Name: dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

作者希望感谢Rush生物标志物开发核心使用其设施，Rush Biorepository用于受试者注册和生物标本处理，以及Walder基金会的芝加哥冠状病毒评估网络（Chicago CAN）倡议拨款编号SCI16（J.R.S.和J.A.B.）和21-00147（J.R.S.和J.A.B.）以及游泳穿越美国基金会（J.A.B.）的奖项。

所有受试者均在书面知情同意下入组，并得到拉什大学医学中心机构审查委员会（IRB）的完全批准，该协议ORA 20101207遵守伦理研究行为的所有机构指南。通过常规放血术将血液收集到薰衣草真空吸尘器（K2EDTA）中，并使用推荐的方案进行处理。将得到的血浆在-80°C下存档，直到进行评估。
1. 抗原偶联微球的制备
<ol><li>选择三个不同的磁微球小瓶，具有独特的磁珠区域，记录每个使用的微孔的磁珠ID和批次信息。 注意：对于每个不同的微球区域，将遵循以下步骤。微球对光敏感，应避免长时间暴露在光线下。在洗涤步骤中，请注意不要干扰微球。如果受到干扰，允许第二次60秒的分离。</li>
	<li>涡旋微球储备60秒，超声处理5分钟，然后使用解离聚集的珠子。</li>
	<li>将 1.0 x 106 个磁珠转移到 1.5 mL 低蛋白结合微量离心管中。</li>
	<li>将管子插入磁选机中，并允许分离60秒。当管子仍在磁选机中时，小心地除去上清液而不干扰珠粒。</li>
	<li>从磁选机中取出管子，用100μLHP级水重悬磁珠，涡旋30秒。将管放回磁选机中60秒，然后除去上清液。重复此洗涤方案两次。</li>
	<li>从磁选机中取出管子，并通过涡旋将洗涤的微球重悬于90μL100mM单基磷酸钠，pH 6.2（活化缓冲液）中30秒。</li>
	<li>向微球中加入10μL50mg / mL磺基NHS（用活化缓冲液稀释）并轻轻涡旋10秒。加入10μL50mg / mL EDC溶液（用活化缓冲液稀释）并轻轻涡旋10秒。在室温（RT）下孵育微球20分钟，每10分钟进行一次温和的涡旋。</li>
	<li>用50 mM MES重复洗涤步骤1.4-1.5，pH 5.0（耦合缓冲液）代替LC / MS级水，总共两次洗涤。</li>
	<li>从磁选机中取出管子，并通过涡旋将微球与100μL耦合缓冲液重悬30秒，然后立即加入所需量的蛋白质。</li>
	<li>使用偶联缓冲液使总体积达到150μL。通过涡流混合偶联反应30 s，并在室温下旋转孵育2小时。 注意：对于本文定义的测定，用以下蛋白质浓度进行偶联：Spike S1：5μg;核衣壳： 5 微克;膜：12.5微克。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲盐（PBS）-1%山羊血清白蛋白，0.01%聚山梨醇酯-20（淬火缓冲液）代替LC / MS级水重复洗涤步骤1.4，共洗涤两次。通过涡旋将洗涤的微球重悬于含有0.05%叠氮化钠的100μL淬灭缓冲液中30秒。 注意：在进行任何其他程序之前，允许珠子完全淬灭至少6小时。</li>
	<li>使用自动细胞计数器或血细胞计数器计数回收微球的数量。记录观察到的磁珠浓度。</li>
	<li>在黑暗中将耦合的微球在4°C下冷藏。</li>
</ol>2. 程序
<ol><li>检测性能（基本方案）<ol>
<li>通过涡流重悬耦合的微球30 s，超声处理〜60-90 s。</li>
		<li>从相应的管中取出所需量的每个胶体，并将珠胶体组合在新的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>将管子插入磁选机，并允许分离60秒。当管子仍在磁选机中时，小心地除去上清液而不干扰珠粒。</li>
		<li>从分离器中取出珠子，用100μLPBS-1%牛血清白蛋白，0.01%聚山梨醇酯-20（测定缓冲液）重悬微球，并涡旋30秒。将管子放入磁选机中，并允许分离60秒。重复此洗涤方案（即步骤2.1.3-2.1.4）两次</li>
		<li>通过添加适当体积的测定缓冲液来调节3-plex工作微球混合物的浓度，以为每个靶标产生每1μL100个微球的最终浓度。</li>
		<li>等分试样将步骤2.1.5制备的微球混合物等分试样放入384孔板的每个孔中或将25μL放入96孔板的每个孔中。</li>
		<li>在测定缓冲液中将血浆/血清标本稀释500倍。根据所需的滴定制备标准试样。</li>
		<li>加入12.5μL测定缓冲液作为空白样品，并将每个稀释的样品或标准品加入384孔样品板的每个指定孔中，或将25μL空白，稀释的样品或标准品加入96孔样品板的每个孔中。</li>
		<li>用铝密封或铝箔覆盖板，并在设置为700 rpm的平板振荡器上以RT孵育1小时。 注：稀释曲线示意图见 表1。</li>
		<li>按照步骤2.1.11中规定的测定缓冲液，以4μg/ mL制备抗人检测抗体（二抗溶液）溶液。</li>
		<li>制备山羊抗人IgM，与超亮436（SB）/山羊抗人IgA结合，藻红素（PE）偶联物检测抗体在4μg/ mL;或山羊抗人IgM，SB偶联物/山羊抗人IgG，PE偶联物检测抗体在4μg/ mL。 注意：对于384孔板格式，需要12.5μL/孔制备的二抗溶液，对于96孔板格式，需要25μL /孔。</li>
		<li>将板放在磁选机上，快速洗涤，然后用力倒置在生物危害容器上以从孔中除去液体。在盘子仍然倒置的情况下，用力将盘子拍打在厚厚的纸上。</li>
		<li>如前所述，用100μL测定缓冲液洗涤每个孔，并通过在生物危害容器上强力倒置除去液体。重复这些步骤（2.1.12-2.1.13），总共进行两次洗涤。将所有用过的纸张丢弃到生物危害容器中。</li>
