Name: dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לליבת הפיתוח של Rush Biomarker על השימוש במתקנים שלהם, ל-Rush Biorepository לרישום נושאים ולעיבוד ביו-פסימנים, וליוזמת רשת הערכת נגיף הקורונה של קרן וולדר בשיקגו (Chicago CAN) שמספרי המענקים SCI16 (J.R.S. ו-J.A.B.) ו-21-00147 (J.R.S. ו-J.A.B.) ופרס מקרן Swim Across America (J.A.B.).

כל הנבדקים נרשמו בהסכמה מדעת בכתב עם אישור מלא של מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של המרכז הרפואי של אוניברסיטת פרוטוקול ORA 20101207 עם כל ההנחיות המוסדיות לביצוע מחקר אתי שנצפו. הדם נאסף באמצעות פלבוטומיה קונבנציונלית לתוך ווקטיינרים של לבנדר (K2EDTA) ועובד עם פרוטוקולים מומלצים. הפלזמה שהתקבלה אורכבה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לביצוע ההערכות.
1. הכנת מיקרו-ספירות מצומדות אנטיגן
<ol><li>בחר שלושה בקבוקונים שונים של מיקרו-ספירות מגנטיות עם אזורי חרוזים ייחודיים, רישום מזהה חרוזים ומידע רב עבור כל בקבוקון בשימוש. הערה: השלבים הבאים יבוצעו עבור כל אזור מיקרוספרה נפרד. מיקרו-כדורים רגישים לאור ויש להגן עליהם מפני חשיפה ממושכת לאור. במהלך שלבי הכביסה, היזהרו שלא להפריע למיקרוספרות. אם אתה מופרע, אפשר הפרדה שנייה של 60 שניות.</li>
	<li>וורטקס מלאי המיקרוספרה במשך 60 שניות וסוניקאט במשך 5 דקות לפני השימוש כדי לנתק חרוזים מצטברים.</li>
	<li>מעבירים 1.0 x 106 חרוזים לצינורות מיקרו-צנטריפוג' בעלי 1.5 מ"ל בעלי חלבון נמוך.</li>
	<li>הכנס את הצינור למפריד מגנטי ואפשר להפרדה להתרחש במשך 60 שניות. כאשר הצינור עדיין במפריד המגנטי, הסר בזהירות את ה- supernatant מבלי להפריע לכדור החרוז.</li>
	<li>הסר את הצינור מהמפריד המגנטי, החייא את החרוזים עם 100 μL של מים ברמת HPLC, ומערבולת במשך 30 שניות. מניחים את הצינור בחזרה לתוך המפריד המגנטי במשך 60 שניות, ולאחר מכן מסירים את ה-supernatant. חזור על פרוטוקול שטיפה זה פעמיים.</li>
	<li>הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והחזיר את המיקרוספרות השטופות ב- 90 μL של 100 mM נתרן פוספט מונובסי, pH 6.2 (מאגר הפעלה) על ידי מערבולת במשך 30 שניות.</li>
	<li>הוסיפו 10 מיקרול"ל של 50 מ"ג/מ"ל Sulfo-NHS (מדולל עם מאגר הפעלה) למיקרו-ספירות ולמערבולת בעדינות במשך 10 שניות. הוסיפו 10 μL של תמיסת EDC של 50 מ"ג/מ"ל (מדוללת עם מאגר הפעלה) ומערבולת בעדינות למשך 10 שניות. דגירה של מיקרוספרות למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם מערבולת עדינה כל 10 דקות.</li>
	<li>חזור על שלבי שטיפה 1.4-1.5 עם 50 mM MES, pH 5.0 (חיץ צימוד) במקום מים ברמת LC/MS לסך הכל שתי שטיפות.</li>
	<li>הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והחזיר את החרוזים עם 100 μL של חיץ צימוד על ידי מערבולת במשך 30 שניות ומיד לאחר מכן תוספת של כמות החלבון הרצויה.</li>
	<li>הביאו את הנפח הכולל ל-150 μL באמצעות מאגר צימוד. ערבבו את תגובת הצימוד על ידי מערבולת במשך 30 שניות ודגירה למשך 2 שעות על ידי סיבוב ב-RT. הערה: עבור מבחנים המוגדרים כאן, בוצעו הצמדות עם ריכוזי החלבונים הבאים: ספייק S1: 5 מיקרוגרם; נוקליאוקפסיד: 5 מיקרוגרם; ממברנה: 12.5 מיקרוגרם.</li>
	<li>חזור על שלב שטיפה 1.4 עם תמיסת מלח מוחזקת פוספט (PBS)-1% אלבומין בסרום עיזים, 0.01% פוליסורבט-20 (חיץ מרווה) במקום מים בדרגה LC/MS בסך הכל לשתי שטיפות. החזירו את המיקרו-כדורים השטופים ב-100 μL של Quench Buffer המכיל 0.05% נתרן אזיד על ידי מערבולת במשך 30 שניות. הערה: התירו לחרוזים להרוות באופן מלא במשך 6 שעות לפחות לפני שתמשיכו בכל הליך אחר.</li>
	<li>ספרו את מספר המיקרו-ספירות שהתאוששו באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר. תעד את ריכוז החרוזים שנצפה.</li>
	<li>יש לקרר את המיקרוספרות המצומדות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.</li>
</ol>2. נהלים
<ol><li>ביצועי בדיקה (פרוטוקול בסיס)<ol>
<li>החייאת המיקרו-ספירות המצומדות על ידי מערבולת במשך 30 שניות וסוניקאט במשך כ-60-90 שניות.</li>
		<li>הסר את הכמות הנדרשת של כל קולואיד חרוזים מהצינור המתאים ושלב את קולואידי החרוזים בצינור מיקרוצנטריפוג חדש של 1.5 מ"ל.</li>
		<li>הכנס את הצינור למפריד מגנטי ואפשר להפרדה להתרחש במשך 60 שניות. כאשר הצינור עדיין במפריד המגנטי, הסר בזהירות את ה- supernatant מבלי להפריע לכדור החרוז.</li>
		<li>הסר את החרוזים מהמפריד, החזירו את החרוזים עם 100 μL של אלבומין סרום PBS-1% בקר, 0.01% Polysorbate-20 (Assay Buffer) ומערבולת במשך 30 שניות. מקם את הצינור במפריד מגנטי ואפשר להפרדה להתרחש במשך 60 שניות. חזור על פרוטוקול כביסה זה (כלומר, שלבים 2.1.3-2.1.4) פעמיים</li>
		<li>התאם את הריכוז של תערובת המיקרוספרה העובדת 3-plex על ידי הוספת נפח מתאים של Assay Buffer כדי ליצור ריכוז סופי של 100 מיקרוספרות לכל 1 μL עבור כל מטרה.</li>
		<li>Aliquot 12.5 μL של תערובת המיקרוספרה שהוכנה בשלב 2.1.5 לכל באר של צלחת של 384 באר או 25 μL לתוך כל באר של צלחת 96 באר.</li>
		<li>דיללו את דגימות הפלזמה/סרום פי 500 ב-Assay Buffer. להכין דגימות סטנדרטיות על פי טיטרציה הרצויה.</li>
		<li>הוסיפו 12.5 μL של Assay Buffer כדגימה הריקה והוסיפו כל אחת מהדגימות המדוללות או התקן לכל באר ייעודית של לוח דגימה של 384 בארות או 25 μL של הדגימה הריקה והמדוללת או התקן לכל באר של לוח דגימה בן 96 בארות.</li>
		<li>כסו את הצלחת בחותם אלומיניום או בנייר כסף ודגרו במשך שעה אחת ב-RT על שייקר צלחת שנקבע ל-700 סל"ד. הערה: סכמטית עבור עקומות הדילול מופיעה בטבלה 1.</li>
		<li>הכינו תמיסה של נוגדנים נגד בני אדם לזיהוי (פתרונות נוגדנים משניים) ב-4 מיקרוגרם/מ"ל עם Assay Buffer כמפורט בשלב 2.1.11.</li>
		<li>הכן עז-אנטי-אדם IgM, מצומד עם סופר בהיר 436 (SB)/עז-אנטי-אנושי IgA, Phycoerythrin (PE) מצומד מזהה נוגדנים ב 4 מיקרוגרם / מ"ל; או IgM עז-אנטי-אנושי, SB מצומד/עז-אנטי-אנושי IgG, PE מצומד מזהה נוגדנים ב 4 מיקרוגרם/מ"ל. הערה: עבור פורמט צלחת 384-well, נדרש 12.5 μL/באר של תמיסת הנוגדן המשנית המוכנה, ולפורמט של צלחת 96 באר, נדרש 25 μL/well.</li>
