Name: dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

Die Autoren danken dem Rush Biomarker Development Core für die Nutzung ihrer Einrichtungen, dem Rush Biorepository für die Aufnahme von Probanden und die Verarbeitung von Bioproben sowie den Fördernummern SCI16 (J.R.S. und J.A.B.) und 21-00147 (J.R.S. und J.A.B.) der Walder Foundation sowie einer Auszeichnung der Swim Across America Foundation (J.A.B.).

Alle Probanden wurden mit schriftlicher Einverständniserklärung mit voller Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) des Rush University Medical Center unter dem Protokoll ORA 20101207 unter Einhaltung aller institutionellen Richtlinien für ethisches Forschungsverhalten eingeschrieben. Blut wurde über die konventionelle Phlebotomie in Lavendelvakutainer (K2EDTA) gesammelt und mit empfohlenen Protokollen verarbeitet. Das resultierende Plasma wurde bei -80 °C archiviert, bis Bewertungen durchgeführt wurden.
1. Herstellung von antigenkonjugierten Mikrosphären
<ol><li>Wählen Sie drei verschiedene Fläschchen mit magnetischen Mikrokugeln mit einzigartigen Perlenregionen aus und zeichnen Sie die Perlen-ID und die Chargeninformationen für jedes verwendete Fläschchen auf. HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für jede einzelne Mikrosphärenregion befolgt. Mikrosphären sind lichtempfindlich und sollten vor längerer Lichteinwirkung geschützt werden. Achten Sie beim Waschen darauf, die Mikrosphären nicht zu stören. Wenn gestört, erlauben Sie eine zweite 60 s Trennung.</li>
	<li>Wirbeln Sie den Mikrosphärenbestand für 60 s und beschallen Sie für 5 Minuten vor der Verwendung, um aggregierte Perlen zu dissoziieren.</li>
	<li>Übertragen Sie 1,0 x 106 Perlen auf ein 1,5 ml proteinarmes bindendes Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Setzen Sie das Rohr in einen Magnetabscheider ein und lassen Sie die Trennung für 60 s erfolgen. Wenn sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Perlenpellet zu stören.</li>
	<li>Entfernen Sie das Rohr aus dem Magnetabscheider, suspendieren Sie die Perlen mit 100 μL HPLC-Wasser und wirbeln Sie es 30 s lang. Setzen Sie das Rohr für 60 s wieder in den Magnetabscheider und entfernen Sie anschließend den Überstand. Wiederholen Sie dieses Waschprotokoll zweimal.</li>
	<li>Entfernen Sie das Rohr aus dem Magnetabscheider und resuspendieren Sie die gewaschenen Mikrokugeln in 90 μL 100 mM monobasischem Natriumphosphat, pH 6,2 (Aktivierungspuffer) durch Vortex für 30 s.</li>
	<li>Geben Sie 10 μL 50 mg / ml Sulfo-NHS (verdünnt mit Aktivierungspuffer) zu den Mikrosphären und wirbeln Sie vorsichtig für 10 s. 10 μL 50 mg/ml EDC-Lösung (verdünnt mit Aktivierungspuffer) zugeben und vorsichtig für 10 s vorwirbeln. Inkubieren Sie Mikrokugeln für 20 min bei Raumtemperatur (RT) mit einem sanften Wirbel alle 10 Minuten.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Waschschritte 1,4-1,5 mit 50 mM MES, pH 5,0 (Kopplungspuffer) anstelle von LC/MS-Wasser für insgesamt zwei Wäschen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Rohr aus dem Magnetabscheider und suspendieren Sie die Perlen mit 100 μL Kupplungspuffer im Wirbel für 30 s, gefolgt von der Zugabe der gewünschten Proteinmenge.</li>
	<li>Bringen Sie das Gesamtvolumen mit dem Kopplungspuffer auf 150 μL. Mischkupplungsreaktion durch Vortex für 30 s und Inkubation für 2 h durch Rotation bei RT. HINWEIS: Für hierin definierte Assays wurden Konjugationen mit den folgenden Proteinkonzentrationen durchgeführt: Spike S1: 5 μg; Nukleokapsid: 5 μg; Membran: 12,5 μg.</li>
	<li>Wiederholen Sie Waschschritt 1.4 mit Phosphat Buffered Saline (PBS)-1% Ziegenserumalbumin, 0,01% Polysorbat-20 (Quench Buffer) anstelle von LC/MS-Wasser für insgesamt zwei Wäschen. Resuspendiert die gewaschenen Mikrokügelchen in 100 μL Quench Buffer mit 0,05% Natriumazid durch Vortex für 30 s. HINWEIS: Lassen Sie die Perlen mindestens 6 Stunden lang vollständig abschrecken, bevor Sie mit einem anderen Verfahren fortfahren.</li>