		<li>向384孔板的每个孔中加入12.5μL二抗工作溶液，或向96孔板的每个孔中加入25μL。用铝密封或铝箔覆盖板，并在设置为700rpm的板振荡器上以RT孵育30分钟。</li>
		<li>重复洗涤步骤 2.1.12-2.1.13</li>
		<li>将75μL测定缓冲液加入384孔板的每个孔中，或将100μL加入96孔板的每个孔中。用铝密封或铝箔覆盖板，并在设置为700rpm的板振荡器上以RT孵育5分钟。</li>
		<li>根据系统手册，通过仪器分析仪分析 60 μL。</li>
	</ol></li>
	<li>优化标本捕获孵育时间<ol>
<li>在步骤2.1.9中使用30分钟，60分钟和120分钟的孵育时间的持续时间执行2.1节中的步骤。 注意：可以使用不同的板进行孵育，也可以通过在步骤2.1.6暂停进行，直到进入步骤2.1.9为止。达到所需的孵化时间。</li>
		<li>根据制造商的建议，使用60μL测定混合物在分析仪上继续板读数。</li>
	</ol></li>
	<li>二抗浓度优化<ol>
<li>按照第2.1节中的详细说明执行此过程，但二抗工作溶液（在步骤2.1.10-2.1.11中制备）中试剂的最终浓度除外，修改如下： 山羊抗人（或兔子）IgM，SB结合物检测抗体在8，4，2，1和0.5μg/ mL。 山羊抗人（或兔）IgA，PE偶联物检测抗体在8，4，2，1和0.5μg/ mL。 山羊抗人（或兔）IgG，PE偶联物检测抗体在8，4，2，1和0.5μg/ mL。 山羊抗人（或兔）IgG，PE偶联物/山羊抗人（或兔）IgM，SB偶联物检测抗体，8，4，2，1和0.5μg/ mL。 山羊抗人（或兔）IgA，PE偶联物/山羊抗人（或兔）IgM，SB偶联物检测抗体，8，4，2，1和0.5μg/ mL。</li>
		<li>根据制造商的建议，使用60μL测定混合物在分析仪上继续板读数。</li>
	</ol></li>
	<li>优化二抗孵育时间<ol>
<li>按照步骤2.1.14中定义的孵育持续时间15分钟，30分钟，60分钟和120分钟执行2.1节中详述的该过程。</li>
		<li>根据制造商的建议，使用60μL测定混合物在分析仪上继续板读数。</li>
	</ol></li>
	<li>使用优化的双通道检测法评估受试者标本<ol>
<li>在与完成Covid-19疫苗（即第二剂）给药相关的第-21、-11、-1/0、+14、+28、+60、+90和+120天收集受试者血浆样本（n = 4）。 注意：第0天表示完成疫苗接种的时间点。</li>
		<li>使用基础方案（第2.1节）作为IgG / IgM或IgA / IgM双通道测定进行所有测定。</li>
		<li>将结果归一化到每个特定免疫球蛋白和测定的最大观察到的中位荧光强度（MFI）值。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+in+the+multiplex+era:+potentials+and+pitfalls.">ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls.</a> Proteomics - Clinical Applications. 9, 406-422 (2015).</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4084 (2012).</li><li>Powell, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere-based+immunoassay+increases+the+sensitivity+of+siv-specific+antibody+detection+in+serum+samples+and+mucosal+specimens+collected+from+rhesus+macaques+infected+with+SIVmac239.">A multiplex microsphere-based immunoassay increases the sensitivity of siv-specific antibody detection in serum samples and mucosal specimens collected from rhesus macaques infected with SIVmac239.</a> BioResearch Open Access. 2 (3), 171-178 (2013).</li><li>Volpetti, F., Garcia-Cordero, J., Maerkl, S. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+EUROIMMUN+anti-SARS-CoV-2+ELISA+assay+for+detection+of+IgA+and+IgG+antibodies.">Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468 (2020).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+performance+of+a+semi-quantitative+assay+for+SARS-CoV2+IgG+and+SARS-CoV2+IgM+antibodies.">Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).</li></ol>

