Name: dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

Les auteurs souhaitent remercier le Rush Biomarker Development Core pour l’utilisation de leurs installations, le Rush Biorepository pour l’inscription des sujets et le traitement des échantillons biologiques, et les numéros de subvention SCI16 (J.R.S. et J.A.B.) et 21-00147 (J.R.S. et J.A.B.) de l’Initiative du Chicago Coronavirus Assessment Network (Chicago CAN) de la Walder Foundation et un prix de la Swim Across America Foundation (J.A.B.).

Tous les sujets ont été inscrits avec un consentement éclairé écrit avec l’approbation complète du Conseil d’examen institutionnel (IRB) du Rush University Medical Center en vertu du protocole ORA 20101207 avec toutes les directives institutionnelles pour la conduite de la recherche éthique observée. Le sang a été recueilli par phlébotomie conventionnelle dans des vacutainers de lavande (K2EDTA) et traité avec les protocoles recommandés. Le plasma résultant a été archivé à -80 °C jusqu’à ce que des évaluations soient effectuées.
1. Préparation de microsphères conjuguées à l’antigène
<ol><li>Sélectionnez trois flacons différents de microsphères magnétiques avec des régions de perles uniques, en enregistrant l’ID de perle et les informations de lot pour chaque flacon utilisé. REMARQUE: Les étapes suivantes seront suivies pour chaque région de microsphère distincte. Les microsphères sont sensibles à la lumière et doivent être protégées d’une exposition prolongée à la lumière. Lors des étapes de lavage, veillez à ne pas déranger les microsphères. En cas de perturbation, prévoyez une deuxième séparation de 60 s.</li>
	<li>Vortex le stock de microsphère pendant 60 s et sonicate pendant 5 min avant utilisation pour dissocier les billes agrégées.</li>
	<li>Transférer 1,0 x 106 billes dans des tubes de microcentrifugation à faible teneur en protéines de 1,5 mL.</li>
	<li>Insérez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 s. Avec le tube toujours dans le séparateur magnétique, retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille de perle.</li>
	<li>Retirez le tube du séparateur magnétique, remettez en suspension les billes avec 100 μL d’eau de qualité HPLC et vortex pendant 30 s. Replacez le tube dans le séparateur magnétique pendant 60 s, puis retirez le surnageant. Répétez ce protocole de lavage deux fois.</li>
	<li>Retirer le tube du séparateur magnétique et remettre en suspension les microsphères lavées dans 90 μL de phosphate de sodium monobasique de 100 mM, pH 6,2 (tampon d’activation) par vortex pendant 30 s.</li>
	<li>Ajouter 10 μL de 50 mg/mL de Sulfo-NHS (dilué avec un tampon d’activation) aux microsphères et vortex doucement pendant 10 s. Ajouter 10 μL de solution d’EDC à 50 mg/mL (diluée avec un tampon d’activation) et vortex doucement pendant 10 s. Incuber des microsphères pendant 20 min à température ambiante (RT) avec un léger vortex toutes les 10 min.</li>
	<li>Répétez les étapes de lavage 1,4 à 1,5 avec 50 mM MES, pH 5,0 (tampon de couplage) au lieu d’eau de qualité LC / MS pour un total de deux lavages.</li>
	<li>Retirez le tube du séparateur magnétique et remettez en suspension les billes avec 100 μL de tampon de couplage par vortex pendant 30 s suivi immédiatement de l’ajout de la quantité de protéine souhaitée.</li>
	<li>Porter le volume total à 150 μL avec le tampon de couplage. Mélanger la réaction de couplage par vortex pendant 30 s et incuber pendant 2 h par rotation à RT. NOTE: Pour les essais définis ici, des conjugaisons ont été effectuées avec les concentrations de protéines suivantes: Spike S1: 5 μg; Nucléocapside: 5 μg; Membrane : 12,5 μg.</li>
