Name: dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare il Rush Biomarker Development Core per l'uso delle loro strutture, il Rush Biorepository per l'arruolamento dei soggetti e l'elaborazione dei biocampioni, e i numeri di sovvenzione della Chicago Coronavirus Assessment Network (Chicago CAN) Initiative della Walder Foundation SCI16 (J.R.S. e J.A.B.) e 21-00147 (J.R.S. e J.A.B.) e un premio della Swim Across America Foundation (J.A.B.).

Tutti i soggetti sono stati arruolati con consenso informato scritto con piena approvazione institutional review board (IRB) del Rush University Medical Center ai sensi del protocollo ORA 20101207 con tutte le linee guida istituzionali per la condotta di ricerca etica osservate. Il sangue è stato raccolto tramite flebotomia convenzionale in vacutainers di lavanda (K2EDTA) ed elaborato con i protocolli raccomandati. Il plasma risultante è stato archiviato a -80 °C fino a quando non sono state eseguite le valutazioni.
1. Preparazione di microsfere coniugate con antigene
<ol><li>Selezionare tre diverse fiale di microsfere magnetiche con regioni di perline univoche, registrando l'ID del tallone e le informazioni sul lotto per ogni fiala utilizzata. NOTA: i seguenti passaggi verranno seguiti per ogni regione di microsfera distinta. Le microsfere sono sensibili alla luce e devono essere protette dall'esposizione prolungata alla luce. Durante le fasi di lavaggio, fare attenzione a non disturbare le microsfere. Se disturbato, consentire una seconda separazione di 60 s.</li>
	<li>Vortice del materiale della microsfera per 60 s e sonicare per 5 minuti prima dell'uso per dissociare le perle aggregate.</li>
	<li>Trasferire 1,0 x 106 perline in un microcentrifugale a bassa legatura proteica da 1,5 mL.</li>
	<li>Inserire il tubo in un separatore magnetico e consentire la separazione per 60 s. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet di perline.</li>
	<li>Rimuovere il tubo dal separatore magnetico, risospesciare le perline con 100 μL di acqua di grado HPLC e vortice per 30 s. Riposizionare il tubo nel separatore magnetico per 60 s e successivamente rimuovere il surnatante. Ripetere questo protocollo di lavaggio due volte.</li>
	<li>Rimuovere il tubo dal separatore magnetico e risospesciare le microsfere lavate in 90 μL di fosfato di sodio monobasico da 100 mM, pH 6,2 (tampone di attivazione) tramite vortice per 30 s.</li>
	<li>Aggiungere 10 μL di 50 mg/mL Sulfo-NHS (diluito con Buffer di Attivazione) alle microsfere e vortice delicatamente per 10 s. Aggiungere 10 μL di soluzione EDC da 50 mg/mL (diluita con buffer di attivazione) e vortice delicatamente per 10 s. Incubare microsfere per 20 minuti a temperatura ambiente (RT) con un vortice delicato ogni 10 minuti.</li>
	<li>Ripetere i passaggi di lavaggio 1,4-1,5 con 50 mM MES, pH 5,0 (Coupling Buffer) al posto dell'acqua di grado LC/ MS per un totale di due lavaggi.</li>
	<li>Rimuovere il tubo dal separatore magnetico e risospesciare le perline con 100 μL di Coupling Buffer tramite vortice per 30 s seguito immediatamente dall'aggiunta della quantità desiderata di proteine.</li>
	<li>Portare il volume totale a 150 μL con Coupling Buffer. Reazione di accoppiamento della miscela per vortice per 30 s e incubazione per 2 ore mediante rotazione a RT. NOTA: Per i saggi qui definiti, le coniugazioni sono state eseguite con le seguenti concentrazioni proteiche: Spike S1: 5 μg; Nucleocapside: 5 μg; Membrana: 12,5 μg.</li>
	<li>Ripetere il lavaggio fase 1.4 con Fosfato Tamponato Salino (PBS)-1% Albumina Sierica di Capra, 0,01% Polisorbato-20 (Tampone di Quench) al posto dell'acqua di grado LC/MS per un totale di due lavaggi. Risospesso le microsfere lavate in 100 μL di Tampone di Tempra contenente lo 0,05% di azide di sodio mediante vortice per 30 s. NOTA: Lasciare che le perline si estendano completamente per almeno 6 ore prima di procedere a qualsiasi altra procedura.</li>
	<li>Contare il numero di microsfere recuperate utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro. Registrare la concentrazione di perline osservata.</li>
	<li>Refrigerare le microsfere accoppiate a 4 °C al buio.</li>
</ol>2. Procedure
<ol><li>Prestazioni del test (protocollo di base)<ol>
