Name: computational reconstruction of pancreatic islets as a tool for structural and functional analysis
Uploaded: 2022-03-09T13:30:00
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G.J. Félix-Martínez agradece al CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México) y al Departamento de Ingeniería Eléctrica de la Universidad Autónoma Metropolitana (Ciudad de México) por el apoyo brindado a este proyecto. Agradecemos al Dr. Danh-Tai Hoang, al Dr. Manami Hara y al Dr. Junghyo Jo por su excelente trabajo y generosidad al compartir las arquitecturas de islotes que hicieron posible este trabajo con la comunidad de investigación.

NOTA: En la figura 1 se muestra un diagrama esquemático del protocolo. Una descripción paso a paso es la siguiente (consulte el Archivo complementario 1 para obtener detalles sobre los paneles de control utilizados en cada paso del protocolo).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63351/63351fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo. Un diagram...

<ol>
	<li>Chen, L., Pan, X., Zhang, Y. H., Huang, T., Cai, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gene+Expression+Differences+between+Different+Pancreatic+Cells.">Analysis of Gene Expression Differences between Different Pancreatic Cells.</a> ACS Omega. 4 (4), 6421-6435 (2019).</li><li>Longnecker, D. S., Gorelick, F., Thompson, E. D., Histology, H. G., Beger, A. L., Warshaw, R. H., Hruban, M. W., Buchler, M. M., Lerch, J. P., Neoptolemos, T., Shimosegawa, D. C., Whitcomb, C., GroB, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Histology,+and+Fine+Structure+of+the+Pancreas.">Anatomy, Histology, and Fine Structure of the Pancreas.</a> The Pancreas. , (2018).</li><li>Liao, E. 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T., Hara, M., Jo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Pancreatic+Islets:+Glucose-Dependent+Coordination+of+Hormone+Pulses.">Design Principles of Pancreatic Islets: Glucose-Dependent Coordination of Hormone Pulses.</a> PloS One. 11 (4), 0152446 (2016).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>F&#233;lix-Martinez, G. J., God&#237;nez-Fern&#225;ndez, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+models+of+electrical+activity+of+the+pancreatic+&#946;-cell:+a+physiological+review.">Mathematical models of electrical activity of the pancreatic &#946;-cell: a physiological review.</a> Islets. 6 (3), 949195 (2014).</li><li>F&#233;lix-Mart&#237;nez, G. J., Gonz&#225;lez-V&#233;lez, V., God&#237;nez-Fern&#225;ndez, J. R., Gil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+models+of+the+human+pancreatic+&#948;-cell:+From+single+channels+to+the+firing+of+action+potentials.">Electrophysiological models of the human pancreatic &#948;-cell: From single channels to the firing of action potentials.</a> International Journal for Numerical Methods in Biomedical Engineering. 36 (2), 3296 (2020).</li><li>Watts, M., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+pancreatic+&#945;-cell:+dual+mechanisms+of+glucose+suppression+of+glucagon+secretion.">Modeling the pancreatic &#945;-cell: dual mechanisms of glucose suppression of glucagon secretion.</a> Biophysical Journal. 106 (3), 741-751 (2014).</li><li>Lei, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+hubs+maintain+Ca2++oscillations+in+human+and+mouse+islet+simulations.">Beta-cell hubs maintain Ca2+ oscillations in human and mouse islet simulations.</a> Islets. 10 (4), 151-167 (2018).</li><li>Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+glucagon+secretion:+the+&#946;/&#945;/&#948;+model.">Paracrine regulation of glucagon secretion: the &#946;/&#945;/&#948; model.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 310 (8), 597-611 (2016).</li><li>F&#233;lix-Mart&#237;nez, G. J., Mata, A., God&#237;nez-Fern&#225;ndez, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+human+pancreatic+islet+architectures+using+computational+optimization.">Reconstructing human pancreatic islet architectures using computational optimization.</a> Islets. 12 (6), 121-133 (2020).</li><li>Hellman, B., Salehi, A., Gylfe, E., Dansk, H., Grapengiesser, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+generates+coincident+insulin+and+somatostatin+pulses+and+antisynchronous+glucagon+pulses+from+human+pancreatic+islets.">Glucose generates coincident insulin and somatostatin pulses and antisynchronous glucagon pulses from human pancreatic islets.</a> Endocrinology. 150 (12), 5334-5340 (2009).</li><li>Hellman, B., Salehi, A., Grapengiesser, E., Gylfe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+mouse+islets+respond+to+glucose+with+an+initial+peak+of+glucagon+release+followed+by+pulses+of+insulin+and+somatostatin+in+antisynchrony+with+glucagon.">Isolated mouse islets respond to glucose with an initial peak of glucagon release followed by pulses of insulin and somatostatin in antisynchrony with glucagon.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 417 (4), 1219-1223 (2012).</li><li>F&#233;lix-Mart&#237;nez, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsletLab:+an+application+to+reconstruct+and+analyze+islet+architectures.">IsletLab: an application to reconstruct and analyze islet architectures.</a> Islets. 14 (1), 36-39 (2022).</li><li>F&#233;lix-Mart&#237;nez, G. J., God&#237;nez-Fern&#225;ndez, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+reconstructed+architectures+from+mice+and+human+islets.">Comparative analysis of reconstructed architectures from mice and human islets.</a> Islets. 14 (1), 23-35 (2022).</li></ol>