	<li>Répétez l’étape de lavage 1.4 avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)-1 % d’albumine sérique de chèvre, 0,01 % de polysorbate-20 (tampon de trempe) au lieu d’eau de qualité LC/MS pour un total de deux lavages. Remettre en suspension les microsphères lavées dans 100 μL de tampon de trempe contenant 0,05 % d’azoture de sodium par vortex pendant 30 s. REMARQUE: Laissez les perles se tremper complètement pendant au moins 6 heures avant de procéder à toute autre procédure.</li>
	<li>Comptez le nombre de microsphères récupérées à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre. Notez la concentration de billes observée.</li>
	<li>Réfrigérer les microsphères couplées à 4 °C dans l’obscurité.</li>
</ol>2. Procédures
<ol><li>Performances du test (protocole de base)<ol>
<li>Resuspendez les microsphères couplées par vortex pendant 30 s et soniquez pendant ~60-90 s.</li>
		<li>Retirez la quantité requise de chaque colloïde de bille du tube respectif et combinez les colloïdes de perles dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL.</li>
		<li>Insérez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 secondes. Avec le tube toujours dans le séparateur magnétique, retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille de perle.</li>
		<li>Retirez les billes du séparateur, remettez en suspension les perles avec 100 μL d’albumine sérique bovine PBS-1%, 0,01% de polysorbate-20 (tampon d’essai) et vortex pendant 30 s. Placez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 s. Répétez ce protocole de lavage (c.-à-d. les étapes 2.1.3 à 2.1.4) deux fois.</li>
		<li>Ajuster la concentration du mélange de microsphères de travail 3-plex en ajoutant un volume approprié de tampon d’essai pour générer une concentration finale de 100 microsphères par 1 μL pour chaque cible.</li>
		<li>Aliquote 12,5 μL du mélange de microsphère préparé à l’étape 2.1.5 dans chaque puits d’une plaque de 384 puits ou 25 μL dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.</li>
		<li>Diluer les échantillons de plasma/sérum 500 fois dans le tampon d’essai. Préparer les spécimens standard selon le titrage souhaité.</li>
		<li>Ajouter 12,5 μL de tampon d’essai comme échantillon à blanc et ajouter chacun de l’échantillon dilué ou de l’étalon dans chaque puits désigné d’une plaque d’échantillon de 384 puits ou 25 μL de l’échantillon ou de l’étalon à blanc dilué dans chaque puits d’une plaque d’échantillon de 96 puits.</li>
		<li>Couvrir la plaque avec un joint ou une feuille d’aluminium et incuber pendant 1 h à RT sur un agitateur à plaque réglé à 700 tr/min. NOTE: Le schéma des courbes de dilution est fourni dans le tableau 1.</li>
		<li>Préparer une solution d’anticorps anti-détection humaine (solutions d’anticorps secondaires) à 4 μg/mL avec le tampon d’essai spécifié à l’étape 2.1.11.</li>
		<li>Préparer des IgM chèvre-anti-humaines, conjuguées avec des IgA Super Bright 436 (SB)/Chèvre-anti-humaines, des anticorps de détection de phycoérythrine (PE) à 4 μg/mL; ou IgM anti-humains, Conjugué SB/IgG anti-humains de chèvre, Conjugué PE détecte des anticorps à 4 μg/mL. REMARQUE : Pour un format de plaque de 384 puits, 12,5 μL/puits de la solution d’anticorps secondaire préparée sont nécessaires, et pour un format de plaque de 96 puits, 25 μL/puits sont requis.</li>
		<li>Placez la plaque sur un séparateur magnétique, lavez-la rapidement et inversez de force un récipient à risque biologique pour éliminer le liquide des puits. Avec la plaque toujours inversée, tapotez-la avec force contre une épaisse liasse de papier.</li>
		<li>Lavez chaque puits avec 100 μL de tampon d’essai et retirez le liquide par inversion forcée sur un récipient à risque biologique, comme décrit précédemment. Répétez ces étapes (2.1.12-2.1.13) pour un total de deux lavages. Jetez toutes les liasses de papier usagées dans un contenant contenant contenant un danger biologique.</li>