	<li>Zählen Sie die Anzahl der wiedergewonnenen Mikrosphären mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer. Zeichnen Sie die beobachtete Perlenkonzentration auf.</li>
	<li>Kühlen Sie die gekoppelten Mikrokugeln bei 4 °C im Dunkeln.</li>
</ol>2. Verfahren
<ol><li>Assay-Leistung (Basisprotokoll)<ol>
<li>Resuspendieren Sie die gekoppelten Mikrosphären durch Wirbel für 30 s und Beschallung für ~ 60-90 s.</li>
		<li>Entfernen Sie die benötigte Menge jedes Perlenkolloides aus dem jeweiligen Röhrchen und kombinieren Sie die Perlenkolloide in einem neuen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Setzen Sie das Rohr in einen Magnetabscheider ein und lassen Sie die Trennung für 60 Sekunden erfolgen. Wenn sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Perlenpellet zu stören.</li>
		<li>Entfernen Sie die Perlen aus dem Separator, suspendieren Sie die Perlen mit 100 μL PBS-1% Rinderserumalbumin, 0,01% Polysorbat-20 (Assay-Puffer) und Wirbel für 30 s. Legen Sie das Rohr in einen Magnetabscheider und lassen Sie die Trennung für 60 s erfolgen. Wiederholen Sie dieses Waschprotokoll (d. h. die Schritte 2.1.3-2.1.4) zweimal.</li>
		<li>Passen Sie die Konzentration der 3-Plex-Arbeitsmikrosphärenmischung an, indem Sie ein geeignetes Volumen Assay-Puffer hinzufügen, um eine Endkonzentration von 100 Mikrosphären pro 1 μL für jedes Ziel zu erzeugen.</li>
		<li>Aliquot 12,5 μL der in Schritt 2.1.5 hergestellten Mikrosphärenmischung in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte oder 25 μL in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Plasma-/Serumproben 500-fach im Assay-Puffer. Bereiten Sie Standardproben entsprechend der gewünschten Titration vor.</li>
		<li>12,5 μL Assay-Puffer als Blindprobe zugeben und jede der verdünnten Probe oder der Norm in jede vorgesehene Vertiefung einer 384-Well-Probenplatte oder 25 μL der leeren, verdünnten Probe oder des Standards in jede Vertiefung einer 96-Well-Probenplatte geben.</li>
		<li>Decken Sie die Platte mit einer Aluminiumdichtung oder -folie ab und inkubieren Sie für 1 h bei RT auf einem auf 700 U / min eingestellten Plattenschüttler. HINWEIS: Ein Schema für die Verdünnungskurven ist in Tabelle 1 enthalten.</li>
		<li>Es wird eine Lösung von Antikörpern gegen den menschlichen Nachweis (sekundäre Antikörperlösungen) bei 4 μg/ml mit Assay-Puffer gemäß Schritt 2.1.11 hergestellt.</li>
		<li>Herstellung von Ziegen-Anti-Mensch-IgM, konjugiert mit Super Bright 436 (SB) / Ziegen-Anti-Human-IgA, Phycoerythrin (PE) Konjugat-Nachweis-Antikörpern bei 4 μg / ml; oder Ziegen-anti-humanes IgM, SB-Konjugat/Ziegen-anti-humanes IgG, PE-Konjugat-Detektionsantikörper bei 4 μg/ml. HINWEIS: Für ein 384-Well-Plattenformat sind 12,5 μL/Well der vorbereiteten sekundären Antikörperlösung erforderlich, und für ein 96-Well-Plattenformat sind 25 μL/Well erforderlich.</li>
		<li>Legen Sie die Platte auf einen Magnetabscheider, waschen Sie sie schnell und kehren Sie sie gewaltsam über einen Biohazard-Behälter um, um Flüssigkeit aus den Bohrlöchern zu entfernen. Wenn die Platte noch umgedreht ist, klopfen Sie die Platte kräftig gegen einen dicken Papierstreifen.</li>
		<li>Waschen Sie jede Vertiefung mit 100 μL Assay-Puffer und entfernen Sie die Flüssigkeit durch gewaltsame Inversion über einen Biohazard-Behälter, wie zuvor beschrieben. Wiederholen Sie diese Schritte (2.1.12-2.1.13) für insgesamt zwei Wäschen. Entsorgen Sie alle gebrauchten Papierbündel in einen Biohazard-Behälter.</li>