El protocolo anterior describe un enfoque práctico para reconstruir y analizar arquitecturas de islotes pancreáticos utilizando nuevos algoritmos computacionales. El objetivo principal de este trabajo es permitir a la comunidad investigadora de islotes derivar métricas cuantitativas para caracterizar las propiedades morfológicas y de conectividad de las arquitecturas de islotes pancreáticos y evaluar las posibles implicaciones funcionales de dichas propiedades a través de simulaciones computacionales.
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El páncreas se divide en regiones conocidas como cabeza, cuello, cuerpo y cola, cada una con diferentes estructuras, funciones y posición anatómica 1,2. Desde un punto de vista funcional, el páncreas se puede dividir en sistemas endocrinos y exocrinos, siendo el primero responsable de la secreción de hormonas críticamente involucradas en la regulación de la homeostasis de la glucosa, mientras que el segundo contribuye a la digestión de los alimentos a través de la secreción de enzimas en el duodeno1. Los islotes pancreáticos constituyen el tejido endocrino del páncreas y son responsables de la secreción de glucagón, insulina y somatostatina, secretadas por las células ɑ, β y δ, respectivamente3. Además de sus mecanismos reguladores intrínsecos, estas células se regulan a través de la comunicación eléctrica directa (entre las células β y las células β y δ), y también por señalización paracrina y autocrina 4,5,6. Ambos mecanismos dependen en gran medida de la arquitectura de los islotes (es decir, de la composición y organización de los diferentes tipos de células dentro del islote)7,8. Es importante destacar que la arquitectura de los islotes se altera en presencia de diabetes, lo que probablemente perturbe la comunicación intraislet como resultado 9,10.
El estudio de los islotes pancreáticos implica una amplia gama de metodologías experimentales. Entre ellas, el uso de técnicas de fluorescencia para determinar el número, ubicación y tipo de las diferentes células del islote ha permitido estudiar las propiedades estructurales y morfológicas de los islotes pancreáticos 11,12,13 y conocer mejor las implicaciones funcionales en la salud y la enfermedad. Como complemento, en las últimas décadas se han utilizado modelos computacionales de células pancreáticas 14,15,16 y, más recientemente, de islotes pancreáticos 12,17,18,19 para evaluar aspectos difíciles o incluso imposibles de abordar experimentalmente.
En este protocolo, nuestro objetivo es cerrar la brecha entre el trabajo experimental y computacional al delinear una metodología para reconstruir arquitecturas de islotes, analizar sus propiedades morfológicas y de conectividad a través de métricas cuantitativas y realizar simulaciones básicas para evaluar las implicaciones funcionales de las propiedades de los islotes.
El protocolo que se describe a continuación se basa en algoritmos computacionales diseñados específicamente para el estudio de islotes pancreáticos. En resumen, en el primer paso del protocolo, la arquitectura de los islotes se reconstruye a partir de datos experimentales utilizando el algoritmo propuesto recientemente por Félix-Martínez et al.19 en el que se obtienen posiciones nucleares obtenidas mediante tinción de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y tipos celulares identificados mediante inmunofluorescencia (descritos en detalle por Hoang et al.11,12 ) se procesan en un procedimiento de optimización iterativa. Esto lleva a determinar el tamaño y la posición óptimos de cada célula y obtener un islote compuesto por células no superpuestas. En segundo lugar, sobre la base de la arquitectura reconstruida, se identifican contactos de celda a celda para determinar las propiedades de conectividad y generar la red de islotes correspondiente que permite al usuario obtener métricas cuantitativas para describir mejor la arquitectura de islotes (los detalles sobre el algoritmo de reconstrucción se pueden consultar en el trabajo original sobre el tema19). Finalmente, se realizan simulaciones funcionales básicas utilizando el enfoque de modelado propuesto por Hoang et al.12 en el que, en base a la naturaleza pulsátil de la secreción hormonal observada experimentalmente20,21, cada célula es tratada como un oscilador, y por lo tanto el islote se representa como una red de osciladores acoplados siguiendo las propiedades de conectividad del islote reconstruido.
Dada la complejidad computacional de los algoritmos utilizados en este protocolo, todos los pasos implicados se han implementado en una aplicación independiente22 con el objetivo principal de acercar estas herramientas computacionales a todos los lectores interesados independientemente de su nivel de experiencia en el uso de software especializado o lenguajes de programación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CUDA-capable NVIDIA graphics card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Required for the functional simulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsletLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computational reconstruction of pancreatic islets as a tool for structural and functional analysis