		<li>הניחו את הצלחת על מפריד מגנטי, שטפו במהירות והתהפכו בכוח על מיכל ביו-האזרד כדי להסיר את הנוזל מהבארות. כשהצלחת עדיין הפוכה, הקש בכוח על הצלחת על ערימת נייר עבה.</li>
		<li>יש לשטוף כל באר עם 100 μL של Assay Buffer ולהסיר את הנוזל על ידי היפוך כוחני מעל מיכל biohazard, כפי שתואר קודם לכן. חזור על שלבים אלה (2.1.12-2.1.13) ובסך הכל שתי שטיפות. השליכו את כל ערימות הנייר המשומשות לתוך מיכל ביו-האזרד.</li>
		<li>הוסיפו 12.5 μL של תמיסת הנוגדן המשני לכל באר של צלחת 384 קידוח או 25 μL לכל באר של צלחת של 96 בארות. מכסים את הצלחת בחותם אלומיניום או בנייר כסף ומדגרים למשך 30 דקות ב-RT על שייקר צלחת שנקבע ל-700 סל"ד.</li>
		<li>חזור על שלבי שטיפה 2.1.12-2.1.13</li>
		<li>הוסיפו 75 μL של Assay Buffer לכל באר של צלחת של 384 בארות או 100 μL לכל באר של צלחת של 96 בארות. מכסים את הצלחת בחותם אלומיניום או בנייר כסף ומדגרים למשך 5 דקות ב-RT על שייקר צלחת שנקבע ל-700 סל"ד.</li>
		<li>נתח 60 μL באמצעות מנתח המכשירים על פי מדריך המערכת.</li>
	</ol></li>
	<li>אופטימיזציה של זמן הדגירה של לכידת הדגימה<ol>
<li>בצע את השלבים בסעיף 2.1 באמצעות משך זמני הדגירה של 30 דקות, 60 דקות ו-120 דקות בשלב 2.1.9. הערה: ניתן לבצע דגירות עם לוחות נפרדים או על ידי השהיה בשלב 2.1.6 עד למועד המשך לשלב 2.1.9. כדי להשיג את זמני הדגירה הרצויים.</li>
		<li>המשך עם קריאת הצלחת על המנתח באמצעות 60 μL של תערובת הבדיקה על פי המלצות היצרן.</li>
	</ol></li>
	<li>אופטימיזציה של ריכוז נוגדנים משני<ol>
<li>בצע הליך זה כמפורט בסעיף 2.1, למעט הריכוזים הסופיים של ריאגנטים בתמיסת העבודה של הנוגדנים המשניים (שהוכן בשלב 2.1.10-2.1.11) שונה כדלקמן: עז-אנטי-אדם (או ארנב) IgM, נוגדנים לזיהוי צמד-SB ב-8, 4, 2, 1 ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל. עז-אנטי-אדם (או ארנב) IgA, PE-מצומדת נוגדנים לזיהוי 8, 4, 2, 1 ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל. נוגדנים לזיהוי עזים נגד אדם (או ארנב) IgG, PE-מצומדים ב-8, 4, 2, 1 ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל. עז-אנטי-אדם (או ארנב) IgG, PE-מצומד/עז-אנטי-אדם (או ארנב) IgM, נוגדנים לזיהוי מצומדים SB ב-8, 4, 2, 1 ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל. עז-אנטי-אדם (או ארנב) IgA, PE-מצומד/עז-אנטי-אדם (או ארנב) IgM, נוגדנים לזיהוי מצומדים SB ב-8, 4, 2, 1 ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל.</li>
		<li>המשך עם קריאת הצלחת על המנתח באמצעות 60 μL של תערובת הבדיקה על פי המלצות היצרן.</li>
	</ol></li>
	<li>אופטימיזציה של זמן הדגירה של נוגדנים משניים<ol>
<li>בצע הליך זה כמפורט בסעיף 2.1 עם 15 דקות, 30 דקות, 60 דקות ו-120 דקות של משך דגירה המוגדר בשלב 2.1.14.</li>
		<li>המשך עם קריאת הצלחת על המנתח באמצעות 60 μL של תערובת הבדיקה על פי המלצות היצרן.</li>
	</ol></li>
	<li>הערכה של דגימות נושא עם מבחנים דו-ערוציים ממוטבים<ol>
<li>אסוף דגימות פלזמה של נבדקים (n = 4) בימים -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90, +90 ו-+120 ביחס להשלמת מתן החיסון נגד קוביד-19 (כלומר, מנה שנייה). הערה: יום 0 מייצג את נקודת הזמן לפיה החיסון הושלם.</li>
		<li>בצע את כל הבדיקות באמצעות פרוטוקול הבסיס (סעיף 2.1.) כבדיקה דו-ערוצית של IgG/IgM או IgA/IgM.</li>
		<li>נרמל את התוצאות לערך העוצמה הפלואורסצנטית החציונית (MFI) המרבי שנצפה עבור כל אימונוגלובולין ובדיקה ספציפיים.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+in+the+multiplex+era:+potentials+and+pitfalls.">ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls.</a> Proteomics - Clinical Applications. 9, 406-422 (2015).</li><li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method.">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4084 (2012).</li><li>Powell, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+microsphere-based+immunoassay+increases+the+sensitivity+of+siv-specific+antibody+detection+in+serum+samples+and+mucosal+specimens+collected+from+rhesus+macaques+infected+with+SIVmac239.">A multiplex microsphere-based immunoassay increases the sensitivity of siv-specific antibody detection in serum samples and mucosal specimens collected from rhesus macaques infected with SIVmac239.</a> BioResearch Open Access. 2 (3), 171-178 (2013).</li><li>Volpetti, F., Garcia-Cordero, J., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+high-throughput+multiplexed+protein+quantitation.">A microfluidic platform for high-throughput multiplexed protein quantitation.</a> PLoS One. 10 (2), 0117744 (2015).</li><li>Rabi, F. A., Al Zoubi, M. S., Kasasbeh, G. A., Salameh, D. M., Al-Nasser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+and+coronavirus+disease+2019:+What+we+know+so+far.">SARS-CoV-2 and coronavirus disease 2019: What we know so far.</a> Pathogens. 9 (3), 231 (2020).</li><li>Asif, M., Xu, Y., Xiao, F., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+COVID-19,+vitality+of+emerging+technologies+and+preventive+measures.">Diagnosis of COVID-19, vitality of emerging technologies and preventive measures.</a> Chemical Engineering Journal. 423, 130189 (2021).</li><li>La Marca, A., Capuzzo, M., Paglia, T., Roli, L., Trenti, T., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+for+SARS-CoV-2+(COVID-19):+a+systematic+review+and+clinical+guide+to+molecular+and+serological+in-vitro+diagnostic+assays.">Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays.</a> Reproductive Biomedicine Online. 41 (3), 483-499 (2020).</li><li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limit+of+blank,+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation.">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 29, 49-52 (2008).