		<li>12,5 μL der sekundären Antikörper-Arbeitslösung zu jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte oder 25 μL zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte. Decken Sie die Platte mit einer Aluminiumdichtung oder -folie ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei RT auf einem auf 700 U / min eingestellten Plattenschüttler.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Waschschritte 2.1.12-2.1.13</li>
		<li>Fügen Sie 75 μL Assay-Puffer in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte oder 100 μL in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu. Decken Sie die Platte mit einer Aluminiumdichtung oder -folie ab und inkubieren Sie für 5 Minuten bei RT auf einem auf 700 U / min eingestellten Plattenschüttler.</li>
		<li>Analysieren Sie 60 μL über den Geräteanalysator gemäß dem Systemhandbuch.</li>
	</ol></li>
	<li>Optimierung der Inkubationszeit für die Probenerfassung<ol>
<li>Führen Sie die Schritte in Abschnitt 2.1 mit einer Inkubationsdauer von 30 min, 60 min und 120 min in Schritt 2.1.9 aus. HINWEIS: Inkubationen können entweder mit unterschiedlichen Platten oder durch Pausieren in Schritt 2.1.6 durchgeführt werden, bis zu dem Zeitpunkt, zu dem mit Schritt 2.1.9 fortgefahren werden kann. um die gewünschten Inkubationszeiten zu erreichen.</li>
		<li>Fahren Sie mit der Plattenablesung auf dem Analysator fort, indem Sie 60 μL der Assay-Mischung gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwenden.</li>
	</ol></li>
	<li>Optimierung der sekundären Antikörperkonzentration<ol>
<li>Dieses Verfahren ist wie in Abschnitt 2.1 beschrieben durchzuführen, mit Ausnahme der Endkonzentrationen von Reagenzien in der sekundären Antikörper-Arbeitslösung (hergestellt in Schritt 2.1.10-2.1.11), die wie folgt geändert wurde: Ziegen-Anti-Mensch (oder Kaninchen) IgM, SB-Konjugat-Detektionsantikörper bei 8, 4, 2, 1 und 0,5 μg/ml. Ziegen-Anti-Human- (oder Kaninchen-) IgA-, PE-Konjugat-Detektionsantikörper bei 8, 4, 2, 1 und 0,5 μg/ml. Ziegen-Anti-Mensch (oder Kaninchen) IgG, PE-konjugierte Detektionsantikörper bei 8, 4, 2, 1 und 0,5 μg/ml. Ziegen-Anti-Mensch (oder Kaninchen) IgG, PE-Konjugat / Ziegen-Anti-Mensch (oder Kaninchen) IgM, SB-Konjugat Detektionsantikörper bei 8, 4, 2, 1 und 0,5 μg / ml. Ziegen-Anti-Mensch (oder Kaninchen) IgA, PE-Konjugat / Ziege Anti-Mensch (oder Kaninchen) IgM, SB-Konjugat Detektionsantikörper bei 8, 4, 2, 1 und 0,5 μg / ml.</li>
		<li>Fahren Sie mit der Plattenablesung auf dem Analysator fort, indem Sie 60 μL der Assay-Mischung gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwenden.</li>
	</ol></li>
	<li>Optimierung der Inkubationszeit sekundärer Antikörper<ol>
<li>Führen Sie dieses Verfahren wie in Abschnitt 2.1 beschrieben mit 15 min, 30 min, 60 min und 120 min Inkubationsdauer durch, die in Schritt 2.1.14 definiert sind.</li>
		<li>Fahren Sie mit der Plattenablesung auf dem Analysator fort, indem Sie 60 μL der Assay-Mischung gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwenden.</li>
	</ol></li>
	<li>Auswertung von Probandenproben mit optimierten Zweikanal-Assays<ol>
<li>Sammeln Sie Probandenplasmaproben (n = 4) an den Tagen -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 und +120 relativ zum Abschluss der Verabreichung des Covid-19-Impfstoffs (d. h. der zweiten Dosis). HINWEIS: Tag 0 stellt den Zeitpunkt dar, zu dem die Impfung abgeschlossen wurde.</li>
		<li>Führen Sie alle Assays unter Verwendung des Basisprotokolls (Abschnitt 2.1.) entweder als IgG/IgM- oder IgA/IgM-Zweikanal-Assay durch.</li>
		<li>Normalisieren Sie die Ergebnisse auf den maximal beobachteten MFI-Wert (Median Fluorescent Intensity) für jedes spezifische Immunglobulin und jeden Assay.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Dr. Borgia ist der Erfinder des serologischen Tests, der in diesem zum Patent angemeldeten Manuskript verwendet wird. Der Artikel wird nur deskriptiv präsentiert, ohne dass statistische Analysen vorgelegt werden, um mögliche Verzerrungen durch Autorenkonflikte zu vermeiden.