<li>Sospendere le microsfere accoppiate per vortice per 30 s e sonicare per ~60-90 s.</li>
		<li>Rimuovere la quantità richiesta di ciascun colloide dal rispettivo tubo e combinare i colloidi di perline in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml.</li>
		<li>Inserire il tubo in un separatore magnetico e consentire la separazione per 60 secondi. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet di perline.</li>
		<li>Rimuovere le perline dal separatore, risospesciare le perline con 100 μL di PBS-1% di albumina sierica bovina, 0,01% di polisorbato-20 (tampone di dosaggio) e vortice per 30 s. Posizionare il tubo in un separatore magnetico e consentire la separazione per 60 s. Ripetere questo protocollo di lavaggio (ad esempio, i passaggi 2.1.3-2.1.4) due volte</li>
		<li>Regolare la concentrazione della miscela di microsfere funzionanti a 3 plex aggiungendo un volume appropriato di tampone di saggio per generare una concentrazione finale di 100 microsfere per 1 μL per ciascun bersaglio.</li>
		<li>Aliquota 12,5 μL della miscela di microsfere preparata nella fase 2.1.5 in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti o 25 μL in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti.</li>
		<li>Diluire i campioni di plasma/siero 500 volte in Assay Buffer. Preparare campioni standard in base alla titolazione desiderata.</li>
		<li>Aggiungere 12,5 μL di Assay Buffer come campione bianco e aggiungere ciascuno dei campioni diluiti o standard in ciascun pozzetto designato di una piastra campione da 384 pozzetti o 25 μL del campione bianco diluito o standard in ciascun pozzetto di una piastra campione a 96 pozzetti.</li>
		<li>Coprire la piastra con un sigillo o un foglio di alluminio e incubare per 1 ora a RT su uno shaker a piastre impostato a 700 giri / min. NOTA: lo schema per le curve di diluizione è fornito nella Tabella 1.</li>
		<li>Preparare una soluzione di anticorpi anti-umani (soluzioni anticorpali secondarie) a 4 μg/mL con Assay Buffer come specificato al punto 2.1.11.</li>
		<li>Preparare IgM anti-uomo di capra, coniugato con super bright 436 (SB) / capra anti-umana IgA, ficoeritrina (PE) Coniugato anticorpi a 4 μg / mL; o Goat-anti-human IgM, SB Conjugate/Goat-anti-human IgG, PE Conjugate rileva anticorpi a 4 μg/mL. NOTA: per un formato di piastra a 384 pozzetti, sono necessari 12,5 μL/pozzetto della soluzione anticorpale secondaria preparata e per un formato di piastra a 96 pozzetti sono necessari 25 μL/pozzetto.</li>
		<li>Posizionare la piastra su un separatore magnetico, lavare rapidamente e invertire con forza un contenitore a rischio biologico per rimuovere il liquido dai pozzetti. Con la piastra ancora invertita, picchietta con forza la piastra contro una spessa mazzetta di carta.</li>
		<li>Lavare ogni pozzetto con 100 μL di Assay Buffer e rimuovere il liquido mediante inversione forzata su un contenitore a rischio biologico, come descritto in precedenza. Ripetere questi passaggi (2.1.12-2.1.13) per un totale di due lavaggi. Scartare tutti i batuffoli di carta usati in un contenitore a rischio biologico.</li>
		<li>Aggiungere 12,5 μL della soluzione di lavoro anticorpale secondaria a ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti o 25 μL a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio o un foglio e incubare per 30 minuti a RT su uno shaker a piastre impostato a 700 giri / min.</li>
		<li>Ripetere i passaggi di lavaggio 2.1.12-2.1.13</li>
		<li>Aggiungere 75 μL di Assay Buffer in ogni pozzetto di una piastra da 384 pozzetti o 100 μL in ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Coprire la piastra con un sigillo o un foglio di alluminio e incubare per 5 minuti a RT su uno shaker a piastre impostato a 700 giri / min.</li>
		<li>Analizzare 60 μL tramite l'analizzatore dello strumento in base al manuale del sistema.</li>
	</ol></li>
	<li>Ottimizzazione del tempo di incubazione della cattura dei campioni<ol>
<li>Eseguire i passaggi di cui alla sezione 2.1 utilizzando la durata dei tempi di incubazione di 30 min, 60 min e 120 min nel passaggio 2.1.9. NOTA: le incubazioni possono essere eseguite con piastre distinte o fermandosi al punto 2.1.6 fino al momento di procedere al passaggio 2.1.9. per raggiungere i tempi di incubazione desiderati.</li>