		<li>Ajouter 12,5 μL de la solution de travail d’anticorps secondaire à chaque puits d’une plaque de 384 puits ou 25 μL à chaque puits d’une plaque de 96 puits. Couvrez la plaque avec un joint ou une feuille d’aluminium et incubez pendant 30 min à RT sur un agitateur à plaque réglé à 700 tr / min.</li>
		<li>Répétez les étapes de lavage 2.1.12-2.1.13</li>
		<li>Ajouter 75 μL de tampon d’essai dans chaque puits d’une plaque de 384 puits ou 100 μL dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Couvrir la plaque avec un joint ou une feuille d’aluminium et incuber pendant 5 min à RT sur un agitateur à plaque réglé à 700 tr / min.</li>
		<li>Analysez 60 μL via l’analyseur d’instruments conformément au manuel du système.</li>
	</ol></li>
	<li>Optimisation du temps d’incubation de capture d’échantillons<ol>
<li>Effectuez les étapes de la section 2.1 en utilisant des temps d’incubation de 30 min, 60 min et 120 min à l’étape 2.1.9. REMARQUE: Les incubations peuvent être effectuées soit avec des plaques distinctes, soit en s’arrêtant à l’étape 2.1.6 jusqu’à ce qu’il passe à l’étape 2.1.9. pour atteindre les temps d’incubation souhaités.</li>
		<li>Procéder à la lecture de plaques sur l’analyseur en utilisant 60 μL du mélange d’essai conformément aux recommandations du fabricant.</li>
	</ol></li>
	<li>Optimisation de la concentration d’anticorps secondaires<ol>
<li>Effectuer cette procédure comme indiqué à la section 2.1, à l’exception des concentrations finales de réactifs dans la solution de travail d’anticorps secondaires (préparée à l’étape 2.1.10-2.1.11) modifiée comme suit: Anticorps de détection IgM anti-humains (ou lapins) de chèvre et de SB à 8, 4, 2, 1 et 0,5 μg/mL. IgA de chèvre anti-humain (ou lapin), anticorps de détection conjugués PE à 8, 4, 2, 1 et 0,5 μg/mL. Anticorps de détection IgG anti-humains (ou lapins) de chèvre et de conjugué PE à 8, 4, 2, 1 et 0,5 μg/mL. IgG chèvre-anti-humaine (ou lapin), IgM conjuguée PE/chèvre-anti-humaine (ou lapin), anticorps de détection conjugués SB à 8, 4, 2, 1 et 0,5 μg/mL. IgA chèvre-anti-humaine (ou lapin), IgM pe-conjuguée/chèvre-anti-humaine (ou lapin), anticorps de détection sb-conjugués à 8, 4, 2, 1 et 0,5 μg/mL.</li>
		<li>Procéder à la lecture de plaques sur l’analyseur en utilisant 60 μL du mélange d’essai conformément aux recommandations du fabricant.</li>
	</ol></li>
	<li>Optimisation du temps d’incubation des anticorps secondaires<ol>
<li>Effectuez cette procédure comme indiqué à la section 2.1 avec une durée d’incubation de 15 min, 30 min, 60 min et 120 min définie à l’étape 2.1.14.</li>
		<li>Procéder à la lecture de plaques sur l’analyseur en utilisant 60 μL du mélange d’essai conformément aux recommandations du fabricant.</li>
	</ol></li>
	<li>Évaluation des échantillons sujets avec des tests à double canal optimisés<ol>
<li>Prélever des échantillons de plasma chez le sujet (n = 4) aux jours -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 et +120 par rapport à la fin de l’administration du vaccin Covid-19 (c.-à-d. deuxième dose). REMARQUE : Le jour 0 représente le moment où la vaccination a été effectuée.</li>
		<li>Effectuer tous les tests à l’aide du protocole de base (section 2.1.) en tant que test à double canal IgG/IgM ou IgA/IgM.</li>
		<li>Normaliser les résultats à la valeur maximale observée de l’intensité fluorescente médiane (IMF) pour chaque immunoglobuline et test spécifique.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Le Dr Borgia est l’inventeur du test sérologique utilisé dans ce manuscrit qui est en instance de brevet. L’article est présenté de manière descriptive uniquement sans aucune analyse statistique présentée pour éviter les biais potentiels introduits par le conflit d’auteurs.