</li><li>Tarhoni, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+circulating+tumor-associated+autoantibodies+and+clinical+outcomes+in+advanced-stage+NSCLC+patients+receiving+PD-1/-L1+directed+immune+checkpoint+inhibition.">Relationship between circulating tumor-associated autoantibodies and clinical outcomes in advanced-stage NSCLC patients receiving PD-1/-L1 directed immune checkpoint inhibition.</a> Journal of Immunological Methods. 490, 112956 (2021).</li><li>Deeks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+tests+for+identification+of+current+and+past+infection+with+SARS-CoV-2.">Antibody tests for identification of current and past infection with SARS-CoV-2.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 6, 013652 (2020).</li><li>Mahalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+humoral+immune+responses+against+SARS-CoV-2+in+patients+with+COVID-19+disease+and+the+value+of+antibody+testing.">Landscape of humoral immune responses against SARS-CoV-2 in patients with COVID-19 disease and the value of antibody testing.</a> Heliyon. 7 (4), 06836 (2021).</li><li>Ruano-Gallego, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+antigen+microarray+for+simultaneous+IgG+and+IgM+detection+against+SARS-CoV-2+reveals+higher+seroprevalence+than+reported.">A multiplex antigen microarray for simultaneous IgG and IgM detection against SARS-CoV-2 reveals higher seroprevalence than reported.</a> Microbial Biotechnology. 14 (3), 1228-1236 (2021).</li><li>Shah, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+and+IgM+antibody+formation+to+spike+and+nucleocapsid+proteins+in+COVID-19+characterized+by+multiplex+immunoblot+assays.">IgG and IgM antibody formation to spike and nucleocapsid proteins in COVID-19 characterized by multiplex immunoblot assays.</a> BMC Infectious Diseases. 21 (1), 325 (2021).</li><li>Gambino, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+rapid+immunochromatographic+test+with+a+chemiluminescence+immunoassay+for+detection+of+anti-SARS-CoV-2+IgM+and+IgG.">Comparison of a rapid immunochromatographic test with a chemiluminescence immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG.</a> Biochemia Medica (Zagreb). 30 (3), 030901 (2020).</li><li>Algaissi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+S1+and+N-based+serological+assays+reveal+rapid+seroconversion+and+induction+of+specific+antibody+response+in+COVID-19+patients.">SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients.</a> Scientific Reports. 10, 16561 (2020).</li><li>Chiereghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+evaluation+of+serological+assays+for+the+diagnosis+of+SARS-CoV-2+infection+and+COVID-19.">Recent advances in the evaluation of serological assays for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection and COVID-19.</a> Frontiers in Public Health. 8, 620222 (2020).</li><li>Nicol, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+SARS-CoV-2+serological+tests+for+the+diagnosis+of+COVID-19+through+the+evaluation+of+three+immunoassays:+Two+automated+immunoassays+(Euroimmun+and+Abbott)+and+one+rapid+lateral+flow+immunoassay+(NG+Biotech).">Assessment of SARS-CoV-2 serological tests for the diagnosis of COVID-19 through the evaluation of three immunoassays: Two automated immunoassays (Euroimmun and Abbott) and one rapid lateral flow immunoassay (NG Biotech).</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104511 (2020).</li><li>Butt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+multiplex+serology+to+serolomics-A+novel+approach+to+the+antibody+response+against+the+SARS-CoV-2+proteome.">From multiplex serology to serolomics-A novel approach to the antibody response against the SARS-CoV-2 proteome.</a> Viruses. 13 (5), 749 (2021).</li><li>Byrum, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=multiSero:+open+multiplex-ELISA+platform+for+analyzing+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+infection.">multiSero: open multiplex-ELISA platform for analyzing antibody responses to SARS-CoV-2 infection.</a> medRxiv. , (2021).</li><li>Dobano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+specific+multiplex+antibody+assays+to+quantify+immunoglobulins+m,+a,+and+g+against+SARS-CoV-2+antigens.">Highly sensitive and specific multiplex antibody assays to quantify immunoglobulins m, a, and g against SARS-CoV-2 antigens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 01731 (2021).</li><li>Schultz, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+multiplex+microsphere+immunoassay+using+dried+blood+spots+for+SARS-CoV-2+seroprevalence:+Application+in+first+responders+in+first+responders+in+Colorado,+USA.">Development and validation of a multiplex microsphere immunoassay using dried blood spots for SARS-CoV-2 seroprevalence: Application in first responders in first responders in Colorado, USA.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (6), 00290 (2021).</li><li>Beavis, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+EUROIMMUN+anti-SARS-CoV-2+ELISA+assay+for+detection+of+IgA+and+IgG+antibodies.">Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468 (2020).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+performance+of+a+semi-quantitative+assay+for+SARS-CoV2+IgG+and+SARS-CoV2+IgM+antibodies.">Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).</li></ol>