Borgia博士是本手稿中使用的血清学测试的发明者，该手稿正在申请专利。本文仅以描述性方式呈现，没有提供统计分析，以避免作者冲突引入的潜在偏见。

对SARS-CoV-2暴露的免疫反应的欣赏，结合基于RT-PCR的感染状况监测，已被很好地描述为澄清Covid-19恢复过程的处方，作为识别具有潜在治疗价值的恢复期血浆的一种手段，并在人群规模的基础上调查感染率10，11。了解人类受试者血清转换的不同例子包括蛋白质（抗原）阵列12，免疫印迹13，快速免疫层析构建体14和酶联免疫吸附测定（ELISA）15，16，17。上述每种技术都可以单独评估多种免疫球蛋白同种型，只需稍作修改。然而，这些程序实际上无法被重新利用，以允许对多种同种型进行并行分析，如本手稿所述，将成本和通量因素作为基于人群的规模测试策略管理的限制。其中一些应用还提供了并行连接多种抗原水平的机会，如呈现的或改变的格式，例如多重ELISA18，19。最后，免疫珠平台提供了并行20，21 评估多种抗原水平的可能性，但仅限于每次测定的单个表位（即免疫球蛋白同种型），除非使用具有“双通道”测定功能的最新仪器。
在本报告中，列举了在免疫珠测定中使用仪器在“双通道”模式下对多种表位进行可靠测量的方案，这些方案是Covid-19疫苗接种个体血清转换的案例研究。该方法使用手动测定设计表现出出色的精度（%CV值通常为<20%），这些设计可以通过集成实验室自动化系统进行改进。所有选定分析物和表位的测定灵敏度和动态范围均适用于常规评估。尽管缺乏市售抗抗抗原 IgA 和 IgM 免疫反应原限制了 IgG 同种型的定量，但这种限制并不排除提供半定量评估或相对于特定标本（作为校准剂22，23）的评估的能力。
经过验证的免疫珠测定被分配用于研究一组接种了Covid-19疫苗的个体的血清转换。与其他类似平台相比，该仪器系列允许在手动工作流程中每天在数百个人中发现血清转换，在自动化方案中每天发现数千人血清转换。总体而言，这些发现证实，“双通道”方法对于同一测定中并行描述多个表位具有适当的敏感性，并且在多分析物上下文中是可行的。分别使用藻红素和超亮436荧光团进行的通道1和通道2的灵敏度差异可能需要设计特定的实验，以确保为给定的实验获得可行的分析结果。也就是说，为患病率较低的表位或分析物保留通道1可能是必要的，以维持包括未知值的观察值的测定的动态范围。除了这一考虑之外，分析设计是显而易见的，分析能力有限的实验室应该很容易获得。当然，在考虑信道1到信道2的干扰时，应该权衡这一考虑因素，正如我们 在图5中指出的那样，当以双通道格式测量时，来自高丰度同种型的干扰可能会对那些丰度低得多的干扰造成误导性的分析误差。如果在测定设计阶段处理不当，这种干扰分析物浓度高度不同的情况的可能性可能代表对方法的重大限制。
总之，提出了一种快速测量与Covid-19感染或疫苗接种的免疫反应相关的主要免疫球蛋白同种型的抗体滴度的方法。以纵向方式应用这种方法来评估血清转换可以提供见解，这些见解可以更好地用于管理和/或监测疾病过程，或者指导潜在的Covid-19加强疫苗计划。