L’appréciation d’une réponse immunitaire à l’exposition au SARS-CoV-2, en conjonction avec la surveillance de l’état infectieux basée sur la RT-PCR, a été bien décrite comme une prescription pour clarifier le cours de la guérison après le Covid-19, pour servir de moyen d’identifier le plasma convalescent ayant une valeur thérapeutique potentielle et pour étudier les taux d’infection à l’échelle de la population10,11. Différents exemples pour comprendre la séroconversion chez les sujets humains comprennent les réseaux de protéines (antigènes)12, les immunoblots13, les constructions immunochromatographiques rapides14 et les tests immuno-enzymatiques (ELISA)15,16,17. Chacune de ces techniques susmentionnées peut évaluer individuellement plusieurs isotypes d’immunoglobulines avec des modifications mineures. Ces procédures, cependant, ne peuvent pas être pratiquement réutilisées pour permettre l’analyse parallèle de plusieurs isotypes, comme présenté dans ce manuscrit, rendant les facteurs de coût et de débit comme des limites pour leur administration sur une stratégie de test à l’échelle de la population. Plusieurs de ces applications offrent également la possibilité de concaténer des niveaux d’antigènes multiples en parallèle, soit tels que présentés, soit dans des formats modifiés, tels qu’un multiplex ELISA18,19. Enfin, la plate-forme d’immunobilles offre la possibilité d’évaluer les niveaux de plusieurs antigènes en parallèle 20,21, mais a été limitée à un seul épitope (c’est-à-dire l’isotype d’immunoglobuline) par essai, à moins toutefois que l’instrument récent doté de capacités de dosage « à double canal » ne soit utilisé.
Dans ce rapport, les protocoles qui établissent la mesure fiable de plusieurs épitopes dans un test d’immunobilles à l’aide de l’instrument en mode « double canal » sont énumérés dans une étude de cas de séroconversion d’individus vaccinés contre le Covid-19. La méthode a démontré une excellente précision (%LES VALEURS GÉNÉRALEMENT <20%) en utilisant des conceptions de tests manuels qui peuvent être améliorées avec l’intégration de systèmes automatisés de laboratoire. La sensibilité et la plage dynamique du test pour tous les analytes et épitopes sélectionnés convenaient aux évaluations de routine. Bien que l’absence d’immunoréactifs IgA et IgM anti-antigènes disponibles dans le commerce ait limité la quantification à l’isotype IgG, une telle restriction n’empêche pas la capacité d’offrir des évaluations semi-quantitatives ou des évaluations relatives à un échantillon spécifique en tant que calibrant22,23.