ד"ר בורג'ה הוא ממציא המבחן הסרולוגי המשמש בכתב יד זה, הממתין לפטנט. המאמר מוצג באופן תיאורי בלבד ללא ניתוחים סטטיסטיים המוצגים כדי למנוע הטיה פוטנציאלית שהוצגה על ידי קונפליקט המחברים.

ההערכה של תגובה חיסונית לחשיפה ל- SARS-CoV-2, בשילוב עם מעקב מבוסס RT-PCR אחר מצב הזיהום, תוארה היטב כמרשם להבהרת מהלך ההחלמה מקוביד-19, לשמש כאמצעי לזיהוי פלזמת החלמה עם ערך טיפולי פוטנציאלי, ולסקר את שיעורי ההדבקה על בסיס אוכלוסייה10,11. דוגמאות שונות להבנת סרוקונוורסיה אצל נבדקים אנושיים כוללות מערכי חלבונים (אנטיגן)12, אימונובלוטים13, מבנים אימונוכרומטוגרפיים מהירים14, ובדיקות אימונוסורבנטיות הקשורות לאנזים (ELISAs)15,16,17. כל אחת מהטכניקות הנ"ל יכולה להעריך איזוטיפים מרובים של אימונוגלובולינים בנפרד עם שינויים קלים. עם זאת, נהלים אלה אינם מסוגלים להיות מיושמים מחדש באופן מעשי כדי לאפשר ניתוח מקביל של איזוטיפים מרובים, כפי שמוצג בכתב יד זה, מה שהופך את גורמי העלות והתפוקה כמגבלות לניהולם על אסטרטגיית בדיקה בקנה מידה מבוסס אוכלוסייה. כמה מהיישומים הללו מספקים גם את ההזדמנות לשרשר רמות של אנטיגנים מרובים במקביל, כפי שהוצגו או בפורמטים שהשתנו, כגון מולטיפלקס ELISA18,19. לבסוף, פלטפורמת האימונו-ביצות מספקת את האפשרות להעריך רמות של אנטיגנים מרובים במקביל ל-20,21, אך הוגבלה לאפיטופ יחיד (כלומר, איזוטיפ אימונוגלובולינים) לכל בדיקה, אלא אם כן, עם זאת, נעשה שימוש במכשיר האחרון עם יכולות הבדיקה 'הדו-ערוציות'.
בדו"ח זה מפורטים פרוטוקולים הקובעים מדידה אמינה של אפיטופים מרובים בבדיקת אימונו-קדם באמצעות המכשיר במצב 'דו-ערוצי' במקרה בוחן של seroconversion של אנשים מחוסנים ב-Covid-19. השיטה הפגינה דיוק מצוין (ערכי CV של%, בדרך כלל <20%) באמצעות עיצובי בדיקה ידניים שניתן לשפר עם שילוב של מערכות אוטומטיות מעבדתיות. רגישות הבדיקה והטווח הדינמי של כל האנליטים והאפיטופים שנבחרו התאימו להערכות שגרתיות. אף על פי שהיעדר אנטי-אנטיגן IgA ו-IgM immunoreagents הזמינים מסחרית הגביל את הכמות לאיזוטיפ של IgG, הגבלה כזו אינה מונעת את היכולת להציע הערכות או הערכות כמותיות למחצה ביחס לדגימה מסוימתכקליברנט 22,23.
הבדיקה החיסונית המאומתת הוקצתה כדי לחקור סרוקונוורסיה בקבוצה של אנשים שחוסנו בחיסון נגד קוביד-19. בניגוד לפלטפורמות דומות אחרות, משפחת המכשור מאפשרת חיפוש של seroconversion במאות אנשים ביום בזרימת עבודה ידנית ואלפי ביום בתוכנית אוטומטית. באופן כללי, ממצאים אלה מאשרים כי לגישת 'הערוצים הכפולים' יש רגישות מתאימה לתיאור אפיטופים מרובים במקביל למאמר זהה והיא בת קיימא בהקשר רב-אנליטי. הבדל ברגישויות לערוץ 1 ולערוץ 2, כפי שבוצעו עם פיקוריתרין ופלואורופורים Super Bright 436, בהתאמה, עשוי להצדיק תכנון של ניסוי ספציפי כדי להבטיח תוצאות אנליטיות בנות קיימא שנרכשו עבור ניסוי נתון. כלומר, ההסתייגות של ערוץ 1 עבור אפיטופים או אנליטים של שכיחות נמוכה יותר עשויה להיות נחוצה כדי לשמור על טווח דינמי של הבדיקה הכולל את הערכים הנצפים של לא ידועים. מעבר לשיקול זה, תכנון הבדיקה היה ברור ואמור להיות נגיש למעבדות בעלות יכולות אנליטיות מוגבלות. אין ספק שיש לשקול את השיקול הזה כאשר בוחנים את ההפרעה של ערוץ 1 לערוץ 2, כפי שציינו באיור 5, לפיו הפרעה מאיזוטיפים של שפע גבוה יותר עלולה לגרום לטעויות אנליטיות מטעות עבור אלה שנמצאים בשפע נמוך בהרבה כאשר הם נמדדים בתבנית דו-ערוצית. פוטנציאל זה להתערבות במצבים עם ריכוזי אנאליטים שונים מאוד עשוי להוות מגבלה משמעותית לגישה אם לא תטופל כראוי בשלב תכנון הבדיקה.
לסיכום, הוצגה שיטה למדידה מהירה של טיטרים של נוגדנים מהאיזוטיפים העיקריים של אימונוגלובולינים הקשורים לתגובה חיסונית לזיהום או לחיסון של Covid-19. יישום גישה זו באופן אורכי להערכת seroconversion עשוי לספק תובנות שניתן להשתמש בהן טוב יותר כדי לנהל ו / או לפקח על מהלך המחלה או, לחלופין, להנחות תוכניות חיסון פוטנציאליות נגד דחף Covid-19.

