocririna 4,5,6. Ambos os mecanismos são altamente dependentes da arquitetura de ilhotas (ou seja, a composição e organização dos diferentes tipos de células dentro da ilhota)7,8. É importante ressaltar que a arquitetura de ilhotas é alterada na presença de diabetes, provavelmente perturbando a comunicação intraisleta como resultado 9,10.
O estudo das ilhotas pancreáticas envolve uma ampla gama de metodologias experimentais. Entre elas, o uso de técnicas de fluorescência para determinar o número, localização e tipo das diferentes células da ilhota permitiu estudar as propriedades estruturais e morfológicas das ilhotas pancreáticas 11,12,13 e obter uma melhor compreensão das implicações funcionais em saúde e doença. Como complemento, modelos computacionais de células pancreáticas 14,15,16 e, mais recentemente, ilhotas pancreáticas 12,17,18,19 foram utilizadas nas últimas décadas para avaliar aspectos difíceis ou até impossíveis de abordar experimentalmente.
Neste protocolo, buscamos preencher a lacuna entre o trabalho experimental e computacional, delineando uma metodologia para reconstruir arquiteturas de ilhotas, analisar suas propriedades morfológicas e conectividade por meio de métricas quantitativas e realizar simulações básicas para avaliar as implicações funcionais das propriedades ilhotas.
O protocolo descrito abaixo é baseado em algoritmos computacionais especificamente projetados para o estudo de ilhotas pancreáticas. Em resumo, na primeira etapa do protocolo, a arquitetura de ilhotas é reconstruída a partir de dados experimentais utilizando o algoritmo recentemente proposto por Félix-Martínez et al.19 em que posições nucleares obtidas através de 4′,6-diamidino-2-pheilndole (DAPI) coloração e tipos celulares identificados através de imunofluscência (como descrito em detalhes por Hoang et al.11,12 ) são processados em um procedimento de otimização iterativo. Isso leva à determinação do tamanho e posição ideais de cada célula e à obtenção de uma ilhota composta de células não sobrepostas. Em segundo lugar, com base na arquitetura reconstruída, os contatos célula-célula são identificados para determinar as propriedades de conectividade e gerar a rede de ilhotas correspondente que permite ao usuário obter métricas quantitativas para descrever melhor a arquitetura de ilhotas (detalhes sobre o algoritmo de reconstrução podem ser consultados no trabalho original sobre o assunto19). Finalmente, simulações funcionais básicas são realizadas utilizando-se a abordagem de modelagem proposta por Hoang et al.12 em que, com base na natureza pulsante da secreção hormonal observada experimentalmente20,21, cada célula é tratada como um oscilador e, portanto, a ilhota é representada como uma rede de osciladores acoplados seguindo as propriedades de conectividade da ilhota reconstruída.
Dada a complexidade computacional dos algoritmos utilizados neste protocolo, todas as etapas envolvidas foram implementadas em um aplicativo autônomo22 com o objetivo principal de abordar essas ferramentas computacionais para todos os leitores interessados, independentemente de seu nível de experiência no uso de software especializado ou linguagens de programação.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CUDA-capable NVIDIA graphics card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required for the functional simulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsletLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computational reconstruction of pancreatic islets as a tool for structural and functional analysis

As propriedades estruturais das ilhotas pancreáticas são fundamentais para a resposta funcional das células secretantes de insulina, glucagon e somatostatina, devido às suas implicações na comunicação intraisleta via sinalização elétrica, paracrina e autocririna. Neste protocolo, a arquitetura tridimensional de uma ilhota pancreática é primeiro reconstruída a partir de dados experimentais usando um novo algoritmo computacional. Em seguida, são obtidas as propriedades morfológicas e de conectividade da ilhota reconstruída, como o número e percentuais dos diferentes tipos de células, volume celular e contatos célula-célula. Em seguida, a teoria da rede é usada para descrever as propriedades de conectividade da ilhota através de métricas derivadas da rede, como grau médio, coeficiente de cluster, densidade, diâmetro e eficiência. Finalmente, todas essas propriedades são avaliadas funcionalmente através de simulações computacionais usando um modelo de osciladores acoplados. No geral, descrevemos aqui um fluxo de trabalho passo a passo, implementado no IsletLab, um aplicativo multiplataforma desenvolvido especificamente para o estudo e simulação de ilhotas pancreáticas, para aplicar uma nova metodologia computacional para caracterizar e analisar ilhotas pancreáticas como um complemento ao trabalho experimental.

A reconstrução das ilhotas pancreáticas utilizando a metodologia proposta por Félix-Martínez et al.19 é altamente dependente dos parâmetros dados ao algoritmo de otimização (definido nos cenários de reconstrução). Um exemplo disso é mostrado visualmente na Figura 3, onde ilhotas reconstruídas obtidas usando diferentes conjuntos de parâmetros são mostradas. Primeiro, na Figura 3A, uma reconstrução que incluiu 86,6% das c?...

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Computational Reconstruction of Pancreatic Islets as a Tool for Structural and Functional Analysis

Neste protocolo, as ilhotas pancreáticas são reconstruídas e analisadas usando algoritmos computacionais implementados em uma aplicação multiplataforma dedicada.

Reconstrução computacional de ilhotas pancreáticas como ferramenta de análise estrutural e funcional

Structural properties of pancreatic islets are key for the functional response of insulin, glucagon, and somatostatin-secreting cells, due to their ...