Las propiedades estructurales de los islotes pancreáticos son clave para la respuesta funcional de las células secretoras de insulina, glucagón y somatostatina, debido a sus implicaciones en la comunicación intraisleta a través de la señalización eléctrica, paracrina y autocrina. En este protocolo, la arquitectura tridimensional de un islote pancreático se reconstruye en primer lugar a partir de datos experimentales utilizando un nuevo algoritmo computacional. A continuación, se obtienen las propiedades morfológicas y de conectividad del islote reconstruido, como el número y los porcentajes de los diferentes tipos de células, el volumen celular y los contactos de célula a célula. Luego, la teoría de redes se utiliza para describir las propiedades de conectividad del islote a través de métricas derivadas de la red, como el grado promedio, el coeficiente de agrupamiento, la densidad, el diámetro y la eficiencia. Finalmente, todas estas propiedades se evalúan funcionalmente a través de simulaciones computacionales utilizando un modelo de osciladores acoplados. En general, aquí describimos un flujo de trabajo paso a paso, implementado en IsletLab, una aplicación multiplataforma desarrollada específicamente para el estudio y simulación de islotes pancreáticos, para aplicar una novedosa metodología computacional para caracterizar y analizar islotes pancreáticos como complemento al trabajo experimental.

La reconstrucción de islotes pancreáticos utilizando la metodología propuesta por Félix-Martínez et al.19 depende en gran medida de los parámetros dados al algoritmo de optimización (definidos en los ajustes de reconstrucción). Un ejemplo de esto se muestra visualmente en la Figura 3 donde se muestran los islotes reconstruidos obtenidos utilizando diferentes conjuntos de parámetros. En primer lugar, en la Figura 3A, se muestra un...

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Computational Reconstruction of Pancreatic Islets as a Tool for Structural and Functional Analysis

En este protocolo, los islotes pancreáticos se reconstruyen y analizan utilizando algoritmos computacionales implementados en una aplicación multiplataforma dedicada.

Reconstrucción computacional de islotes pancreáticos como herramienta de análisis estructural y funcional

Structural properties of pancreatic islets are key for the functional response of insulin, glucagon, and somatostatin-secreting cells, due to their ...