מדידה סימולטנית של סמנים ביולוגיים מרובים הקשורים למחלות בדגימות ביולוגיות מאפשרת תובנות תיאוריות ומנבאות על תהליכים פתולוגיים. בעוד שפרוצדורות אימונולוגיות קונבנציונליות של אנליטה בודדת, כגון מבחני אימונוסורבנטים הקשורים לאנזים (ELISAs), היו אבן הפינה של ניתוחים כמותיים הן במסגרת הקלינית והן במסגרת המחקרית, לטכניקות אלה יכולות להיות מגבלות משמעותיות לגבי התפוקה, כמות הדגימות הנדרשת לכל מדידה, וחסכוניות המגבילה מאוד את המחקר של אלמנטים ביולוגיים מרובים השזורים זה בזה לעתים קרובות במהלך המחלה1 . טכנולוגיית ריבוב מבוססת מיקרוספרה הפכה לפלטפורמה חיונית עבור מתקני אבחון ומחקר כאחד בזכות יכולתה לשלב מבחנים כדי לשפר את תפוקת המעבדה, לצמצם את המחסור בדגימות ולהפחית בדיקות חוזרות ונשנות כדי למקסם את החיסכון בעלויות 1,2,3,4. לאחרונה, הוכנסה הרחבה נוספת של כוח ריבוב זה עם מכשירים בעלי יכולות דיווח כפול. תכונת הכתב הכפול מיישמת שני ערוצים פלואורסצנטיים לזיהוי, ומספקת ממד נוסף של ריבוב, המאפשר זיהוי של אפיטופים מרובים על אותו אנאליט.
תסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2) הוא הפתוגן האחראי למחלת נגיף הקורונה הנוכחית 2019 (COVID-19) מגיפה5. בעוד שבדיקת RT-PCR חיונית לאישור זיהום בתחילת קורס המחלה, בדיקות סרולוגיות של טיטרים נוגדנים הוכיחו את עצמן כהכרחיות לביקורת מדויקת ומלאה של אנשים לגבי חשיפה או החלמה קודמת; תגובה לחיסון; ו/או הערכה של יעילות החיסון נגד קוביד-19 6,7.
דו"ח זה תוחם שיטות למדידת seroconversion עבור אנטיגנים נגיפיים מרובים מסוג SARS-CoV-2 המשתמשים במערכת דיווח כפול מבוססת זרימה, מרובבת קוראים. באופן ספציפי, מתואר זיהוי בו-זמני של שני תתי-סוגים של נוגדנים (המוגדרים כ-IgG/IgM או IgA/IgM) עבור פאנל אנטיגנים 3-plex SARS-CoV-2 הכולל בדיקות עבור גליקופרוטאינים של ספייק S1, נוקליאוקפסיד וממברנה (המכונה גם מטריקס). גישה זו מספקת מיזם אידיאלי ללכידת סרו-קונברסיה אורכית ותורמת כלי רב ערך בארסנל נגד מגיפת Covid-19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well black side polystyrene microtiter plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-565-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, heat shock fraction</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A-7888-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS8574735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA35391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Albumin, Fraction V Powder</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2514-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB205009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB204009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB403009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB202009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62999842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Analyzer</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>INTELLIFLEX-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex-C Microspheres, Region XXX</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>MC10XXX-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate aluminum sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>07-200-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-751-7328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-V08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40591-V08H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40592-T62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-R0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb</td>
			<td>ProSci</td>
			<td>10-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>W-64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19