Die Bewertung einer Immunantwort auf SARS-CoV-2-Exposition in Verbindung mit einer RT-PCR-basierten Überwachung des Infektionsstatus wurde gut als Rezept zur Klärung des Genesungsverlaufs von Covid-19, zur Identifizierung von Rekonvaleszentenplasma mit potenziellem therapeutischem Wert und zur Erhebung der Infektionsraten auf Bevölkerungsebenebeschrieben 10,11. Verschiedene Beispiele für das Verständnis der Serokonversion bei menschlichen Probanden sind Protein(antigen)-Arrays 12, Immunoblots13, schnelle immunchromatographische Konstrukte 14 und enzymgebundene Immunsorbentien-Assays (ELISAs) 15,16,17. Jede dieser oben genannten Techniken kann mehrere Immunglobulin-Isotypen einzeln mit geringfügigen Modifikationen beurteilen. Diese Verfahren sind jedoch nicht in der Lage, praktisch umfunktioniert zu werden, um eine parallele Analyse mehrerer Isotypen zu ermöglichen, wie in diesem Manuskript vorgestellt, was Kosten- und Durchsatzfaktoren als Einschränkungen für ihre Verwaltung auf einer populationsbasierten Skalenteststrategie darstellt. Mehrere dieser Anwendungen bieten auch die Möglichkeit, Konzentrationen mehrerer Antigene parallel zu verketten, entweder wie vorgestellt oder in veränderten Formaten, wie z. B. einem Multiplex-ELISA18,19. Schließlich bietet die Immunbead-Plattform die Möglichkeit, Konzentrationen mehrerer Antigene parallelzu bewerten 20,21, war jedoch auf ein einzelnes Epitop (d. h. Immunglobulin-Isotyp) pro Assay beschränkt, es sei denn, das jüngste Instrument mit "Zweikanal"-Assay-Fähigkeiten wird eingesetzt.
In diesem Bericht werden Protokolle aufgezählt, die die zuverlässige Messung mehrerer Epitope in einem Immunperlen-Assay mit dem Instrument im "Zweikanal"-Modus in einer Fallstudie zur Serokonversion von Covid-19-geimpften Personen belegen. Die Methode zeigte eine ausgezeichnete Präzision (%CV-Werte typischerweise <20%) unter Verwendung manueller Assay-Designs, die durch die Integration automatisierter Laborsysteme verbessert werden können. Assay-Sensitivität und Dynamikumfang für alle ausgewählten Analyten und Epitope waren für Routineauswertungen geeignet. Obwohl das Fehlen kommerziell erhältlicher Anti-Antigen-IgA- und IgM-Immunreagenzien die Quantifizierung auf den IgG-Isotyp beschränkte, schließt eine solche Beschränkung nicht aus, dass semiquantitative Bewertungen oder Bewertungen in Bezug auf eine bestimmte Probe als Kalibrant22,23 angeboten werden können.