Este protocolo es significativo porque describe una carga de trabajo computacional para reconstruir arquitecturas de islotes, analizar sus propiedades morfológicas y de conectividad, y evaluar sus implicaciones funcionales a través de simulaciones computacionales. La principal ventaja es que proporciona una forma de implementar algoritmos informáticos de alto rendimiento para complementar el trabajo teórico y experimental en el campo de la investigación de islotes. Esta metodología puede ser particularmente útil para comparar las propiedades morfológicas y de conectividad de islotes sanos y alterados o para comparar arquitecturas de islotes de diferentes especies animales.Para comenzar, compruebe que los compiladores GCC y NVCC están instalados. Abra un terminal ejecutando los comandos y siga las instrucciones proporcionadas en el texto si alguno de estos comandos no es reconocido por el sistema. Abra un terminal y vaya a la carpeta IsletLab.Cree un nuevo entorno ejecutando el comando en el terminal. Active el nuevo entorno ejecutando el comando. Inicie la aplicación IsletLab ejecutando el comando en el terminal.Para preparar los datos de entrada, organice los datos del islote de entrada en un archivo de cuatro columnas en el que la primera columna sea el tipo de celda y las columnas segunda, tercera y cuarta sean las coordenadas X, Y y Z de las celdas de entrada, respectivamente, asegurándose de que el archivo de entrada no incluya encabezados de columna. Haga clic en el botón Cargar islote inicial y seleccione el archivo que contiene los datos de entrada para generar un islote inicial, la representación tridimensional y las estadísticas correspondientes. Para configurar el proceso de reconstrucción, haga clic en el botón Configuración de reconstrucción y modifique los parámetros de optimización.Haga clic en el botón Aceptar para guardar los valores de los parámetros. Haga clic en el botón Reconstruir islote para abrir la ventana Registro de reconstrucción. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar el proceso de reconstrucción.Evalúe los resultados del proceso de reconstrucción analizando las estadísticas de optimización mostradas en la pestaña Islote final del panel de estadísticas centrándose en maximizar el porcentaje de células experimentales incluidas en los islotes reconstruidos o, equivalentemente, en minimizar el número de superposiciones. Si el porcentaje de estadísticas experimentales se considera bajo según los objetivos del usuario, haga clic en el menú Archivo y seleccione Reiniciar. Haga clic en el botón Cargar islote inicial y seleccione el archivo que contiene los datos de entrada para generar un islote inicial.Luego aumente la temperatura inicial, el factor de iteraciones y el factor de aceptación en la configuración de reconstrucción, y repita el proceso de reconstrucción de islotes descrito anteriormente hasta que se obtengan resultados satisfactorios. Haga clic en la configuración de reconstrucción y seleccione Tolerancia de contacto para definir la tolerancia de contacto de celda a celda. Haga clic en Aceptar para guardar los valores de los parámetros.Haga clic en el botón Contactos de celda a celda para identificar las celdas en contacto cercano. Haga clic en el botón Generar red para generar la red de islotes y calcular la matriz de red asociada. Cambie a la ficha Simulación del panel de configuración de la interfaz.Seleccione el modo deseado de frecuencia intrínseca, Constante o Aleatorio. Haga clic en el botón Configurar frecuencia intrínseca para definir la frecuencia del oscilador en hercios. Seleccione el modo deseado de la fase inicial, Constante o Aleatorio.Haga clic en el botón Configurar interacciones para definir los parámetros de interacción de celda a celda en la ventana Intensidad de interacción. Configure la simulación definiendo el tiempo total de simulación, el paso de tiempo y el factor de ahorro. Defina el número de bloques, subprocesos y capacidad de plataforma informática disponibles para realizar la simulación.Haga clic en el botón Ejecutar simulación para abrir la ventana Registro de simulación. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar la simulación y supervisar el proceso hasta que se muestre la leyenda Cierre la ventana para continuar. A continuación, cierre la ventana Registro de simulación para observar los resultados de la simulación.Haga clic en Archivo y seleccione Exportar proyecto en la barra de menús. Seleccione el directorio en el que se guardará el archivo de proyecto y haga clic en el botón Aceptar. Se obtuvo la reconstrucción de islotes utilizando conjuntos de parámetros subóptimos en los ajustes de reconstrucción, incluyendo el 86,6% de las células iniciales.El aumento de la temperatura inicial, la iteración y los factores de aceptación dio como resultado un mayor porcentaje de células iniciales como 93.37 y 99.15% en los islotes reconstruidos. Se obtuvieron las gráficas de convergencia del proceso de reconstrucción, demostrando la evolución de las células superpuestas en función de la temperatura. La identificación de los contactos de celda a celda a partir de las arquitecturas de islotes reconstruidas depende del valor del parámetro de tolerancia de contacto.Solo se identificaron 290 contactos de célula a célula para el valor de un micrómetro, mientras que para dos micrómetros, el contexto total identificado aumentó a 636 y 731, respectivamente. Se obtuvo la gráfica de red que proporciona una representación visual de los contactos de celda a celda que están conectados entre sí. Los resultados de la simulación demostraron que las células alfa y beta oscilan completamente fuera de fase, mientras que las células delta oscilan fuera de fase con las células alfa y beta.El comportamiento oscilatorio del islote estuvo dominado por las oscilaciones de las células alfa con una contribución menor de la otra población celular. Se obtuvo la gráfica del índice de sincronización de islotes que proporciona la medida de la coherencia de fase de las oscilaciones entre las células de los islotes y la variación de la sincronicidad entre las células de los islotes a lo largo del tiempo. Todas las métricas derivadas y las simulaciones funcionales dependen del proceso de reconstrucción, por lo que es clave lograr el mayor porcentaje de células iniciales en los islotes reconstruidos.Los islotes reconstruidos obtenidos de este procedimiento se pueden utilizar para desarrollar modelos computacionales más realistas de islotes pancreáticos al incluir una descripción biofísica detallada de las células de los islotes.

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