Le test d’immunobilles validé a été attribué pour étudier la séroconversion dans une cohorte de personnes immunisées avec le vaccin Covid-19. Comparée à d’autres plates-formes similaires, la famille d’instrumentation permet la prospection de la séroconversion chez des centaines d’individus par jour dans un flux de travail manuel et des milliers par jour dans un schéma automatisé. Dans l’ensemble, ces résultats confirment que l’approche « à double canal » a une sensibilité appropriée pour la description de plusieurs épitopes en parallèle pour le test identique et est viable dans un contexte multianalyte. Une différence de sensibilité aux canaux 1 et 2, telles qu’elles sont réalisées avec la phycoérythrine et les fluorophores Super Bright 436, respectivement, peut justifier la conception d’une expérience spécifique pour s’assurer que des résultats analytiques viables sont acquis pour une expérience donnée. C’est-à-dire que la réservation du canal 1 pour les épitopes ou les analytes d’une prévalence plus faible peut être nécessaire pour maintenir une plage dynamique du test qui inclut les valeurs observées d’inconnues. Au-delà de cette considération, la conception des essais était évidente et devrait être facilement accessible aux laboratoires ayant des capacités d’analyse limitées. Certes, cette considération devrait être prise en compte lors de l’examen des interférences des canaux 1 à 2, comme nous l’avons noté à la figure 5, selon laquelle les interférences provenant d’isotypes d’abondance plus élevée peuvent entraîner des erreurs analytiques trompeuses pour ceux qui sont beaucoup plus en abondance lorsqu’elles sont mesurées dans un format à deux canaux. Ce potentiel d’interférence avec des situations avec des concentrations d’analyte très différentes peut représenter une limitation importante de l’approche s’il n’est pas correctement géré dans la phase de conception de l’essai.
En conclusion, une méthode pour mesurer rapidement les titres d’anticorps des principaux isotypes d’immunoglobulines associés à une réponse immunitaire à l’infection ou à la vaccination contre le Covid-19 a été présentée. L’application de cette approche de manière longitudinale pour évaluer la séroconversion peut fournir des informations qui pourraient être mieux utilisées pour gérer et / ou surveiller l’évolution de la maladie ou, alternativement, guider les programmes potentiels de vaccin de rappel Covid-19.

La mesure simultanée de plusieurs biomarqueurs liés à la maladie dans des échantillons biologiques permet d’obtenir des informations descriptives et prédictives sur les processus pathologiques. Bien que les procédures immunologiques conventionnelles à analyte unique, telles que les tests immuno-enzymatiques (ELISA), aient été la pierre angulaire des analyses quantitatives dans les contextes cliniques et de recherche, ces techniques peuvent avoir des limites substantielles en ce qui concerne le débit, la quantité d’échantillon requise pour chaque mesure et la rentabilité qui limitent considérablement l’étude de multiples éléments biologiques qui sont souvent entrelacés tout au long de l’évolution de la maladie1 . La technologie de multiplexage basée sur la microsphère est devenue une plate-forme indispensable pour les installations de diagnostic et de recherche pour sa capacité à combiner des essais pour améliorer le débit en laboratoire, atténuer la rareté des échantillons et réduire les tests répétitifs afin de maximiser les économies de coûts 1,2,3,4. Récemment, une nouvelle augmentation de cette puissance de multiplexage a été introduite avec des instruments dotés de capacités de double rapporteur. La fonction à double rapporteur implémente deux canaux fluorescents pour la détection, fournissant une autre dimension du multiplexage, permettant la détection de plusieurs épitopes sur le même analyte.
Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) est l’agent pathogène responsable de la pandémie actuelle de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19)5. Bien que le test RT-PCR soit crucial pour la confirmation de l’infection au début de l’évolution de la maladie, les examens sérologiques des titres d’anticorps se sont révélés impératifs pour la critique précise et complète des individus concernant une exposition ou un rétablissement antérieur; une réponse à la vaccination; et/ou une évaluation de l’efficacité de la vaccination contre le Covid-19 6,7.
Ce rapport décrit les méthodes d’évaluation de la séroconversion pour plusieurs antigènes viraux du SRAS-CoV-2 qui utilisent un système de double rapport à lecteur multiplex basé sur le flux. Plus précisément, la détection simultanée de deux sous-types d’anticorps (configurés comme IgG/IgM ou IgA/IgM) pour un panel d’antigènes SARS-CoV-2 à 3 plex qui comprend des tests pour spike S1, nucléocapside et glycoprotéines membranaires (aka Matrix), est décrite. Cette approche fournit une entreprise idéale pour la capture de la séroconversion longitudinale et fournit un outil précieux dans l’arsenal contre la pandémie de Covid-19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well black side polystyrene microtiter plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-565-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, heat shock fraction</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A-7888-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS8574735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA35391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Albumin, Fraction V Powder</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2514-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB205009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB204009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB403009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB202009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62999842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Analyzer</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>INTELLIFLEX-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex-C Microspheres, Region XXX</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>MC10XXX-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate aluminum sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>07-200-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-751-7328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-V08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40591-V08H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40592-T62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-R0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb</td>
			<td>ProSci</td>
			<td>10-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>W-64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19

Les technologies multiplexes permettant d’interroger de concert de multiples biomarqueurs existent depuis plusieurs décennies; cependant, les méthodes d’évaluation de plusieurs épitopes sur le même analyte restent limitées. Ce rapport décrit le développement et l’optimisation d’un test d’immunobilles multiplexées pour les tests sérologiques des isotypes d’immunoglobulines courants (par exemple, IgA, IgM et IgG) associés à une réponse immunitaire à l’infection ou à la vaccination contre le SRAS-CoV-2. Les essais ont été réalisés à l’aide d’un lecteur fluorescent multiplex basé sur le débit avec une capacité à deux canaux. Optimisations axées sur le temps de capture de l’analyte, la concentration d’anticorps de détection et le temps d’incubation des anticorps de détection. Les caractéristiques de performance des essais analytiques (p. ex., la plage d’essai (y compris les limites inférieure et supérieure de quantification); et la précision intra et inter-essais) ont été établies pour la combinaison de sérotypes IgG/IgM ou IgA/IgM en tandem à l’aide du mode « double canal ». Les temps de capture de l’analyte de 30 min pour les IgG, 60 min pour les IgM et 120 min pour les IgA convenaient à la plupart des applications, offrant un équilibre entre les performances et le débit des tests. Des incubations optimales d’anticorps de détection à 4 μg/mL pendant 30 min ont été observées et sont recommandées pour des applications générales, compte tenu de l’excellente précision globale (coefficient de variance en pourcentage (%CV) ≤ 20%) et des valeurs de sensibilité observées. La plage dynamique de l’isotype IgG s’étendait sur plusieurs ordres de grandeur pour chaque essai (Spike S1, nucléocapside et glycoprotéines membranaires), ce qui permet des évaluations robustes du titre à un facteur de dilution de 1:500 pour les applications cliniques. Enfin, le protocole optimisé a été appliqué à la surveillance de la séroconversion Spike S1 chez les sujets (n = 4) qui ont terminé un schéma vaccinal contre le SRAS-CoV-2. Au sein de cette cohorte, on a observé que les taux d’IgG Spike S1 atteignaient des titres maximaux 14 jours après l’administration de la deuxième dose, à une intensité de signal beaucoup plus élevée (~ 40 fois) que les isotypes IgM ou IgA. Fait intéressant, nous avons observé des taux de désintégration du titre Spike S1 IgG très variables qui dépendaient en grande partie du sujet, ce qui fera l’objet d’études futures.

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Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

Cet article décrit une méthode pratique pour surveiller les changements dynamiques dans les titres d’anticorps pour deux isotypes d’immunoglobulines simultanément (IgA, IgM ou IgG) résultant d’une réponse immunitaire à l’infection ou à la vaccination contre le SRAS-CoV-2. Ce « panel de réponse immunitaire Covid-19 multianalyte » utilise trois immunoessais indirects construits sur des microsphères codées qui sont lues à l’aide d’un lecteur multiplex basé sur le flux avec une capacité « double canal ».

Surveillance dynamique de la séroconversion à l’aide d’un test d’immunobilles multianalytes pour le Covid-19

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

La méthode que nous allons démontrer aujourd’hui fournit une solution à haut débit pour évaluer la séroconversion des anticorps associés aux infections COVID-19 ou à la vaccination pour des analyses de routine. Fait intéressant, cette approche nous permet d’évaluer plusieurs épitopes sur le même analyte. Cela a de nombreuses applications dans les sciences biologiques, y compris les études de signalisation cellulaire et la surveillance des réponses immunitaires.Vous démontrerez cette technique aujourd’hui par le Dr Imad Tarhoni, boursier postdoctoral dans mon laboratoire. Pour commencer, sélectionnez trois flacons différents des microsphères magnétiques avec des régions de perles uniques et enregistrez l’ID de perle et les informations de lot pour chaque flacon utilisé. Ensuite, vortexez le stock de microsphère sélectionné pendant 60 secondes et soniquez pendant cinq minutes.Transférer 1,0 fois 10 aux six billes dans un tube de microcentrifuge à faible teneur en protéines de 1,5 millilitre et insérer le tube dans un séparateur magnétique. pour permettre la séparation pendant 60 secondes. Avec le tube toujours dans le séparateur magnétique, retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille de perle.Retirez le tube du séparateur magnétique, puis remettez en suspension les billes avec 100 microlitres d’eau de qualité HPLC et de vortex pendant 30 secondes. Encore une fois, replacez le tube dans le séparateur magnétique pendant 60 secondes et retirez ensuite le surnageant. Répétez le protocole de lavage deux fois.Après le dernier lavage, retirez le tube du séparateur magnétique et remettez en suspension les microsphères lavées dans 90 microlitres de tampon d’activation, pH 6,2, par vortex pendant 30 secondes. Ensuite, traiter séquentiellement les microsphères avec 10 microlitres de 50 milligrammes par millilitre d’anhydroxy-sulfosuccinamide et 10 microlitres de 50 milligrammes par millilitre de solution d’EDC par vortex pendant 10 secondes. Plus tard, incuber les microsphères pendant 20 minutes à température ambiante avec un léger vortex toutes les 10 minutes.Après l’incubation, lavez les microsphères deux fois avec du MES de 50 millimolaires ou un tampon de couplage, pH 5,0, comme décrit précédemment. Répétez le lavage deux fois. Une fois cela fait, retirez le tube du séparateur magnétique et remettez en suspension les billes avec 100 microlitres de tampon de couplage par vortex pendant 30 secondes, puis ajoutez immédiatement la quantité de protéine souhaitée au tube.Porter le volume total à 150 microlitres avec tampon de couplage et mélanger la réaction par vortex pendant 30 secondes. Ensuite, incubez le tube pendant deux heures par rotation à température ambiante. Après incubation, lavez les microsphères deux fois avec un tampon de trempe PBS et remettez en suspension les microsphères lavées dans 100 microlitres de tampon de trempe contenant 0,05% d’azoture de sodium par vortex pendant 30 secondes.Comptez le nombre de microsphères récupérées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et enregistrez la concentration de billes observée. Pour les performances de dosage, remettez en suspension les microsphères couplées par vortex pendant 30 secondes et soniquez pendant 60 à 90 secondes. Ensuite, retirez la quantité requise de chaque colloïde de perle du tube respectif et combinez les colloïdes de perles dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.Ensuite, insérez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation pendant 60 secondes. Avec le tube toujours dans le séparateur magnétique, retirez le surnageant sans perturber la pastille de perle. Après avoir retiré les billes du séparateur, remettez les perles en suspension dans 100 microlitres de tampon d’essai.Vortex pendant 30 secondes avant de placer le tube dans un séparateur magnétique pendant 60 secondes pour séparer les perles. Répétez le lavage deux fois. Ensuite, ajustez la concentration du mélange de microsphères de travail à trois plex en ajoutant un volume approprié de tampon d’essai pour générer une concentration finale de 100 microsphères par microlitre pour chaque cible.Aliquote 25 microlitres du mélange de microsphère dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Diluer les échantillons de plasma ou de sérum 500 fois dans le tampon d’essai et préparer les échantillons standard selon le titrage souhaité. Ajouter 25 microlitres de tampon d’essai comme échantillon vierge et ajouter chacun des spécimens dilués ou étalons dans chaque puits désigné d’une plaque d’échantillon de 96 puits.Lorsque vous avez terminé, couvrez la plaque avec un joint ou une feuille d’aluminium pour incuber pendant une heure à température ambiante sur un agitateur à plaque réglé sur 700 rotations par minute. Préparer une solution d’anticorps anti-détection humaine ou de solutions d’anticorps secondaires à quatre microgrammes par microlitre avec un tampon d’essai tel que décrit dans le manuscrit. Placez la plaque sur un séparateur magnétique pour laver rapidement, puis inversez de force la plaque au-dessus d’un récipient à risque biologique pour éliminer le liquide des puits.Avec la plaque toujours inversée, tapotez-la avec force contre une épaisse liasse de papier. Ensuite, lavez chaque puits avec 100 microlitres de tampon d’essai et retirez le liquide par inversion forcée sur un récipient à risque biologique. Répétez le lavage deux fois.Après le dernier lavage, jetez toutes les liasses de papier usagées dans un récipient contenant contenant un risque biologique. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution de travail d’anticorps secondaires à chaque puits d’une plaque de 96 puits et recouvrez la plaque de papier d’aluminium pour incuber sur un agitateur à plaque à 700 rotations par minute. Après 30 minutes d’incubation, laver les puits de la plaque deux fois avec un tampon d’essai comme démontré précédemment.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon d’essai dans chaque puits de la plaque de 96 puits. Couvrir la plaque avec du papier d’aluminium et incuber pendant cinq minutes sur un agitateur à plaque à température ambiante. Analysez un échantillon de 60 microlitres via l’analyseur d’instruments conformément au manuel du système.Pour optimiser le temps d’incubation de la capture de l’échantillon, incuber les plaques pendant une durée de 30, 60 et 120 minutes. Après l’incubation, analysez 60 microlitres du mélange d’essai sur l’analyseur. Une courbe standard en sept points basée sur une série de dilution en série 1:5 a été évaluée pour le pic S1, les anticorps membranaires et la nucléocapside.Le test de précision intra-essai a été effectué sur la plaque pour évaluer la précision du test calculée en pourcentage de coefficient de variation, d’écart type et de moyenne. Pour la précision entre les essais, trois lots distincts des ensembles de perles ont été préparés pour chaque essai. Les variables de précision du test avec l’étalon et les échantillons de plasma humain ont été calculées.Les valeurs moyennes d’intensité fluorescente médiane à 120 minutes de l’incubation étaient optimales pour les titres d’IgG pour le pic S1, la membrane et les anticorps nucléocapsides, indiquant une cinétique de liaison rapide des anticorps primaires. Les optimisations de la concentration d’anticorps secondaires dans la performance à double canal ont démontré une large gamme de signaux dans la mesure linéaire pour toutes les concentrations. Les signaux observés lors de différentes incubations temporelles des anticorps secondaires et les détails sur les changements de signal pour tous les temps d’incubation sont montrés ici.Dans les évaluations de spécificité pour les essais à double canal, une contamination négligeable du signal croisé a été observée entre le canal blanc et le canal rapporteur unique. Dans l’illustration des événements de séroconversion après la vaccination contre la COVID-19, les valeurs de pointe observées des IgA et des IgM de pointe étaient environ 40 fois inférieures aux titres d’isotype d’IgG. Cette méthode a des implications importantes pour la surveillance de la réponse aux vaccins chez les personnes immunodéprimées.Cela nous permettra de déterminer si ces patients sont vraiment protégés par ces vaccinations.

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