Der validierte Immunperlen-Assay wurde zugewiesen, um die Serokonversion in einer Kohorte von Personen zu untersuchen, die mit dem Covid-19-Impfstoff immunisiert wurden. Im Gegensatz zu anderen ähnlichen Plattformen ermöglicht die Instrumentierungsfamilie die Prospektion von Serokonversion bei Hunderten von Personen pro Tag in einem manuellen Workflow und Tausenden pro Tag in einem automatisierten Schema. Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse, dass der "zweikanalige" Ansatz eine angemessene Sensitivität für die Beschreibung mehrerer Epitope parallel für den identischen Assay aufweist und in einem multianalytischen Kontext praktikabel ist. Ein Unterschied in den Empfindlichkeiten gegenüber Kanal 1 und Kanal 2, wie er mit Phycoerythrin- bzw. Super Bright 436-Fluorophoren durchgeführt wird, kann das Design eines spezifischen Experiments rechtfertigen, um sicherzustellen, dass für ein bestimmtes Experiment tragfähige Analyseergebnisse erzielt werden. Das heißt, die Reservierung von Kanal 1 für Epitope oder Analyten mit geringerer Prävalenz kann notwendig sein, um einen dynamischen Bereich des Assays aufrechtzuerhalten, der die beobachteten Werte von Unbekannten enthält. Über diese Überlegung hinaus war das Assay-Design offensichtlich und sollte für Labors mit begrenzten analytischen Fähigkeiten leicht zugänglich sein. Sicherlich sollte diese Überlegung bei der Betrachtung von Interferenzen zwischen Kanal 1 und Kanal 2 abgewogen werden, wie wir in Abbildung 5 festgestellt haben, wobei Interferenzen durch Isotypen mit höherer Häufigkeit irreführende analytische Fehler für Personen mit viel geringerer Häufigkeit verursachen können, wenn sie in einem Zweikanalformat gemessen werden. Dieses Potenzial für Interferenzen in Situationen mit sehr unterschiedlichen Analytkonzentrationen kann eine erhebliche Einschränkung des Ansatzes darstellen, wenn es in der Assay-Designphase nicht richtig gehandhabt wird.
Zusammenfassend wurde eine Methode zur schnellen Messung von Antikörpertitern aus den wichtigsten Immunglobulin-Isotypen, die mit einer Immunantwort auf eine Covid-19-Infektion oder -Impfung assoziiert sind, vorgestellt. Die Anwendung dieses Ansatzes in Längsschnitt zur Beurteilung der Serokonversion kann Erkenntnisse liefern, die besser genutzt werden könnten, um den Krankheitsverlauf zu steuern und / oder zu überwachen oder alternativ zukünftige Covid-19-Auffrischungsimpfprogramme zu leiten.

Die gleichzeitige Messung mehrerer krankheitsbezogener Biomarker in biologischen Proben ermöglicht deskriptive und prädiktive Einblicke in pathologische Prozesse. Während herkömmliche immunologische Einzelanalytverfahren, wie z. B. enzymgebundene Immunsorbentien-Assays (ELISAs), der Eckpfeiler quantitativer Analysen sowohl im klinischen als auch im Forschungsumfeld waren, können diese Techniken erhebliche Einschränkungen hinsichtlich des Durchsatzes, der für jede Messung erforderlichen Probenmenge und der Kosteneffizienz aufweisen, die die Untersuchung mehrerer biologischer Elemente, die häufig während des Krankheitsverlaufs miteinander verflochten sind, stark einschränken1 . Die mikrokugelbasierte Multiplexing-Technologie ist zu einer unverzichtbaren Plattform für Diagnose- und Forschungseinrichtungen geworden, da sie Assays kombinieren kann, um den Labordurchsatz zu verbessern, die Probenknappheit zu verringern und wiederholte Tests zu reduzieren, um die Kosteneinsparungen zu maximieren 1,2,3,4. Vor kurzem wurde eine weitere Erweiterung dieser Multiplexing-Leistung mit Instrumenten eingeführt, die über Dual-Reporter-Fähigkeiten verfügen. Die Dual-Reporter-Funktion implementiert zwei fluoreszierende Kanäle für die Detektion und liefert eine weitere Dimension des Multiplexings, die den Nachweis mehrerer Epitope auf demselben Analyten ermöglicht.
Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist der Erreger, der für die aktuelle Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) Pandemie5 verantwortlich ist. Während RT-PCR-Tests für die Infektionsbestätigung zu Beginn des Krankheitsverlaufs von entscheidender Bedeutung sind, haben sich serologische Untersuchungen von Antikörpertitern als unerlässlich für die genaue und vollständige Kritik von Individuen in Bezug auf eine frühere Exposition oder Genesung erwiesen; eine Reaktion auf die Immunisierung; und/oder eine Bewertung der Wirksamkeit der Covid-19-Impfung 6,7.