Este protocolo é significativo porque descreve uma carga de trabalho computacional para reconstruir arquiteturas de ilhotas, analisar suas propriedades morfológicas e de conectividade e avaliar suas implicações funcionais através de simulações computacionais. A principal vantagem é que ele fornece uma maneira de implementar algoritmos de computação de alto desempenho para complementar o trabalho teórico e experimental no campo da pesquisa de ilhotas. Esta metodologia pode ser particularmente útil para comparar as propriedades morfológicas e de conectividade de ilhotas saudáveis e alteradas ou para comparar arquiteturas de ilhotas de diferentes espécies animais.Para começar, verifique se os compiladores GCC e NVCC estão instalados. Abra um terminal executando os comandos e siga as instruções fornecidas no texto se algum desses comandos não for reconhecido pelo sistema. Abra um terminal e vá para a pasta IsletLab.Crie um novo ambiente executando o comando no terminal. Ative o novo ambiente executando o comando. Inicie o aplicativo IsletLab executando o comando no terminal.Para preparar os dados de entrada, organize os dados de ilhotas de entrada em um arquivo de quatro colunas em que a primeira coluna é o tipo de célula e a segunda, terceira e quarta colunas são as coordenadas X, Y e Z das células de entrada, respectivamente, garantindo que o arquivo de entrada não inclua cabeçalhos de coluna. Clique no botão de ilhota inicial de carga e selecione o arquivo contendo dados de entrada para gerar uma ilhota inicial, a representação tridimensional e as estatísticas correspondentes. Para configurar o processo de reconstrução, clique no botão Configurações de Reconstrução e modifique os parâmetros de otimização.Clique no botão OK para salvar os valores dos parâmetros. Clique no botão Reconstruir a ilhota para abrir a janela Registro de Reconstrução. Clique no botão Executar para iniciar o processo de reconstrução.Avalie os resultados do processo de reconstrução analisando as estatísticas de otimização mostradas na guia Ilhotas Finais do painel estatístico, focando na maximização do percentual de células experimentais incluídas nas ilhotas reconstruídas ou, equivalentemente, na minimização do número de sobreposições. Se o percentual de estatísticas experimentais for considerado baixo de acordo com os objetivos do usuário, clique no menu Arquivo e selecione Reiniciar. Clique no botão Descarregar o botão ilhota inicial e selecione o arquivo contendo dados de entrada para gerar uma ilhota inicial.Em seguida, aumente a temperatura inicial, o fator Iterações e o fator de aceitação nos ajustes de Reconstrução e repita o processo de reconstrução de ilhotas descrito anteriormente até que os resultados satisfatórios sejam obtidos. Clique nas configurações de reconstrução e selecione Tolerância de contato para definir a tolerância de contato entre células. Clique em OK para salvar os valores do parâmetro.Clique no botão contatos célula a célula para identificar as células em contato próximo. Clique no botão Criar rede para gerar a rede de ilhotas e para calcular a matriz de rede associada. Mude para a guia Simulação do painel de configuração da interface.Selecione o modo desejado de frequência intrínseca, Constante ou Aleatória. Clique no botão configurar de frequência intrínseca para definir a frequência do oscilador em hertz. Selecione o modo desejado da fase inicial, Constante ou Aleatório.Clique no botão Configurar interações para definir os parâmetros de interação célula-celular na janela de força interação. Configure a simulação definindo o tempo total de simulação, etapa de tempo e fator de salvamento. Defina o número de blocos, threads e recursos de plataforma de computação disponíveis para realizar a simulação.Clique no botão Executar simulação para abrir a janela de registro de simulação. Clique no botão Executar para iniciar a simulação e monitore o processo até que a legenda Feche a janela para continuar. Em seguida, feche a janela de registro de simulação para observar os resultados da simulação.Clique em Arquivar e selecione o Projeto de Exportação na barra de menu. Selecione o diretório no qual o arquivo do projeto será salvo e clique no botão OK. Foi obtida a reconstrução de ilhotas utilizando conjuntos subótimos de parâmetros nos ambientes de reconstrução, incluindo 86,6% das células iniciais.O aumento da temperatura inicial, iteração e fatores de aceitação resultou em uma maior porcentagem de células iniciais como 93,37 e 99,15% nas ilhotas reconstruídas. Os lotes de convergência do processo de reconstrução foram obtidos, demonstrando a evolução das células sobrepostas em função da temperatura. A identificação dos contatos célula-célula das arquiteturas de ilhotas reconstruídas depende do valor do parâmetro de tolerância ao contato.Apenas 290 contatos célula-célula foram identificados pelo valor de um micrômetro, enquanto para dois micrômetros, o contexto total identificado aumentou para 636 e 731, respectivamente. O enredo da rede foi obtido que fornece uma representação visual dos contatos célula-célula que estão conectados juntos. Os resultados da simulação demonstraram que as células alfa e beta oscilam completamente fora de fase, enquanto as células delta oscilam fora da fase com células alfa e beta.O comportamento oscilatório da ilhota foi dominado pelas oscilações das células alfa com uma pequena contribuição da outra população celular. Foi obtido o gráfico do índice de sincronização de ilhlets que fornece a medida da coerência de fase das oscilações entre as células ilhotas e a variação da sincronicidade entre as células ilhotas ao longo do tempo. Todas as métricas derivadas e as simulações funcionais dependem do processo de reconstrução, por isso é fundamental alcançar o maior percentual de células iniciais nas ilhotas reconstruídas.Ilhotas reconstruídas obtidas a partir deste procedimento podem ser ainda mais utilizadas para desenvolver modelos computacionais mais realistas de ilhotas pancreáticas, incluindo uma descrição biofísica detalhada das células ilhotas.

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