同时测量生物样品中多种与疾病相关的生物标志物，可以对病理过程进行描述性和预测性分析。虽然传统的单一分析物免疫学程序，如酶联免疫吸附测定（ELISA），一直是临床和研究环境中定量分析的基石，但这些技术在通量、每次测量所需的标本数量以及成本效益方面可能存在重大限制，这些因素极大地限制了在整个病程中经常交织在一起的多种生物元素的研究1.基于微球的多路复用技术已成为诊断和研究设施不可或缺的平台，因为它能够结合分析以提高实验室通量，减轻样品稀缺性，并减少重复测试，从而最大限度地节省成本1，2，3，4。最近，通过具有双报告器功能的仪器进一步增强了这种多路复用能力。双报告基因功能实现了两个用于检测的荧光通道，提供了另一个维度的多重检测，允许在同一分析物上检测多个表位。
严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是当前2019年冠状病毒病（COVID-19）大流行5的病原体。虽然RT-PCR检测对于在病程开始时确认感染至关重要，但抗体滴度的血清学检查已被证明对于准确和完整地批评个体先前的暴露或恢复至关重要;对免疫接种的反应;和/或评估Covid-19疫苗接种效果6，7。
本报告描述了利用基于流的多重阅读器双重报告系统测量多种SARS-CoV-2病毒抗原血清转换的方法。具体而言，描述了针对 3-plex SARS-CoV-2 抗原组合（包括 Spike S1、核衣壳体和膜（又名基质）糖蛋白的测定）的两种抗体亚型（配置为 IgG/IgM 或 IgA/IgM）的并发检测。这种方法为捕获纵向血清转换提供了理想的企业，并为抗击Covid-19大流行提供了宝贵的工具。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well black side polystyrene microtiter plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-565-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, heat shock fraction</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A-7888-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS8574735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA35391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Albumin, Fraction V Powder</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2514-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB205009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB204009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB403009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB202009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62999842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Analyzer</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>INTELLIFLEX-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex-C Microspheres, Region XXX</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>MC10XXX-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate aluminum sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>07-200-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-751-7328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-V08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40591-V08H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40592-T62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-R0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb</td>
			<td>ProSci</td>
			<td>10-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>W-64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19