Dieser Bericht beschreibt Methoden zur Messung der Serokonversion für mehrere virale SARS-CoV-2-Antigene, die ein flussbasiertes Multiplex-Reader-Dual-Reporting-System verwenden. Insbesondere wird der gleichzeitige Nachweis von zwei Antikörper-Subtypen (konfiguriert als IgG / IgM oder IgA / IgM) für ein 3-Plex-SARS-CoV-2-Antigen-Panel beschrieben, das Assays für Spike S1-, Nucleocapsid- und Membranglykoproteine (auch bekannt als Matrix) enthält. Dieser Ansatz bietet ein ideales Unternehmen für die Erfassung der longitudinalen Serokonversion und trägt zu einem wertvollen Werkzeug im Arsenal gegen die Covid-19-Pandemie bei.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well black side polystyrene microtiter plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-565-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, heat shock fraction</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A-7888-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS8574735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA35391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Albumin, Fraction V Powder</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2514-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB205009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB204009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB403009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB202009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62999842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Analyzer</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>INTELLIFLEX-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex-C Microspheres, Region XXX</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>MC10XXX-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate aluminum sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>07-200-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-751-7328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-V08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40591-V08H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40592-T62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-R0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb</td>
			<td>ProSci</td>
			<td>10-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>W-64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19

Multiplex-Technologien zur gemeinsamen Abfrage mehrerer Biomarker existieren seit mehreren Jahrzehnten; Die Methoden zur Bewertung mehrerer Epitope auf demselben Analyten bleiben jedoch begrenzt. Dieser Bericht beschreibt die Entwicklung und Optimierung eines Multiplex-Immunbead-Assays für die serologische Untersuchung häufiger Immunglobulin-Isotypen (z. B. IgA, IgM und IgG), die mit einer Immunantwort auf eine SARS-CoV-2-Infektion oder -Impfung assoziiert sind. Die Assays wurden mit einem strömungsbasierten Multiplex-fluoreszierenden Lesegerät mit Zweikanalfähigkeit durchgeführt. Die Optimierungen konzentrierten sich auf die Analyterfassungszeit, die Detektionsantikörperkonzentration und die Inkubationszeit für den Nachweis von Antikörpern. Analytische Assay-Leistungsmerkmale (z. B. Assay-Bereich (einschließlich unterer und oberer Quantifizierungsgrenzen) sowie Intra- und Inter-Assay-Präzision) wurden entweder für IgG/IgM- oder IgA/IgM-Serotyp-Kombination im Tandem unter Verwendung des "Zweikanal"-Modus festgelegt. Analyterfassungszeiten von 30 min für IgG, 60 min für IgM und 120 min für IgA waren für die meisten Anwendungen geeignet und boten ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Assay-Leistung und Durchsatz. Optimale Detektionsantikörperinkubationen bei 4 μg/ml für 30 min wurden beobachtet und werden für allgemeine Anwendungen empfohlen, da insgesamt eine ausgezeichnete Genauigkeit (prozentualer Varianzkoeffizient (%CV) ≤ 20%) und Sensitivitätswerte beobachtet werden. Der Dynamikbereich für den IgG-Isotyp umfasste mehrere Größenordnungen für jeden Assay (Spike S1, Nucleocapsid und Membranglykoproteine), was robuste Titerbewertungen bei einem Verdünnungsfaktor von 1:500 für klinische Anwendungen unterstützt. Schließlich wurde das optimierte Protokoll auf die Überwachung der Spike S1-Serokonversion für Probanden (n = 4) angewendet, die ein SARS-CoV-2-Impfstoffregime abgeschlossen hatten. Innerhalb dieser Kohorte wurde beobachtet, dass die Spike S1 IgG-Spiegel nach 14 Tagen nach der zweiten Verabreichung der Dosis maximale Titer erreichten, bei einer viel höheren (~ 40-fachen) Signalintensität als entweder IgM- oder IgA-Isotypen. Interessanterweise beobachteten wir hochvariable Spike S1 IgG-Titerzerfallsraten, die weitgehend subjektabhängig waren, was das Thema zukünftiger Studien sein wird.

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Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

Dieser Artikel beschreibt eine geeignete Methode zur gleichzeitigen Überwachung dynamischer Veränderungen in Antikörpertitern für zwei Immunglobulin-Isotypen (entweder IgA, IgM oder IgG), die sich aus einer Immunantwort auf eine SARS-CoV-2-Infektion oder -Impfung ergeben. Dieses "Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel" verwendet drei indirekte Immunoassays, die auf codierten Mikrosphären basieren und mit einem flussbasierten Multiplex-Leser mit "Dual-Channel"-Fähigkeit gelesen werden.