טכנולוגיות מולטיפלקס לחקירת סמנים ביולוגיים מרובים בתיאום קיימות כבר כמה עשורים; עם זאת, שיטות להערכת אפיטופים מרובים על אותו אנאליט נותרו מוגבלות. דו"ח זה מתאר את הפיתוח והאופטימיזציה של בדיקה חיסונית מרובת בדיקה לצורך בדיקות סרולוגיות של איזוטיפים נפוצים של אימונוגלובולינים (למשל, IgA, IgM ו-IgG) הקשורים לתגובה חיסונית לזיהום או לחיסון SARS-CoV-2. הבדיקות נעשו באמצעות קורא פלואורסצנטי מרובה מבוסס זרימה עם יכולת דו-ערוצית. האופטימיזציות התמקדו בזמן לכידת האנליטים, באיתור ריכוז נוגדנים ובזמן הדגירה של נוגדני זיהוי. מאפייני ביצועי הבדיקה האנליטית (לדוגמה, טווח הבדיקה (כולל הגבולות התחתונים והעליונים של הכמות); ודיוק תוך-זמני ובין-בדיקות) נקבעו עבור צירוף סרוטיפ IgG/IgM או IgA/IgM במקביל באמצעות מצב 'ערוץ כפול'. זמני לכידת Analyte של 30 דקות עבור IgG, 60 דקות עבור IgM ו -120 דקות עבור IgA היו מתאימים לרוב היישומים, וסיפקו איזון של ביצועי הבדיקה והתפוקה. נצפו דגירות נוגדנים אופטימליות של 4 מיקרוגרם/מ"ל במשך 30 דקות, והן מומלצות ליישומים כלליים, בהתחשב בדיוק המצוין הכולל (אחוז מקדם השונות (%CV) ≤ 20%) וערכי הרגישות שנצפו. הטווח הדינמי של איזוטיפ ה-IgG השתרע על פני מספר סדרי גודל עבור כל בדיקה (Spike S1, Nucleocapsid ו-Membrane glycoproteins), התומך בהערכות טיטר חזקות בגורם דילול של 1:500 עבור יישומים קליניים. לבסוף, הפרוטוקול הממוטב יושם על ניטור seroconversion ספייק S1 עבור נבדקים (n = 4) שהשלימו משטר חיסון SARS-CoV-2. בתוך קבוצה זו, רמות ה-IgG של ספייק S1 נצפו כמגיעות לטייטרים מרביים לאחר 14 יום לאחר מתן המנה השנייה, בעוצמת אות גבוהה בהרבה (פי 40 כ-40) מאשר איזוטיפים של IgM או IgA. באופן מעניין, ראינו שיעורי דעיכה משתנים מאוד של ספייק S1 IgG שנצפו שיעורי דעיכה שהיו תלויים במידה רבה בנושא, שיהיו הנושא של מחקרים עתידיים.

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

מאמר זה מתאר שיטה נוחה לניטור שינויים דינמיים בטיטרים של נוגדנים עבור שני איזוטיפים של אימונוגלובולינים בו זמנית (IgA, IgM או IgG) הנובעים מתגובה חיסונית לזיהום SARS-CoV-2 או לחיסון. 'פאנל התגובה החיסונית הרב-אנליטית של Covid-19' משתמש בשלושה מבחנים חיסוניים עקיפים הבנויים על מיקרו-ספירות מקודדות הנקראות באמצעות קורא מולטיפלקס מבוסס זרימה עם יכולת 'דו-ערוצית'.