用于协同询问多种生物标志物的多重技术已经存在了几十年;然而，在同一分析物上评估多个表位的方法仍然有限。本报告介绍了一种多重免疫珠测定的开发和优化，该测定法用于对与 SARS-CoV-2 感染或疫苗接种的免疫反应相关的常见免疫球蛋白同种型（例如 IgA、IgM 和 IgG）进行血清学检测。使用具有双通道功能的基于流动的多重荧光阅读器完成测定。优化侧重于分析物捕获时间、检测抗体浓度和检测抗体孵育时间。使用“双通道”模式为IgG / IgM或IgA / IgM血清型组合建立了分析测定性能特征（例如，测定范围（包括定量的下限和上限）;以及测定内和测定间精度）。IgG的分析物捕获时间为30分钟，IgM为60分钟，IgA的分析物捕获时间为120分钟，适用于大多数应用，从而提供了测定性能和通量的平衡。观察到最佳检测抗体在4μg/ mL下孵育30分钟，并推荐用于一般应用，给定整体出色的精度（百分比方差系数（%CV）≤20%）和观察到的灵敏度值。对于每种测定（Spike S1，核衣壳和膜糖蛋白），IgG同种型的动态范围跨越了几个数量级，这支持在临床应用中以1：500稀释因子进行稳健的滴度评估。最后，将优化方案应用于监测完成SARS-CoV-2疫苗方案的受试者（n = 4）的Spike S1血清转换。在该队列中，观察到Spike S1 IgG水平在第二次给药后14天达到最大滴度，其信号强度远高于IgM或IgA同种型（约40倍）。有趣的是，我们观察到高度可变的Spike S1 IgG滴度衰减率在很大程度上取决于受试者，这将是未来研究的主题。

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Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

本文介绍了一种方便的方法，用于同时监测两种免疫球蛋白同种型（IgA、IgM 或 IgG）的抗体滴度的动态变化，这些变化是由对 SARS-CoV-2 感染或疫苗接种的免疫反应引起的。该“多分析物Covid-19免疫反应面板”采用三种基于编码微球的间接免疫测定，这些微球使用具有“双通道”功能的基于流的多路复用读取器读取。