Dynamisches Monitoring der Serokonversion mittels Multianalyte Immunobead Assay für Covid-19

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

Die Methode, die wir heute demonstrieren werden, bietet eine Hochdurchsatzlösung zur Bewertung der Serokonversion von Antikörpern, die entweder mit COVID-19-Infektionen assoziiert sind, oder zur Impfung für Routineanalysen. Interessanterweise ermöglicht uns dieser Ansatz, mehrere Epitope auf demselben Analyten zu bewerten. Dies hat zahlreiche Anwendungen in den biologischen Wissenschaften, einschließlich Zellsignalisierungsstudien und der Überwachung von Immunantworten.Diese Technik wird Ihnen heute Dr. Imad Tarhoni, einem Postdoktoranden in meinem Labor, demonstrieren. Wählen Sie zunächst drei verschiedene Durchstechflaschen der magnetischen Mikrosphären mit eindeutigen Perlenregionen aus und zeichnen Sie die Perlen-ID und die Chargeninformationen für jedes verwendete Fläschchen auf. Dann wirbeln Sie den ausgewählten Mikrosphärenstock für 60 Sekunden und beschallen Sie ihn für fünf Minuten.Übertragen Sie 1,0 mal 10 auf die sechs Perlen zu einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Proteinbindung und führen Sie das Rohr in einen Magnetabscheider ein. , um die Trennung für 60 Sekunden zu ermöglichen. Wenn sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Perlenpellet zu stören.Entfernen Sie das Rohr vom Magnetabscheider und suspendieren Sie die Perlen dann mit 100 Mikrolitern HPLC-Wasser und Wirbel für 30 Sekunden. Setzen Sie das Rohr erneut für 60 Sekunden wieder in den Magnetabscheider und entfernen Sie anschließend den Überstand. Wiederholen Sie das Waschprotokoll zweimal.Entfernen Sie nach der letzten Wäsche das Rohr aus dem Magnetabscheider und suspendieren Sie die gewaschenen Mikrokugeln in 90 Mikrolitern Aktivierungspuffer, pH 6,2, durch Wirbel für 30 Sekunden. Als nächstes behandeln Sie die Mikrosphären nacheinander mit 10 Mikrolitern von 50 Milligramm pro Milliliter Anhydroxysulfosuccinamid und 10 Mikroliter von 50 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung durch Vortex für 10 Sekunden. Später inkubieren Sie die Mikrosphären für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit einem sanften Wirbel alle 10 Minuten.Nach der Inkubation waschen Sie die Mikrokügelchen zweimal mit 50-millimolärem MES oder Kopplungspuffer, pH 5,0, wie zuvor beschrieben. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal. Sobald dies erledigt ist, entfernen Sie das Rohr aus dem Magnetabscheider und suspendieren Sie die Perlen mit 100 Mikrolitern Kopplungspuffer im Wirbel für 30 Sekunden, gefolgt von der sofortigen Zugabe der gewünschten Proteinmenge in die Röhre.Bringen Sie das Gesamtvolumen mit Kopplungspuffer auf 150 Mikroliter und mischen Sie die Reaktion durch Vortex für 30 Sekunden. Dann inkubieren Sie das Rohr für zwei Stunden durch Rotation bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation waschen Sie die Mikrosphären zweimal mit PBS-Abschreckpuffer und suspendieren Sie die gewaschenen Mikrosphären in 100 Mikrolitern Abschreckpuffer, der 0,05% Natriumazid enthält, im Wirbel für 30 Sekunden.Zählen Sie die Anzahl der wiedergewonnenen Mikrosphären mit einem automatisierten Zellzähler und zeichnen Sie die beobachtete Perlenkonzentration auf. Für die Assay-Leistung suspendieren Sie die gekoppelten Mikrosphären 30 Sekunden lang per Wirbel und beschallen Sie für 60 bis 90 Sekunden. Entfernen Sie dann die benötigte Menge jedes Perlenkolloids aus dem jeweiligen Röhrchen und kombinieren Sie die Perlenkolloide in einem neuen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Als nächstes stecken Sie das Rohr in einen Magnetabscheider und lassen Sie die Trennung für 60 Sekunden einwirken. Wenn sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie den Überstand, ohne das Perlenpellet zu stören. Nachdem Sie die Perlen aus dem Separator entfernt haben, suspendieren Sie die Perlen in 100 Mikrolitern Assay-Puffer.Wirbeln Sie 30 Sekunden lang, bevor Sie das Rohr für 60 Sekunden in einen Magnetabscheider legen, um die Perlen zu trennen. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal. Als nächstes passen Sie die Konzentration der Drei-Plex-Arbeitsmikrosphärenmischung an, indem Sie ein geeignetes Volumen Assay-Puffer hinzufügen, um eine Endkonzentration von 100 Mikrosphären pro Mikroliter für jedes Ziel zu erzeugen.Aliquot 25 Mikroliter der Mikrosphärenmischung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Verdünnen Sie Plasma- oder Serumproben 500-fach im Assay-Puffer und bereiten Sie Standardproben entsprechend der gewünschten Titration vor. Fügen Sie 25 Mikroliter Assay-Puffer als leere Probe hinzu und fügen Sie jede der verdünnten Proben oder den Standard in jede vorgesehene Vertiefung einer 96-Well-Probenplatte hinzu.Wenn Sie fertig sind, bedecken Sie die Platte mit einer Aluminiumdichtung oder -folie, um eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem auf 700 Umdrehungen pro Minute eingestellten Plattenschüttler zu inkubieren. Bereiten Sie eine Lösung von Antikörpern gegen den menschlichen Nachweis oder sekundären Antikörperlösungen mit vier Mikrogramm pro Mikroliter mit Assay-Puffer vor, wie im Manuskript beschrieben. Legen Sie die Platte auf einen Magnetabscheider, um sie schnell zu waschen, und drehen Sie die Platte dann gewaltsam über einen Biohazard-Behälter, um Flüssigkeit aus den Vertiefungen zu entfernen.Wenn die Platte noch umgedreht ist, klopfen Sie die Platte kräftig gegen einen dicken Papierstreifen. Waschen Sie dann jede Vertiefung mit 100 Mikrolitern Assay-Puffer und entfernen Sie die Flüssigkeit durch gewaltsame Inversion über einen Biohazard-Behälter. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal.Nach der letzten Wäsche werfen Sie alle verbrauchten Papierbündel in einen Biohazard-Behälter. Als nächstes fügen Sie 25 Mikroliter sekundäre Antikörper-Arbeitslösung zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu und bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, um auf einem Plattenschüttler mit 700 Umdrehungen pro Minute zu inkubieren. Nach 30 Minuten Inkubation waschen Sie die Vertiefungen der Platte zweimal mit Assay-Puffer, wie zuvor gezeigt.Dann fügen Sie 100 Mikroliter Assay-Puffer in jede Vertiefung der 96-Well-Platte hinzu. Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur. Analysieren Sie eine 60-Mikroliter-Probe über den Geräteanalysator gemäß dem Systemhandbuch.Zur Optimierung der Inkubationszeit des Probeneinfangs inkubieren Sie die Platten für eine Dauer von 30, 60 und 120 Minuten. Analysieren Sie nach der Inkubation 60 Mikroliter der Assay-Mischung auf dem Analysator. Eine Sieben-Punkt-Standardkurve, die auf einer seriellen Verdünnungsreihe von 1:5 basiert, wurde für den Spike S1, die Membranantikörper und das Nukleokapsid ausgewertet.Der Intra-Assay-Präzisionstest wurde auf der Platte durchgeführt, um die Assay-Präzision zu bewerten, die als prozentualer Variationskoeffizient, Standardabweichung und Durchschnitt berechnet wurde. Für die Präzision zwischen den Assays wurden für jeden Assay drei verschiedene Chargen der Perlensets vorbereitet. Es wurden Präzisionsvariablen des Assays mit den Standard- und den humanen Plasmaproben berechnet.Die durchschnittlichen medianen Fluoreszenzintensitätswerte bei 120 Minuten der Inkubation waren optimal für IgG-Titer für die Spike-S1-, die Membran- und die Nukleokapsid-Antikörper, was auf eine schnelle primäre Antikörperbindungskinetik hinweist. Sekundäre Antikörperkonzentrationsoptimierungen in Zweikanalleistung zeigten eine breite Palette von Signalen in linearer Messung für alle Konzentrationen. Die beobachteten Signale aus verschiedenen Zeitinkubationen der Sekundärantikörper und die Details zu den Signalveränderungen für alle Inkubationszeiten sind hier dargestellt.Bei den Spezifitätsbewertungen für Zweikanal-Assays wurde eine vernachlässigbare Kreuzsignalkontamination zwischen dem Blank- und dem Single-Reporter-Kanal beobachtet. In der Darstellung von Sero-Konversionsereignissen nach der COVID-19-Impfung waren die beobachteten Spike-S1-IgA- und IgM-Werte etwa 40-mal niedriger als die IgG-Isotyptiter. Diese Methode hat wichtige Auswirkungen auf die Überwachung der Reaktion auf Impfstoffe bei immungeschwächten Personen.Es wird uns erlauben festzustellen, ob diese Patienten wirklich durch diese Impfungen geschützt werden.

Research

JoVE Journal

Medicine

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