ניטור דינמי של Seroconversion באמצעות בדיקת אימונו-בייד רב-אנליטית לקוביד-19

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

השיטה שנדגים היום מספקת פתרון בתפוקה גבוהה להערכת המרת sero של נוגדנים הקשורים לזיהומים ב-COVID-19 או לחיסון לניתוחים שגרתיים. באופן מעניין, גישה זו מאפשרת לנו להעריך אפיטופים מרובים על אותו אנאליט. יש לכך יישומים רבים במדעי הביולוגיה, כולל מחקרי איתות תאי וניטור תגובות חיסוניות.מי שידגים את הטכניקה הזו עבורכם היום יהיה ד"ר עימאד טארהוני, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. כדי להתחיל, בחר שלושה בקבוקונים שונים של המיקרו-ספירות המגנטיות עם אזורי חרוזים ייחודיים ותעד את מזהה החרוזים ומידע רב עבור כל בקבוקון בשימוש. לאחר מכן, מערבולת את מלאי המיקרוספרה שנבחרה במשך 60 שניות וסוניק במשך חמש דקות.מעבירים 1.0 כפול 10 לששת החרוזים לצינור מיקרו-צנטריפוג נמוך חלבון בעל 1.5 מיליליטר ומכניסים את הצינור למפריד מגנטי. כדי לאפשר את ההפרדה למשך 60 שניות. כאשר הצינור עדיין במפריד המגנטי, הסר בזהירות את ה- supernatant מבלי להפריע לכדור החרוז.הסר את הצינור מהמפריד המגנטי, ולאחר מכן החייא את החרוזים עם 100 מיקרוליטרים של מים ומערבולת ברמת HPLC למשך 30 שניות. שוב, מניחים את הצינור בחזרה לתוך המפריד המגנטי למשך 60 שניות ולאחר מכן מסירים את הסופרנטנט. חזור על פרוטוקול הכביסה פעמיים.לאחר הכביסה האחרונה, הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והחזיר את המיקרו-ספירות השטופות ב-90 מיקרוליטרים של מאגר הפעלה, pH 6.2, על ידי מערבולת למשך 30 שניות. לאחר מכן, טיפול רציף במיקרו-ספירות עם 10 מיקרוליטרים של 50 מיליגרם למיליליטר אנהידרוקסי-סולפוסוצ'ינאמיד ו-10 מיקרוליטרים של 50 מיליגרם לתמיסת EDC למיליליטר על ידי מערבולת למשך 10 שניות. מאוחר יותר, דגירה של המיקרו-כדורים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם מערבולת עדינה כל 10 דקות.לאחר הדגירה, לשטוף את המיקרוספרות פעמיים עם MES 50 מילימולרי או חיץ צימוד, pH 5.0, כפי שתואר קודם לכן. חזור על הכביסה פעמיים. לאחר הסיום, הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והחזיר את החרוזים עם 100 מיקרוליטרים של חיץ צימוד על ידי מערבולת למשך 30 שניות, ולאחר מכן מיד על ידי הוספת כמות החלבון הרצויה לצינור.הביאו את הנפח הכולל ל-150 מיקרוליטרים עם מאגר צימוד וערבבו את התגובה על ידי מערבולת למשך 30 שניות. לאחר מכן, דגירה של הצינור במשך שעתיים על ידי סיבוב בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את המיקרוספרות פעמיים עם מאגר מרווה PBS והחזירו את המיקרוספרות השטופות ב-100 מיקרוליטרים של מאגר מרווה המכילים 0.05% נתרן אזיד על ידי מערבולת למשך 30 שניות.ספרו את מספר המיקרו-ספירות שהתאוששו באמצעות מונה תאים אוטומטי ותעדו את ריכוז החרוזים שנצפה. לצורך ביצוע הבדיקה, בצעו החייאה של המיקרו-ספירות המצומדות על ידי מערבולת למשך 30 שניות והצליל למשך 60 עד 90 שניות. לאחר מכן, הסר את הכמות הנדרשת של כל קולואיד חרוז מהצינור המתאים ושלב את קולואידי החרוזים בצינור מיקרו-צנטריפוג חדש של 1.5 מיליליטר.לאחר מכן, הכנס את הצינור למפריד מגנטי ואפשר הפרדה למשך 60 שניות. כאשר הצינור עדיין במפריד המגנטי, הסר את ה- supernatant מבלי להפריע לכדור החרוז. לאחר הסרת החרוזים מהמפריד, יש להחיות את החרוזים ב-100 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה.מערבולת במשך 30 שניות לפני שמניחים את הצינור במפריד מגנטי למשך 60 שניות כדי להפריד בין החרוזים. חזור על הכביסה פעמיים. לאחר מכן, התאם את הריכוז של תערובת המיקרוספרה העובדת בעלת שלושת המלפלים על ידי הוספת נפח מתאים של מאגר בדיקה כדי ליצור ריכוז סופי של 100 מיקרוספרה לכל מיקרו-לייטר אחד עבור כל מטרה.Aliquot 25 מיקרוליטרים של תערובת המיקרוספרה לתוך כל באר של צלחת 96 באר. דיללו דגימות פלזמה או סרום פי 500 במאגר בדיקה והכינו דגימות סטנדרטיות בהתאם לטיטרציה הרצויה. הוסף 25 מיקרוליטרים של מאגר הבדיקה כדגימה הריקה והוסף כל אחת מהדגימות המדוללות או התקן לכל באר ייעודית של לוח דגימה בן 96 בארות.בסיום, מכסים את הצלחת בחותם אלומיניום או בנייר כסף כדי לדגום במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על שייקר צלחת שנקבע ל-700 סיבובים לדקה. הכינו תמיסה של נוגדנים נגד זיהוי נגד בני אדם או תמיסות נוגדנים משניות בארבעה מיקרוגרם למיקרוליטר עם מאגר בדיקה כמתואר בכתב היד. מניחים את הצלחת על מפריד מגנטי כדי לשטוף במהירות ואז הופכים בכוח את הצלחת מעל מיכל ביוהאזרד כדי להסיר את הנוזל מהבארות.כשהצלחת עדיין הפוכה, הקש בכוח על הצלחת על ערימת נייר עבה. לאחר מכן, לשטוף כל באר עם 100 microliters של מאגר בדיקה ולהסיר את הנוזל על ידי היפוך כוחני על מיכל biohazard. חזור על הכביסה פעמיים.לאחר הכביסה האחרונה, השליכו את כל ערימות הנייר המשומשות לתוך מיכל ביו-האזרד. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תמיסת עבודה משנית של נוגדנים לכל באר של צלחת של 96 קידוחים וכיסו את הצלחת בנייר אלומיניום כדי לדגור על שייקר צלחת ב-700 סיבובים בדקה. לאחר 30 דקות של דגירה, שטפו את בארות הצלחת פעמיים עם חיץ בדיקה כפי שהודגם קודם לכן.לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חיץ בדיקה לכל באר של צלחת 96 הבארות. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדגרים במשך חמש דקות על שייקר צלחת בטמפרטורת החדר. נתח דגימה של 60 מיקרוליטר באמצעות מנתח המכשירים על פי מדריך המערכת.לצורך אופטימיזציה של זמן הדגירה של לכידת הדגימה, יש לדגום את הלוחות למשך 30, 60 ו-120 דקות. לאחר הדגירה, לנתח 60 microliters של תערובת הבדיקה על המנתח. עקומה סטנדרטית בת שבע נקודות המבוססת על סדרת דילול סדרתי של 1:5 הוערכה עבור הספייק S1, נוגדני הממברנה והנוקליאוקפסיד.בדיקת הדיוק תוך-בדיקה בוצעה על הלוח כדי להעריך את דיוק הבדיקה שחושב כמקדם אחוז של שונות, סטיית תקן וממוצע. למען הדיוק בין המבחנים, הוכנו שלוש קבוצות נפרדות של ערכות החרוזים לכל בדיקה. חושבו משתני הדיוק של הבדיקה עם תקן ודגימות הפלזמה האנושיות.ערכי העוצמה הפלואורסצנטית החציונית הממוצעת ב-120 דקות של הדגירה היו אופטימליים עבור טיטר IgG עבור הספייק S1, הממברנה והנוגדנים הנוקליאוקפסידים, מה שמצביע על קינטיקה של נוגדנים ראשוניים מהירים. אופטימיזציות של ריכוז נוגדנים משניים בביצועי תעלות כפולות הדגימו מגוון רחב של אותות במדידה ליניארית לכל הריכוזים. האותות הנצפים מדגירות זמן שונות של הנוגדנים המשניים והפרטים על שינויי האותות עבור כל זמני הדגירה מוצגים כאן.בהערכות הספציפיות לבדיקות דו-ערוציות, נצפה זיהום זניח של אותות צולבים בין הריק לערוץ הכתב היחיד. בהמחשה של אירועי המרת סרו בעקבות חיסון COVID 19, ערכי ה-IgA וה-IgM הנצפים של הזינוק שנצפו היו נמוכים בערך פי 40 מהטיטרים האיזוטיפיים של IgG. לשיטה זו יש השלכות חשובות על ניטור התגובה לחיסונים אצל אנשים מדוכאי חיסון.זה יאפשר לנו לקבוע אם החולים האלה באמת מקבלים הגנה על ידי החיסונים האלה.

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

ויזואליזציה כמותי וזיהוי של סרטן העור באמצעות הדמיה תרמית Dynamic

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Computerized Dynamic Posturography for Postural Control Assessment in Patients with Intermittent Claudication

Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic ...

Dynamic Lung Tumor Tracking for Stereotactic Ablative Body Radiation Therapy

מעקב גידול ריאות דינמי לstereotactic פולשני גוף קרינת תרפיה

Physicians considering stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) for the treatment of extracranial cancer targets must be aware of the sizeable ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

פרוטוקול מפורט עבור ניטור זיעה באמצעות רומן, קטן, מכשיר אלחוטי

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

זיהוי מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת המערכת

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Evaluation of Capnography Sampling Line Compatibility and Accuracy when Used with a Portable Capnography Monitor

הערכה של תאימות ודיוק של קו דגימה קפונוגרפיה בעת שימוש עם צג קפונוגרפיה נייד

Capnography is commonly used to monitor patient&#8217;s ventilatory status. While sidestream capnography has been shown to provide a reliable assessment ...

Real-Time Dynamic Navigation System for the Precise Quad-Zygomatic Implant Placement in a Patient with a Severely Atrophic Maxilla

מערכת ניווט דינמית בזמן אמת למיקום מדויק של שתל מרובע זיגומטי במטופל עם מקסילה אטרופית קשה

Zygomatic implants (ZIs) are an ideal way to address cases of a severely atrophic edentulous maxilla and maxilla defects because they replace extensive ...

Dynamic Navigation for Dental Implant Placement

ניווט דינמי למיקום שתלים דנטליים

In modern implantology, the application of surgical navigation systems is becoming increasingly important. In addition to static surgical navigation ...

A Surgical Model of Heart Failure with Preserved Ejection Fraction in Tibetan Minipigs

מודל כירורגי של אי ספיקת לב עם מקטע פליטה שמור במיני-חזירים טיבטיים

More than half of heart failure (HF) cases are classified as heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) worldwide. Large animal models are ...

Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

ניווט דינמי באנדודונטיה: הכנת חלל גישה מודרכת באמצעות מערכת ניווט ממוזערת

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...