使用多分析物免疫珠测定法对Covid-19进行血清转换的动态监测

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

我们今天将要演示的方法提供了一种高通量解决方案，用于评估与COVID-19感染或常规分析疫苗接种相关的抗体的血清转换。有趣的是，这种方法使我们能够评估同一分析物上的多个表位。这在生物科学中有许多应用，包括细胞信号研究和监测免疫反应。今天为你们展示这种技术的将是Imad Tarhoni博士，他是我实验室的博士后研究员。首先，选择三个具有不同磁珠区域的磁性微球小瓶，并记录每个所用小瓶的磁珠ID和批次信息。然后，将选定的微球储备涡旋60秒，超声处理5分钟。将1.0倍10倍转移到6个珠子中，放入1.5毫升低蛋白结合微量离心管中，然后将管插入磁选机中。允许分离 60 秒。当管子仍在磁选机中时，小心地除去上清液而不干扰珠粒。从磁选机上取下管子，然后用100微升HPLC级水和涡旋30秒重新悬浮磁珠。再次，将管放回磁选机中60秒，然后取出上清液。重复洗涤方案两次。最后一次洗涤后，从磁选机中取出管子，并将洗涤的微球重悬于90微升活化缓冲液中，pH 6.2，涡旋30秒。接下来，依次用10微升50毫克/毫升的羟基磺基琥珀酰胺和10微升每毫升50毫克的EDC溶液通过涡旋处理微球10秒。之后，将微球在室温下孵育20分钟，每10分钟进行一次温和的涡旋。孵育后，如前所述，用50毫摩尔MES或偶联缓冲液pH 5.0洗涤微球两次。重复洗涤两次。完成后，从磁选机中取出管子，并通过涡旋将珠子与100微升偶联缓冲液重悬30秒，然后立即向管中加入所需量的蛋白质。用偶联缓冲液将总体积达到150微升，并通过涡旋混合反应30秒。然后，在室温下旋转将试管孵育两小时。孵育后，用PBS淬火缓冲液洗涤微球两次，并将洗涤的微球重悬于100微升含有0.05%叠氮化钠的淬火缓冲液中，涡旋30秒。使用自动细胞计数器计算回收微球的数量，并记录观察到的微球浓度。为了获得测定性能，通过涡旋重悬耦合的微球30秒，超声处理60至90秒。然后，从相应的管中取出所需量的每个珠胶体，并将珠胶体组合在新的1.5毫升微量离心管中。接下来，将管子插入磁选机中，并分离60秒。当管子仍在磁选机中时，在不干扰珠粒的情况下除去上清液。从分离器中取出磁珠后，将磁珠重悬于100微升测定缓冲液中。涡旋30秒，然后将管子放入磁选机中60秒以分离珠子。重复洗涤两次。接下来，通过添加适当体积的测定缓冲液来调节三重工作微球混合物的浓度，以为每个靶标产生每微升100微球的最终浓度。将25微升的微球混合物等分试样放入96孔板的每个孔中。在测定缓冲液中将血浆或血清标本稀释500倍，并根据所需的滴定制备标准样品。加入25微升测定缓冲液作为空白样品，并将每个稀释的样品或标准品加入96孔样品板的每个指定孔中。完成后，用铝封或铝箔盖住板，在室温下在设置为每分钟700转的板振荡器上孵育一小时。如手稿中所述，用测定缓冲液以每微升四微克制备抗人检测抗体或二抗溶液的溶液。将板放在磁选机上快速洗涤，然后用力将板倒置在生物危害容器上以从孔中除去液体。在盘子仍然倒置的情况下，用力将盘子拍打在厚厚的纸上。然后，用100微升测定缓冲液洗涤每个孔，并通过在生物危害容器上强力倒置除去液体。重复洗涤两次。最后一次洗涤后，将所有用过的纸丢弃到生物危害容器中。接下来，向96孔板的每个孔中加入25微升的二抗工作溶液，并用铝箔覆盖板，以每分钟700旋转在板振荡器上孵育。孵育30分钟后，如前所述，用测定缓冲液洗涤板的孔两次。然后，向96孔板的每个孔中加入100微升测定缓冲液。用铝箔盖住板，并在室温下在板振荡器上孵育五分钟。根据系统手册，通过仪器分析仪分析 60 微升样品。为了优化样品捕获孵育时间，将板孵育30，60和120分钟。孵育后，在分析仪上分析60微升的测定混合物。基于1：5连续稀释系列的7点标准曲线评估了尖峰S1，膜抗体和核衣壳。在板上进行测定内精度测试，以评估以变异系数，标准偏差和平均值计算的测定精度。为了测定间的精确性，为每个测定制备了三个不同批次的磁珠组。用标准品和人血浆样品计算测定的精确变量。孵育120分钟时的平均中位荧光强度值对于刺突S1，膜和核衣壳抗体的IgG滴度是最佳值，表明一抗结合动力学快。双通道性能的二抗浓度优化表明，在所有浓度的线性测量中，信号范围很广。这里显示了来自二抗不同时间孵育的观察到的信号以及所有孵育时间的信号变化的详细信息。在双通道测定的特异性评估中，在空白通道和单报告通道之间观察到可忽略不计的交叉信号污染。在COVID 19疫苗接种后血清转换事件的图示中，观察到的峰值S1 IgA和IgM值比IgG同种型滴度低约40倍。该方法对于监测免疫功能低下个体对疫苗的反应具有重要意义。这将使我们能够确定这些患者是否真的受到这些疫苗接种的保护。

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

定量可视化和皮肤癌症使用动态热成像检测

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

科研

医学

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Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic ...

Dynamic Lung Tumor Tracking for Stereotactic Ablative Body Radiation Therapy

动态肺肿瘤跟踪烧蚀立体定向放射身体治疗

Physicians considering stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) for the treatment of extracranial cancer targets must be aware of the sizeable ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

详细的汗渍监控协议使用一种新的，小的，无线设备

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

使用分体路西酶测定系统识别 HBx-DDB1 相互作用的抑制剂

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Evaluation of Capnography Sampling Line Compatibility and Accuracy when Used with a Portable Capnography Monitor

与便携式刻度学监视器一起使用时，评估卡光采样线兼容性和准确性

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Real-Time Dynamic Navigation System for the Precise Quad-Zygomatic Implant Placement in a Patient with a Severely Atrophic Maxilla

实时动态导航系统，用于在严重萎缩性上颌骨患者中精确放置四颧植入物

Zygomatic implants (ZIs) are an ideal way to address cases of a severely atrophic edentulous maxilla and maxilla defects because they replace extensive ...

Dynamic Navigation for Dental Implant Placement

种植牙的动态导航

In modern implantology, the application of surgical navigation systems is becoming increasingly important. In addition to static surgical navigation ...

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Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...