		<li>Procedere con la lettura delle piastre sull'analizzatore utilizzando 60 μL della miscela di analisi secondo le raccomandazioni del produttore.</li>
	</ol></li>
	<li>Ottimizzazione della concentrazione di anticorpi secondari<ol>
<li>Eseguire questa procedura come descritto al punto 2.1, ad eccezione delle concentrazioni finali di reagenti nella soluzione di lavoro anticorpale secondaria (preparata nella fase 2.1.10-2.1.11) modificata come segue: Anticorpi di rilevamento IgM, SB-coniugati anti-capra (o coniglio) a 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL. Anticorpi di rilevamento IgA, coniugati di PE-anti-uomo (o coniglio) a 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL. Anticorpi di rilevamento IgG, coniugati di IgG, CONIUGATI DI CAPRA-ANTI-uomo (o coniglio) a 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL. IgG anti-capra (o coniglio), PE-coniugato/Capra-anti-umano (o coniglio) IgM, SB-coniugato anticorpi a 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL. IgA anti-capra (o coniglio), PE-coniugato/Capra-anti-umano (o coniglio) IgM, SB-coniugato anticorpi a 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL.</li>
		<li>Procedere con la lettura delle piastre sull'analizzatore utilizzando 60 μL della miscela di analisi secondo le raccomandazioni del produttore.</li>
	</ol></li>
	<li>Ottimizzazione del tempo di incubazione degli anticorpi secondari<ol>
<li>Eseguire questa procedura come descritto nel paragrafo 2.1 con 15 min, 30 min, 60 min e 120 min di durata di incubazione definita nel passaggio 2.1.14.</li>
		<li>Procedere con la lettura delle piastre sull'analizzatore utilizzando 60 μL della miscela di analisi secondo le raccomandazioni del produttore.</li>
	</ol></li>
	<li>Valutazione di campioni soggetti con saggi a doppio canale ottimizzati<ol>
<li>Raccogliere campioni di plasma soggetto (n = 4) ai giorni -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 e +120 relativi al completamento della somministrazione del vaccino Covid-19 (cioè seconda dose). NOTA: il giorno 0 rappresenta il punto temporale in cui è stata completata la vaccinazione.</li>
		<li>Eseguire tutti i test utilizzando il protocollo di base (sezione 2.1.) come saggio a doppio canale IgG/IgM o IgA/IgM.</li>
		<li>Normalizzare i risultati al valore massimo osservato di intensità fluorescente mediana (MFI) per ogni immunoglobulina e test specifici.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Il Dr. Borgia è l'inventore del test sierologico utilizzato in questo manoscritto che è in attesa di brevetto. L'articolo è presentato solo in modo descrittivo senza analisi statistiche presentate per evitare potenziali pregiudizi introdotti dal conflitto dell'autore.

L'apprezzamento di una risposta immunitaria all'esposizione a SARS-CoV-2, in combinazione con la sorveglianza dello stato di infezione basata su RT-PCR, è stato ben descritto come una prescrizione per chiarire il corso di recupero da Covid-19, per servire come mezzo per identificare il plasma convalescente con potenziale valore terapeutico e per esaminare i tassi di infezione su scala di popolazione10,11. Diversi esempi di comprensione della sieroconversione in soggetti umani includono array di proteine (antigene)12, immunoblots13, costrutti immunocromatografici rapidi14 e saggi immunoassorbenti enzimatici (ELISA)15,16,17. Ognuna di queste tecniche di cui sopra può valutare più isotipi di immunoglobuline individualmente con piccole modifiche. Queste procedure, tuttavia, non sono in grado di essere praticamente riproposte per consentire l'analisi parallela di più isotipi, come presentato in questo manoscritto, rendendo i fattori di costo e throughput come limitazioni per la loro amministrazione su una strategia di test su scala basata sulla popolazione. Molte di queste applicazioni offrono anche l'opportunità di concatenare livelli di antigeni multipli in parallelo come presentato o in formati alterati, come un multiplex ELISA18,19. Infine, la piattaforma immunobead fornisce la possibilità di valutare i livelli di antigeni multipli in parallelo20,21, ma è stata limitata a un singolo epitopo (cioè isotipo di immunoglobuline) per test a meno che, tuttavia, non venga utilizzato il recente strumento con capacità di analisi "a doppio canale".
In questo rapporto, vengono enumerati protocolli che stabiliscono la misurazione affidabile di più epitopi in un test immunobead utilizzando lo strumento in modalità "dual-channel" in un caso di studio di sieroconversione di individui vaccinati covid-19. Il metodo ha dimostrato un'eccellente precisione (%valori CV in genere <20%) utilizzando progetti di test manuali che possono essere migliorati con l'integrazione di sistemi automatizzati di laboratorio. La sensibilità del saggio e la gamma dinamica per tutti gli analiti ed epitopi selezionati erano adatti per le valutazioni di routine. Sebbene la mancanza di immunoregenti antiantigeni IgA e IgM disponibili in commercio abbia limitato la quantificazione all'isotipo IgG, tale restrizione non preclude la capacità di offrire valutazioni o valutazioni semiquanti quantitative relative a un campione specifico come calibrante22,23.
Il test immunobead convalidato è stato assegnato per studiare la sieroconversione in una coorte di individui immunizzati con il vaccino Covid-19. A differenza di altre piattaforme simili, la famiglia di strumentazione consente la prospezione di sieroconversione in centinaia di individui al giorno in un flusso di lavoro manuale e migliaia al giorno in uno schema automatizzato. Nel complesso, questi risultati confermano che l'approccio "a doppio canale" ha una sensibilità appropriata per la descrizione di più epitopi in parallelo per il test identico ed è praticabile in un contesto multianalitico. Una differenza di sensibilità al canale 1 e al canale 2, come eseguita rispettivamente con fluorofori ficoeritrina e Super Bright 436, può giustificare la progettazione di un esperimento specifico per garantire che vengano acquisiti risultati analitici validi per un determinato esperimento. Cioè, la riserva del canale 1 per epitopi o analiti di una prevalenza inferiore può essere necessaria per mantenere un intervallo dinamico del test che includa i valori osservati di incognite. Al di là di questa considerazione, la progettazione del saggio era ovvia e dovrebbe essere facilmente accessibile ai laboratori con capacità analitiche limitate. Certamente, questa considerazione dovrebbe essere soppesata quando si considera l'interferenza da canale 1 a canale 2, come abbiamo notato per la Figura 5, per cui l'interferenza da isotipi di maggiore abbondanza può causare errori analitici fuorvianti per quelli in abbondanza molto inferiore se misurati in un formato a doppio canale. Questo potenziale di interferenza con situazioni con concentrazioni di analita molto diverse può rappresentare una limitazione significativa all'approccio se non gestito correttamente nella fase di progettazione del saggio.
In conclusione, è stato presentato un metodo per misurare rapidamente i titoli anticorpali dei principali isotipi di immunoglobuline associati a una risposta immunitaria all'infezione o alla vaccinazione da Covid-19. L'applicazione di questo approccio in modo longitudinale per valutare la sieroconversione può fornire approfondimenti che potrebbero essere meglio utilizzati per gestire e / o monitorare il decorso della malattia o, in alternativa, guidare i potenziali programmi di richiamo del vaccino Covid-19.

La misurazione simultanea di più biomarcatori correlati alla malattia in campioni biologici consente approfondimenti descrittivi e predittivi sui processi patologici. Mentre le procedure immunologiche convenzionali ad analita singolo, come i saggi immunoassorbenti enzimatici (ELISA), sono state la pietra angolare delle analisi quantitative sia in ambito clinico che di ricerca, queste tecniche possono avere limitazioni sostanziali per quanto riguarda la produttività, la quantità di campione richiesta per ogni misurazione e il rapporto costo-efficacia che limitano notevolmente lo studio di più elementi biologici che sono frequentemente intrecciati durante il decorso della malattia1 . La tecnologia multiplexing basata su microsfere è diventata una piattaforma indispensabile sia per le strutture diagnostiche che per quelle di ricerca per la sua capacità di combinare i saggi per migliorare la produttività del laboratorio, mitigare la scarsità di campioni e ridurre i test ripetitivi per massimizzare i risparmi sui costi 1,2,3,4. