Name: dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا Rush Biomarker Development Core على استخدام مرافقهم ، ومستودع Rush Biorepository لتسجيل الموضوعات ومعالجة العينات الحيوية ، وأرقام منح مبادرة شبكة شيكاغو لتقييم فيروس كورونا (Chicago CAN) التابعة لمؤسسة Walder Foundation SCI16 (J.R.S. و J.A.B.) و 21-00147 (J.R.S. و J.A.B.) وجائزة من مؤسسة Swim Across America Foundation (J.A.B).

تم تسجيل جميع المواد بموافقة خطية مستنيرة مع موافقة كاملة من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) على المركز الطبي بجامعة راش بموجب بروتوكول ORA 20101207 مع مراعاة جميع المبادئ التوجيهية المؤسسية لإجراء البحوث الأخلاقية. تم جمع الدم عن طريق الفصد التقليدي في فراغات الخزامى (K2EDTA) ومعالجتها بالبروتوكولات الموصى بها. تمت أرشفة البلازما الناتجة عند -80 درجة مئوية حتى تم إجراء التقييمات.
1. إعداد المجهرية المترافقة مع المستضدات
<ol><li>حدد ثلاث قوارير مختلفة من الميكروسفير المغناطيسي مع مناطق خرزة فريدة من نوعها ، وتسجيل معرف الخرزة ومعلومات الكثير لكل قارورة مستخدمة. ملاحظة: سيتم اتباع الخطوات التالية لكل منطقة ميكروسفير متميزة. الميكروسفير حساس للضوء ويجب حمايته من التعرض الطويل للضوء. أثناء خطوات الغسيل ، احرص على عدم إزعاج الميكروسفيرات. إذا كنت منزعجا ، فاسمح بفصل 60 ثانية ثانية.</li>
	<li>دوامة مخزون المجهر لمدة 60 ثانية وسونيكات لمدة 5 دقائق قبل استخدامها لفصل الخرز المجمع.</li>
	<li>انقل 1.0 × 106 حبات إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة منخفضة البروتين.</li>
	<li>أدخل الأنبوب في فاصل مغناطيسي واسمح بحدوث الفصل لمدة 60 ثانية. مع بقاء الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة supernatant بعناية دون إزعاج حبيبات الخرزة.</li>
	<li>قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي ، وأعد تعليق الخرز ب 100 ميكرولتر من الماء HPLC ، والدوامة لمدة 30 ثانية. ضع الأنبوب مرة أخرى في الفاصل المغناطيسي لمدة 60 ثانية ، ثم قم بإزالة السوبرناتانت. كرر بروتوكول الغسيل هذا مرتين.</li>
	<li>قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الميكروسفير المغسول في 90 ميكرولتر من فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة 100 mM ، الرقم الهيدروجيني 6.2 (المخزن المؤقت للتنشيط) بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية.</li>
	<li>أضف 10 ميكرولتر من 50 مجم / مل Sulfo-NHS (المخفف باستخدام Activation Buffer) إلى الميكروسفير والدوامة بلطف لمدة 10 ثوان. أضف 10 ميكرولتر من محلول EDC 50 ملغم / مل (مخفف مع المخزن المؤقت للتنشيط) ودوامة بلطف لمدة 10 ثوان. احتضان الميكروسفير لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع دوامة لطيفة كل 10 دقائق.</li>
	<li>كرر خطوات الغسيل 1.4-1.5 مع 50 mM MES ، الرقم الهيدروجيني 5.0 (المخزن المؤقت للاقتران) بدلا من الماء LC / MS من الدرجة الأولى لما مجموعه غسلتين.</li>
	<li>قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الخرز ب 100 ميكرولتر من Coupling Buffer بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية تليها مباشرة إضافة الكمية المطلوبة من البروتين.</li>
	<li>ارفع الحجم الإجمالي إلى 150 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت للاقتران. امزج تفاعل الاقتران بواسطة الدوامة لمدة 30 ثانية واحتضن لمدة 2 ساعة عن طريق الدوران في RT. ملاحظة: بالنسبة للمقايسات المحددة هنا، أجريت الاقترانات بتركيزات البروتين التالية: Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Spike S1: 5 ميكروغرام؛ و Nucleocapsid: 5 ميكروغرام ؛ الغشاء: 12.5 ميكروغرام.</li>
	<li>كرر خطوة الغسيل 1.4 مع محلول ملحي مخزنة مؤقتا بالفوسفات (PBS) -1٪ ألبومين مصل الماعز ، 0.01٪ Polysorbate-20 (Quench Buffer) بدلا من الماء LC / MS من الدرجة الأولى لما مجموعه غسلتين. أعد تعليق الميكروسفير المغسول في 100 ميكرولتر من Quench Buffer الذي يحتوي على 0.05٪ من أزيد الصوديوم بواسطة الدوامة لمدة 30 ثانية. ملاحظة: اسمح للخرز بالتبريد بالكامل لمدة 6 ساعات على الأقل قبل الشروع في أي إجراء آخر.</li>
	<li>احسب عدد الميكروسفير المسترد باستخدام عداد خلية آلي أو مقياس دمية. سجل تركيز الخرزة المرصودة.</li>
	<li>قم بتبريد الميكروسفير المقترن عند 4 درجات مئوية في الظلام.</li>
</ol>2. الإجراءات
<ol><li>أداء الفحص (البروتوكول الأساسي)<ol>
<li>أعد تعليق الميكروسفير المقترن بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية وسونيكات ل ~ 60-90 ثانية.</li>
		<li>قم بإزالة الكمية المطلوبة من كل غرواني خرزة من الأنبوب المعني ودمج غرويات الخرز في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد 1.5 مل.</li>
		<li>أدخل الأنبوب في فاصل مغناطيسي واسمح بحدوث الفصل لمدة 60 ثانية. مع بقاء الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة supernatant بعناية دون إزعاج حبيبات الخرزة.</li>
		<li>قم بإزالة الخرز من الفاصل ، وأعد تعليق الخرز ب 100 ميكرولتر من ألبومين مصل البقر PBS-1٪ ، و 0.01٪ Polysorbate-20 (اختبار المخزن المؤقت) ، والدوامة لمدة 30 ثانية. ضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي واسمح بحدوث الفصل لمدة 60 ثانية. كرر بروتوكول الغسيل هذا (أي الخطوات 2.1.3-2.1.4) مرتين</li>
		<li>اضبط تركيز خليط المجهر العامل 3-plex عن طريق إضافة حجم مناسب من المخزن المؤقت للفحص لتوليد تركيز نهائي من 100 ميكروسفير لكل 1 ميكرولتر لكل هدف.</li>
		<li>Aliquot 12.5 ميكرولتر من خليط الغلاف المجهري المحضر في الخطوة 2.1.5 في كل بئر من صفيحة 384 بئر أو 25 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة 96 بئرا.</li>
		<li>تمييع عينات البلازما / المصل 500 أضعاف في فحص المخزن المؤقت. إعداد العينات القياسية وفقا للمعايرة المطلوبة.</li>
		<li>أضف 12.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص كعينة فارغة وأضف كل عينة من العينات المخففة أو القياسية إلى كل بئر معين من لوحة عينة 384 بئرا أو 25 ميكرولتر من العينة الفارغة أو المخففة أو القياسية في كل بئر من لوحة عينة 96 بئرا.</li>
		<li>قم بتغطية اللوحة بختم أو رقائق معدنية من الألومنيوم واحتضنها لمدة 1 ساعة في RT على شاكر لوحة مضبوط على 700 دورة في الدقيقة. ملاحظة: يرد في الجدول 1 مخطط لمنحنيات التخفيف.</li>
		<li>قم بإعداد محلول من الأجسام المضادة للكشف عن الإنسان (محاليل الأجسام المضادة الثانوية) عند 4 ميكروغرام / مل باستخدام المخزن المؤقت للفحص كما هو محدد في الخطوة 2.1.11.</li>
		<li>تحضير الماعز المضاد للإنسان IgM ، مقترنا ب Super Bright 436 (SB) / الماعز المضاد للإنسان IgA ، Phycoerythrin (PE) الأجسام المضادة المقترنة للكشف عند 4 ميكروغرام / مل ؛ أو الماعز المضاد للإنسان IgM ، SB Conjugate / الماعز المضاد للإنسان IgG ، PE Conjugate يكتشف الأجسام المضادة عند 4 ميكروغرام / مل. ملاحظة: بالنسبة لتنسيق لوحة 384 بئرا ، يلزم وجود 12.5 ميكرولتر / بئر من محلول الأجسام المضادة الثانوي المحضر ، وبالنسبة لتنسيق لوحة 96 بئرا ، يلزم وجود 25 ميكرولتر / بئر.</li>
		<li>ضع الصفيحة على فاصل مغناطيسي ، واغسلها بسرعة ، وانقلب بقوة فوق حاوية خطرة بيولوجيا لإزالة السائل من الآبار. مع بقاء اللوحة مقلوبة ، اضغط بقوة على اللوحة مقابل واد سميك من الورق.</li>
		<li>اغسل كل بئر ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص وقم بإزالة السائل عن طريق الانعكاس القوي فوق حاوية المخاطر البيولوجية ، كما هو موضح سابقا. كرر هذه الخطوات (2.1.12-2.1.13) لما مجموعه غسلتين. تخلص من جميع الوديان الورقية المستخدمة في حاوية للمخاطر البيولوجية.</li>
		<li>أضف 12.5 ميكرولتر من محلول عمل الأجسام المضادة الثانوي إلى كل بئر من صفيحة 384 بئرا أو 25 ميكرولتر إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا. قم بتغطية اللوحة بختم أو رقائق معدنية من الألومنيوم واحتضنها لمدة 30 دقيقة في RT على شاكر صفيحة مضبوط على 700 دورة في الدقيقة.</li>
		<li>كرر خطوات الغسيل 2.1.12-2.1.13</li>
		<li>أضف 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص في كل بئر من صفيحة 384 بئرا أو 100 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة 96 بئرا. قم بتغطية اللوحة بختم أو رقائق معدنية من الألومنيوم واحتضنها لمدة 5 دقائق في RT على شاكر صفيحة مضبوط على 700 دورة في الدقيقة.</li>
		<li>تحليل 60 ميكرولتر عبر محلل الأداة وفقا لدليل النظام.</li>
	</ol></li>
	<li>تحسين وقت حضانة التقاط العينات<ol>
<li>قم بتنفيذ الخطوات الواردة في القسم 2.1 باستخدام مدة أوقات الحضانة البالغة 30 دقيقة و60 دقيقة و120 دقيقة في الخطوة 2.1.9. ملاحظة: يمكن إجراء عمليات الحضانة إما باستخدام لوحات مميزة أو عن طريق التوقف مؤقتا عند الخطوة 2.1.6 حتى وقت المتابعة إلى الخطوة 2.1.9. لتحقيق أوقات الحضانة المطلوبة.</li>
		<li>تابع قراءة اللوحة على المحلل باستخدام 60 ميكرولتر من خليط الفحص وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.</li>
	</ol></li>
	<li>تحسين تركيز الأجسام المضادة الثانوية<ol>
<li>نفذ هذا الإجراء على النحو المفصل في القسم 2.1 ، باستثناء التركيزات النهائية للكواشف في محلول عمل الأجسام المضادة الثانوي (المعد في الخطوة 2.1.10-2.1.11) المعدل على النحو التالي: الماعز المضادة للإنسان (أو الأرنب) IgM ، SB-conjugate الكشف عن الأجسام المضادة في 8 و 4 و 2 و 1 و 0.5 ميكروغرام / مل. الماعز المضاد للإنسان (أو الأرنب) IgA ، الأجسام المضادة للكشف عن PE المترافقة في 8 و 4 و 2 و 1 و 0.5 ميكروغرام / مل. الماعز المضاد للإنسان (أو الأرنب) IgG ، الأجسام المضادة للكشف عن PE المترافقة في 8 و 4 و 2 و 1 و 0.5 ميكروغرام / مل. الماعز المضاد للإنسان (أو الأرنب) IgG ، PE-conjugate / الماعز المضاد للإنسان (أو الأرنب) IgM ، SB-conjugate الكشف عن الأجسام المضادة في 8 و 4 و 2 و 1 و 0.5 ميكروغرام / مل. الماعز المضاد للإنسان (أو الأرنب) IgA ، PE-conjugate / الماعز المضاد للإنسان (أو الأرنب) IgM ، SB-conjugate الكشف عن الأجسام المضادة في 8 و 4 و 2 و 1 و 0.5 ميكروغرام / مل.</li>
		<li>تابع قراءة اللوحة على المحلل باستخدام 60 ميكرولتر من خليط الفحص وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.</li>
	</ol></li>
	<li>تحسين وقت حضانة الأجسام المضادة الثانوية<ol>
<li>نفذ هذا الإجراء كما هو مفصل في القسم 2.1 مع 15 دقيقة و 30 دقيقة و 60 دقيقة و 120 دقيقة من مدة الحضانة المحددة في الخطوة 2.1.14.</li>
		<li>تابع قراءة اللوحة على المحلل باستخدام 60 ميكرولتر من خليط الفحص وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.</li>
	</ol></li>
	<li>تقييم عينات الموضوع مع المقايسات المحسنة ثنائية القناة<ol>
<li>جمع عينات البلازما الخاضعة (n = 4) في الأيام -21 و -11 و -1/0 و +14 و +28 و +60 و +90 و +120 بالنسبة لإكمال إعطاء لقاح Covid-19 (أي الجرعة الثانية). ملاحظة: يمثل اليوم 0 النقطة الزمنية التي تم فيها الانتهاء من التطعيم.</li>
		<li>قم بإجراء جميع المقايسات باستخدام البروتوكول الأساسي (القسم 2.1.) إما كفحص ثنائي القناة IgG/IgM أو IgA/IgM.</li>
		<li>تطبيع النتائج إلى الحد الأقصى لقيمة كثافة الفلورسنت المتوسطة (MFI) المرصودة لكل غلوبولين مناعي محدد وفحص.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+in+the+multiplex+era:+potentials+and+pitfalls.">ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls.</a> Proteomics - Clinical Applications. 9, 406-422 (2015).</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4084 (2012).</li><li>Powell, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere-based+immunoassay+increases+the+sensitivity+of+siv-specific+antibody+detection+in+serum+samples+and+mucosal+specimens+collected+from+rhesus+macaques+infected+with+SIVmac239.">A multiplex microsphere-based immunoassay increases the sensitivity of siv-specific antibody detection in serum samples and mucosal specimens collected from rhesus macaques infected with SIVmac239.</a> BioResearch Open Access. 2 (3), 171-178 (2013).</li><li>Volpetti, F., Garcia-Cordero, J., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+high-throughput+multiplexed+protein+quantitation.">A microfluidic platform for high-throughput multiplexed protein quantitation.</a> PLoS One. 10 (2), 0117744 (2015).</li><li>Rabi, F. A., Al Zoubi, M. S., Kasasbeh, G. A., Salameh, D. M., Al-Nasser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+and+coronavirus+disease+2019:+What+we+know+so+far.">SARS-CoV-2 and coronavirus disease 2019: What we know so far.</a> Pathogens. 9 (3), 231 (2020).</li><li>Asif, M., Xu, Y., Xiao, F., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+COVID-19,+vitality+of+emerging+technologies+and+preventive+measures.">Diagnosis of COVID-19, vitality of emerging technologies and preventive measures.</a> Chemical Engineering Journal. 423, 130189 (2021).</li><li>La Marca, A., Capuzzo, M., Paglia, T., Roli, L., Trenti, T., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+for+SARS-CoV-2+(COVID-19):+a+systematic+review+and+clinical+guide+to+molecular+and+serological+in-vitro+diagnostic+assays.">Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays.</a> Reproductive Biomedicine Online. 41 (3), 483-499 (2020).</li><li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limit+of+blank,+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation.">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 29, 49-52 (2008).</li><li>Tarhoni, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+circulating+tumor-associated+autoantibodies+and+clinical+outcomes+in+advanced-stage+NSCLC+patients+receiving+PD-1/-L1+directed+immune+checkpoint+inhibition.">Relationship between circulating tumor-associated autoantibodies and clinical outcomes in advanced-stage NSCLC patients receiving PD-1/-L1 directed immune checkpoint inhibition.</a> Journal of Immunological Methods. 490, 112956 (2021).</li><li>Deeks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+tests+for+identification+of+current+and+past+infection+with+SARS-CoV-2.">Antibody tests for identification of current and past infection with SARS-CoV-2.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 6, 013652 (2020).</li><li>Mahalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+humoral+immune+responses+against+SARS-CoV-2+in+patients+with+COVID-19+disease+and+the+value+of+antibody+testing.">Landscape of humoral immune responses against SARS-CoV-2 in patients with COVID-19 disease and the value of antibody testing.</a> Heliyon. 7 (4), 06836 (2021).</li><li>Ruano-Gallego, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+antigen+microarray+for+simultaneous+IgG+and+IgM+detection+against+SARS-CoV-2+reveals+higher+seroprevalence+than+reported.">A multiplex antigen microarray for simultaneous IgG and IgM detection against SARS-CoV-2 reveals higher seroprevalence than reported.</a> Microbial Biotechnology. 14 (3), 1228-1236 (2021).</li><li>Shah, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+and+IgM+antibody+formation+to+spike+and+nucleocapsid+proteins+in+COVID-19+characterized+by+multiplex+immunoblot+assays.">IgG and IgM antibody formation to spike and nucleocapsid proteins in COVID-19 characterized by multiplex immunoblot assays.</a> BMC Infectious Diseases. 21 (1), 325 (2021).</li><li>Gambino, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+rapid+immunochromatographic+test+with+a+chemiluminescence+immunoassay+for+detection+of+anti-SARS-CoV-2+IgM+and+IgG.">Comparison of a rapid immunochromatographic test with a chemiluminescence immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG.</a> Biochemia Medica (Zagreb). 30 (3), 030901 (2020).</li><li>Algaissi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+and+N-based+serological+assays+reveal+rapid+seroconversion+and+induction+of+specific+antibody+response+in+COVID-19+patients.">SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients.</a> Scientific Reports. 10, 16561 (2020).</li><li>Chiereghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+evaluation+of+serological+assays+for+the+diagnosis+of+SARS-CoV-2+infection+and+COVID-19.">Recent advances in the evaluation of serological assays for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection and COVID-19.</a> Frontiers in Public Health. 8, 620222 (2020).</li><li>Nicol, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+SARS-CoV-2+serological+tests+for+the+diagnosis+of+COVID-19+through+the+evaluation+of+three+immunoassays:+Two+automated+immunoassays+(Euroimmun+and+Abbott)+and+one+rapid+lateral+flow+immunoassay+(NG+Biotech).">Assessment of SARS-CoV-2 serological tests for the diagnosis of COVID-19 through the evaluation of three immunoassays: Two automated immunoassays (Euroimmun and Abbott) and one rapid lateral flow immunoassay (NG Biotech).</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104511 (2020).</li><li>Butt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+multiplex+serology+to+serolomics-A+novel+approach+to+the+antibody+response+against+the+SARS-CoV-2+proteome.">From multiplex serology to serolomics-A novel approach to the antibody response against the SARS-CoV-2 proteome.</a> Viruses. 13 (5), 749 (2021).</li><li>Byrum, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=multiSero:+open+multiplex-ELISA+platform+for+analyzing+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+infection.">multiSero: open multiplex-ELISA platform for analyzing antibody responses to SARS-CoV-2 infection.</a> medRxiv. , (2021).</li><li>Dobano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+specific+multiplex+antibody+assays+to+quantify+immunoglobulins+m,+a,+and+g+against+SARS-CoV-2+antigens.">Highly sensitive and specific multiplex antibody assays to quantify immunoglobulins m, a, and g against SARS-CoV-2 antigens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 01731 (2021).</li><li>Schultz, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+multiplex+microsphere+immunoassay+using+dried+blood+spots+for+SARS-CoV-2+seroprevalence:+Application+in+first+responders+in+first+responders+in+Colorado,+USA.">Development and validation of a multiplex microsphere immunoassay using dried blood spots for SARS-CoV-2 seroprevalence: Application in first responders in first responders in Colorado, USA.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (6), 00290 (2021).</li><li>Beavis, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+EUROIMMUN+anti-SARS-CoV-2+ELISA+assay+for+detection+of+IgA+and+IgG+antibodies.">Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468 (2020).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+performance+of+a+semi-quantitative+assay+for+SARS-CoV2+IgG+and+SARS-CoV2+IgM+antibodies.">Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).</li></ol>

الدكتور بورجيا هو مخترع الاختبار المصلي المستخدم في هذه المخطوطة التي لا تزال بحاجة إلى براءة اختراع. يتم تقديم المقالة بطريقة وصفية فقط مع عدم تقديم تحليلات إحصائية لتجنب التحيز المحتمل الناجم عن صراع المؤلف.

وقد وصف تقدير الاستجابة المناعية للتعرض لفيروس سارس-كوف-2، بالاقتران مع الترصد القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل RT-PCR لحالة العدوى، بأنه وصفة طبية لتوضيح مسار التعافي من كوفيد-19، والعمل كوسيلة لتحديد بلازما النقاهة ذات القيمة العلاجية المحتملة، ومسح معدلات الإصابة على نطاق سكاني10,11. تشمل الأمثلة المختلفة لفهم التحويل المصلي لدى البشر صفائف البروتين (المستضد)12 ، والبقع المناعية 13 ، والتركيبات المناعية السريعة14 ، ومقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) 15،16،17. يمكن لكل من هذه التقنيات المذكورة أعلاه تقييم أنماط متعددة من الغلوبولين المناعي بشكل فردي مع تعديلات طفيفة. ومع ذلك، فإن هذه الإجراءات غير قابلة لإعادة استخدامها عمليا للسماح بإجراء تحليل مواز لأنماط متساوية متعددة، كما هو موضح في هذه المخطوطة، مما يجعل عوامل التكلفة والإنتاجية قيودا على إدارتها على استراتيجية اختبار على نطاق سكاني. توفر العديد من هذه التطبيقات أيضا الفرصة لتسلسل مستويات المستضدات المتعددة بالتوازي إما كما هو موضح أو في تنسيقات معدلة ، مثل ELISA18,19 متعدد الإرسال. وأخيرا، توفر منصة الخرزة المناعية إمكانية تقييم مستويات المستضدات المتعددة بالتوازي 20,21 ولكنها اقتصرت على ظهارة واحدة (أي النمط المتماثل للغلوبولين المناعي) لكل مقايسة ما لم يتم استخدام الأداة الحديثة ذات قدرات الفحص "ثنائية القناة".
في هذا التقرير ، يتم تعداد البروتوكولات التي تحدد القياس الموثوق به للظواهر المتعددة في فحص الخرز المناعي باستخدام الأداة في وضع "القناة المزدوجة" في دراسة حالة للتحويل المصلي للأفراد الذين تم تطعيمهم ب Covid-19. أظهرت الطريقة دقة ممتازة (قيم CV ٪ عادة <20٪) باستخدام تصميمات الفحص اليدوي التي يمكن تحسينها مع دمج الأنظمة الآلية المختبرية. وكانت حساسية الفحص والنطاق الديناميكي لجميع التحليلات والظواهر المختارة مناسبة للتقييمات الروتينية. على الرغم من أن عدم وجود كواشف مناعية مضادة للمستضد IgA و IgM متاحة تجاريا يحد من الكمية إلى النمط المتماثل IgG ، فإن مثل هذا التقييد لا يمنع القدرة على تقديم تقييمات أو تقييمات شبه كمية تتعلق بعينة معينة كعيار22,23.
تم تخصيص اختبار الخرزة المناعية التي تم التحقق منها للتحقيق في التحويل المصلي في مجموعة من الأفراد المحصنين بلقاح Covid-19. على النقيض من المنصات المماثلة الأخرى ، تسمح عائلة الأجهزة بالتنقيب عن التحويل المصلي في مئات الأفراد يوميا في سير عمل يدوي والآلاف يوميا في مخطط آلي. وعموما، تؤكد هذه النتائج أن نهج "القناة المزدوجة" لديه حساسية مناسبة لوصف ظواهر متعددة بالتوازي مع الفحص المطابق وهو قابل للتطبيق في سياق متعدد التحليلات. قد يبرر الاختلاف في الحساسيات تجاه القناة 1 والقناة 2 ، كما يتم إجراؤه باستخدام فلور phycoerythrin و Super Bright 436 ، على التوالي ، تصميم تجربة محددة لضمان الحصول على نتائج تحليلية قابلة للتطبيق لتجربة معينة. أي أن حجز القناة 1 للظواهر أو التحليلات ذات الانتشار المنخفض قد يكون ضروريا للحفاظ على نطاق ديناميكي للفحص يتضمن القيم المرصودة للمجهولين. وبعيدا عن هذا الاعتبار، كان تصميم الفحص واضحا وينبغي أن يكون متاحا بسهولة للمختبرات ذات القدرات التحليلية المحدودة. ومن المؤكد أنه ينبغي وزن هذا الاعتبار عند النظر في تداخل القناة 1 إلى القناة 2، كما أشرنا في الشكل 5، حيث قد يتسبب التداخل من الأنماط المتماثلة ذات الوفرة الأعلى في حدوث أخطاء تحليلية مضللة لأولئك الذين هم في وفرة أقل بكثير عند قياسها في نسق ثنائي القناة. وقد تمثل إمكانية التداخل هذه مع الحالات ذات التركيزات التحليلية المختلفة للغاية قيدا كبيرا على النهج إذا لم تعالج بشكل صحيح في مرحلة تصميم المقايسة.
في الختام ، تم تقديم طريقة لقياس عيارات الأجسام المضادة بسرعة من الأنماط المتماثلة الرئيسية للغلوبولين المناعي المرتبطة بالاستجابة المناعية لعدوى Covid-19 أو التطعيم. قد يوفر تطبيق هذا النهج بطريقة طولية لتقييم التحويل المصلي رؤى يمكن استخدامها بشكل أفضل لإدارة و / أو مراقبة مسار المرض أو ، بالتناوب ، توجيه برامج اللقاح المعززة ل Covid-19 المحتملة.

يسمح القياس المتزامن للمؤشرات الحيوية المتعددة المرتبطة بالأمراض في العينات البيولوجية برؤى وصفية وتنبؤية في العمليات المرضية. في حين أن الإجراءات المناعية التقليدية للتحليل الفردي، مثل مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs)، كانت حجر الزاوية في التحليلات الكمية في كل من الإعدادات السريرية والبحثية، يمكن أن يكون لهذه التقنيات قيود كبيرة فيما يتعلق بالإنتاجية، وكمية العينة المطلوبة لكل قياس، وفعالية التكلفة التي تحد إلى حد كبير من دراسة العناصر البيولوجية المتعددة التي غالبا ما تكون متشابكة طوال دورة المرض1 . أصبحت تقنية الإرسال المتعدد القائمة على الغلاف المجهري منصة لا غنى عنها لكل من مرافق التشخيص والبحث لقدرتها على الجمع بين الفحوصات لتعزيز الإنتاجية المختبرية ، والتخفيف من ندرة العينات ، والحد من الاختبارات المتكررة لتحقيق أقصى قدر من التوفير في التكاليف1،2،3،4. في الآونة الأخيرة ، تم إدخال المزيد من الزيادة في قوة الإرسال المتعدد هذه باستخدام أدوات تمتلك قدرات مراسل مزدوج. تنفذ ميزة المراسل المزدوج قناتين فلورسنتيتين للكشف ، مما يوفر بعدا آخر من الإرسال المتعدد ، مما يسمح بالكشف عن ظواهر متعددة على نفس التحليل.
فيروس كورونا 2 المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2) هو العامل الممرض المسؤول عن جائحة مرض فيروس كورونا الحالي 2019 (COVID-19)5. وفي حين أن اختبار RT-PCR أمر بالغ الأهمية لتأكيد العدوى في بداية دورة المرض، فقد ثبت أن الفحوص المصلية لعيارات الأجسام المضادة ضرورية للنقد الدقيق والكامل للأفراد فيما يتعلق بالتعرض السابق أو الشفاء؛ الاستجابة للتحصين؛ و / أو تقييم فعالية التطعيم ضد Covid-19 6,7.
يحدد هذا التقرير طرق قياس التحويل المصلي للمستضدات الفيروسية المتعددة ل SARS-CoV-2 التي تستخدم نظام الإبلاغ المزدوج القائم على التدفق والقارئ متعدد الإرسالات. على وجه التحديد ، يتم وصف الكشف المتزامن عن نوعين فرعيين من الأجسام المضادة (تم تكوينهما على أنهما IgG / IgM أو IgA / IgM) للوحة مستضدات SARS-CoV-2 3-plex التي تتضمن اختبارات للبروتينات السكرية Spike S1 و Nucleocapsid و Membrane (ويعرف أيضا باسم Matrix). يوفر هذا النهج مؤسسة مثالية لالتقاط التحويل المصلي الطولي ويساهم في أداة قيمة في الترسانة ضد جائحة Covid-19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well black side polystyrene microtiter plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-565-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, heat shock fraction</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A-7888-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS8574735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA35391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Albumin, Fraction V Powder</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2514-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB205009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB204009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB403009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB202009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62999842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Analyzer</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>INTELLIFLEX-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex-C Microspheres, Region XXX</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>MC10XXX-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate aluminum sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>07-200-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-751-7328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-V08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40591-V08H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40592-T62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-R0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb</td>
			<td>ProSci</td>
			<td>10-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>W-64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19

والتكنولوجيات المتعددة الإرسال لاستجواب المؤشرات الحيوية المتعددة متضافرة موجودة منذ عدة عقود؛ ومع ذلك ، فإن طرق تقييم ظواهر متعددة على نفس التحليل لا تزال محدودة. يصف هذا التقرير تطوير وتحسين مقايسة الخرزة المناعية متعددة الإرسال للاختبار المصلي لأنماط الغلوبولين المناعي الشائعة (مثل IgA و IgM و IgG) المرتبطة بالاستجابة المناعية لعدوى SARS-CoV-2 أو التطعيم. تم إجراء الفحوصات باستخدام قارئ فلورسنت متعدد الإرسال قائم على التدفق مع إمكانية القناة المزدوجة. ركزت التحسينات على وقت التقاط التحليل ، وتركيز الأجسام المضادة للكشف ، ووقت حضانة الأجسام المضادة الكشف. تم تحديد خصائص أداء المقايسة التحليلية (على سبيل المثال ، نطاق الفحص (بما في ذلك الحدود الدنيا والعليا للقياس الكمي) ؛ والدقة داخل وبين المقايسة) إما لمجموعة النمط المصلي IgG / IgM أو IgA / IgM جنبا إلى جنب باستخدام وضع "القناة المزدوجة". كانت أوقات التقاط التحليل البالغة 30 دقيقة ل IgG و 60 دقيقة ل IgM و 120 دقيقة ل IgA مناسبة لمعظم التطبيقات ، مما يوفر توازنا بين أداء الفحص والإنتاجية. وقد لوحظت حضانات الأجسام المضادة المثلى للكشف عند 4 ميكروغرام/مل لمدة 30 دقيقة، وهي موصى بها للتطبيقات العامة، نظرا للدقة الممتازة عموما (النسبة المئوية لمعامل التباين (٪ CV) ≤ 20٪) وقيم الحساسية التي لوحظت. امتد النطاق الديناميكي للنمط النظيري IgG لعدة أوامر من الحجم لكل فحص (Spike S1 و Nucleocapsid و Membrane glycoproteins) ، والذي يدعم تقييمات عيار قوية عند عامل تخفيف 1: 500 للتطبيقات السريرية. وأخيرا، تم تطبيق البروتوكول الأمثل لرصد التحويل المصلي لسبايك S1 للأشخاص (n = 4) الذين أكملوا نظام لقاح SARS-CoV-2. ضمن هذه المجموعة ، لوحظت مستويات Spike S1 IgG للوصول إلى الحد الأقصى من العيار في 14 يوما بعد إعطاء الجرعة الثانية ، عند كثافة إشارة أعلى بكثير (~ 40 ضعفا) من الأنماط المتماثلة IgM أو IgA. ومن المثير للاهتمام ، لاحظنا أن معدلات اضمحلال عيار Spike S1 IgG المتغيرة للغاية والتي كانت تعتمد إلى حد كبير على الموضوع قد لوحظت ، والتي ستكون موضوع الدراسات المستقبلية.

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

توضح هذه المقالة طريقة ملائمة لمراقبة التغيرات الديناميكية في عيارات الأجسام المضادة لنمطين متماثلين من الغلوبولين المناعي في وقت واحد (إما IgA أو IgM أو IgG) الناتجة عن استجابة مناعية لعدوى SARS-CoV-2 أو التطعيم. تستخدم "لوحة الاستجابة المناعية ل Covid-19 متعددة التحليلات" ثلاثة اختبارات مناعية غير مباشرة مبنية على الميكروسفير المشفر الذي تتم قراءته باستخدام قارئ متعدد الإرسال قائم على التدفق مع إمكانية "القناة المزدوجة".

المراقبة الديناميكية للتحويل المصلي باستخدام فحص الخرز المناعي متعدد التحليلات ل Covid-19

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

توفر الطريقة التي سنعرضها اليوم حلا عالي الإنتاجية لتقييم التحويل المصلي للأجسام المضادة المرتبطة إما بعدوى COVID-19 أو التطعيم للتحليلات الروتينية. ومن المثير للاهتمام أن هذا النهج يسمح لنا بتقييم ظواهر متعددة على نفس التحليل. هذا له العديد من التطبيقات في العلوم البيولوجية ، بما في ذلك دراسات إشارات الخلايا ومراقبة الاستجابات المناعية.سيوضح لك اليوم هذه التقنية الدكتور عماد ترهوني، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري. للبدء ، حدد ثلاث قوارير مختلفة من الميكروسفير المغناطيسي مع مناطق خرزة فريدة من نوعها وسجل معرف الخرزة ومعلومات الكثير لكل قارورة مستخدمة. ثم ، دوامة مخزون المجهر المحدد لمدة 60 ثانية وسونيكات لمدة خمس دقائق.انقل 1.0 في 10 إلى الخرز الستة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين 1.5 ملليلتر وأدخل الأنبوب في فاصل مغناطيسي. للسماح بالفصل لمدة 60 ثانية. مع بقاء الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة supernatant بعناية دون إزعاج حبيبات الخرزة.قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي ، ثم أعد تعليق الخرز ب 100 ميكرولتر من الماء والدوامة من فئة HPLC لمدة 30 ثانية. مرة أخرى ، ضع الأنبوب مرة أخرى في الفاصل المغناطيسي لمدة 60 ثانية ثم قم بإزالة supernatant. كرر بروتوكول الغسيل مرتين.بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الميكروسفير المغسول في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتنشيط ، الرقم الهيدروجيني 6.2 ، بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، عالج الميكروسفير بالتتابع ب 10 ميكرولترات من 50 ملليغرام لكل ملليلتر من أنهيدروكسي سلفوسوكسيناميد و 10 ميكرولترات من 50 ملليغرام لكل محلول EDC ملليلتر بواسطة دوامة لمدة 10 ثوان. في وقت لاحق ، احتضن الميكروسفير لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع دوامة لطيفة كل 10 دقائق.بعد الحضانة ، اغسل الميكروسفير مرتين باستخدام MES 50 مللي مولا أو المخزن المؤقت للاقتران ، الرقم الهيدروجيني 5.0 ، كما هو موضح سابقا. كرر الغسيل مرتين. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الخرز مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاقتران بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية ، تليها على الفور إضافة الكمية المطلوبة من البروتين إلى الأنبوب.ارفع الحجم الإجمالي إلى 150 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت للاقتران وامزج التفاعل بواسطة الدوامة لمدة 30 ثانية. ثم ، احتضن الأنبوب لمدة ساعتين عن طريق الدوران في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسل الميكروسفير مرتين باستخدام مخزن PBS العازل للإرواء وأعد تعليق الميكروسفير المغسول في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإرواء الذي يحتوي على 0.05٪ من أزيد الصوديوم بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية.عد عدد الميكروسفير المسترد باستخدام عداد خلية آلي وسجل تركيز الخرز المرصود. للحصول على أداء الفحص ، أعد تعليق الميكروسفير المقترن بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية وسونيكات لمدة 60 إلى 90 ثانية. ثم قم بإزالة الكمية المطلوبة من كل غرواني خرزة من الأنبوب المعني والجمع بين غرويات الخرز في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة.بعد ذلك ، أدخل الأنبوب في فاصل مغناطيسي واسمح بالفصل لمدة 60 ثانية. مع بقاء الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة supernatant دون إزعاج حبيبات الخرز. بعد إزالة الخرز من الفاصل ، أعد تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص.دوامة لمدة 30 ثانية قبل وضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي لمدة 60 ثانية لفصل الخرز. كرر الغسيل مرتين. بعد ذلك ، اضبط تركيز خليط المجهر العامل ثلاثي البلكس عن طريق إضافة حجم مناسب من المخزن المؤقت للفحص لتوليد تركيز نهائي قدره 100 ميكروسفير لكل ميكرولتر واحد لكل هدف.Aliquot 25 ميكرولتر من خليط المجهر في كل بئر من لوحة 96 بئر. تمييع عينات البلازما أو المصل 500 ضعف في المخزن المؤقت للفحص وإعداد العينات القياسية وفقا للمعايرة المطلوبة. أضف 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص كعينة فارغة وأضف كل عينة من العينات المخففة أو القياسية إلى كل بئر معين من لوحة عينة 96 بئرا.عند الانتهاء، قم بتغطية اللوحة بختم أو رقائق معدنية من الألومنيوم لتحضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر صفيحة مضبوط على 700 دورة في الدقيقة. قم بإعداد محلول من الأجسام المضادة للكشف عن الإنسان أو محاليل الأجسام المضادة الثانوية بمعدل أربعة ميكروغرام لكل ميكرولتر مع مخزن مؤقت للفحص كما هو موضح في المخطوطة. ضع الصفيحة على فاصل مغناطيسي لغسلها بسرعة ثم قم بعكس اللوحة بقوة فوق حاوية خطرة بيولوجيا لإزالة السائل من الآبار.مع بقاء اللوحة مقلوبة ، اضغط بقوة على اللوحة مقابل واد سميك من الورق. ثم اغسل كل بئر ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص وقم بإزالة السائل عن طريق الانعكاس القوي فوق حاوية المخاطر البيولوجية. كرر الغسيل مرتين.بعد الغسيل الأخير ، تخلص من جميع الوديان الورقية المستخدمة في حاوية للمخاطر البيولوجية. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولتر من محلول عمل الأجسام المضادة الثانوي إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا وقم بتغطية اللوحة بورق الألومنيوم لاحتضانها على شاكر صفيحة بمعدل 700 دورة في الدقيقة. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، اغسل آبار الطبق مرتين باستخدام مخزن الفحص العازل كما هو موضح سابقا.ثم أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص في كل بئر من لوحة 96 بئرا. غطي الطبق بورق الألمنيوم واحتضنيه لمدة خمس دقائق على شاكر الطبق في درجة حرارة الغرفة. قم بتحليل عينة سعة 60 ميكرولتر عبر محلل الأدوات وفقا لدليل النظام.لتحسين وقت حضانة التقاط العينات ، احتضن الألواح لمدة 30 و 60 و 120 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتحليل 60 ميكرولتر من خليط الفحص على المحلل. تم تقييم منحنى قياسي من سبع نقاط يعتمد على سلسلة تخفيف تسلسلية 1: 5 ل spike S1 ، والأجسام المضادة للغشاء ، و nucleocapsid.تم إجراء اختبار الدقة داخل الفحص على اللوحة لتقييم دقة المقايسة المحسوبة كمعامل النسبة المئوية للتباين والانحراف المعياري والمتوسط. من أجل دقة الفحص البيني ، تم إعداد ثلاث دفعات متميزة من مجموعات الخرز لكل فحص. تم حساب المتغيرات الدقيقة للفحص مع المعيار وعينات البلازما البشرية.كان متوسط قيم كثافة الفلورسنت المتوسطة في 120 دقيقة من الحضانة مثاليا لعيار IgG للسبايك S1 والغشاء والأجسام المضادة للنيوكليوكابسيد ، مما يشير إلى حركية ربط الأجسام المضادة الأولية السريعة. أظهرت تحسينات تركيز الأجسام المضادة الثانوية في أداء القناة المزدوجة مجموعة واسعة من الإشارات في القياس الخطي لجميع التركيزات. يتم عرض الإشارات المرصودة من حضانات زمنية مختلفة للأجسام المضادة الثانوية والتفاصيل المتعلقة بتغيرات الإشارة لجميع أوقات الحضانة هنا.وفي تقييمات خصوصية المقايسات ثنائية القناة، لوحظ تلوث ضئيل بالإشارات المتقاطعة بين القناة الفارغة وقناة المراسل الواحدة. في الرسم التوضيحي لأحداث التحويل المصلي بعد التطعيم ضد كوفيد 19، كانت قيم الارتفاع المرصودة S1 IgA و IgM أقل بنحو 40 ضعفا من عيارات النمط المتماثل IgG. هذه الطريقة لها آثار مهمة على رصد الاستجابة للقاحات لدى الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة.سيسمح لنا بتحديد ما إذا كان هؤلاء المرضى يحصلون حقا على الحماية من تلك اللقاحات.

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

الكمية التصور والكشف عن سرطان الجلد باستخدام التصوير الحراري الديناميكي

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Computerized Dynamic Posturography for Postural Control Assessment in Patients with Intermittent Claudication

Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic ...

Dynamic Lung Tumor Tracking for Stereotactic Ablative Body Radiation Therapy

ديناميكية الرئة تتبع ورم لالمجسم صيغة الجر الجسم العلاج الإشعاعي

Physicians considering stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) for the treatment of extracranial cancer targets must be aware of the sizeable ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

بروتوكول مفصل لرصد العرق عن طريق رواية والصغيرة، جهاز لاسلكي

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

تحديد مثبطات التفاعل HBx-DDB1 باستخدام نظام الفحص التحليلي المنقسم

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Evaluation of Capnography Sampling Line Compatibility and Accuracy when Used with a Portable Capnography Monitor

تقييم التوافق خط أخذ عينات Capnography والدقة عند استخدامها مع مراقبة كابنوغرافيا المحمولة

Capnography is commonly used to monitor patient&#8217;s ventilatory status. While sidestream capnography has been shown to provide a reliable assessment ...

Real-Time Dynamic Navigation System for the Precise Quad-Zygomatic Implant Placement in a Patient with a Severely Atrophic Maxilla

نظام ملاحة ديناميكي في الوقت الفعلي لوضع الغرسة الرباعية الوجنية الدقيقة في مريض مصاب بضامر شديد الفك العلوي

Zygomatic implants (ZIs) are an ideal way to address cases of a severely atrophic edentulous maxilla and maxilla defects because they replace extensive ...

Dynamic Navigation for Dental Implant Placement

التنقل الديناميكي لوضع زراعة الأسنان

In modern implantology, the application of surgical navigation systems is becoming increasingly important. In addition to static surgical navigation ...

A Surgical Model of Heart Failure with Preserved Ejection Fraction in Tibetan Minipigs

نموذج جراحي لفشل القلب مع الكسر القذفي المحفوظ في الخنازير الصغيرة التبتية

More than half of heart failure (HF) cases are classified as heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) worldwide. Large animal models are ...

Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

الملاحة الديناميكية في علاج جذور الأسنان: إعداد تجويف الوصول الموجه عن طريق نظام ملاحة مصغر

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...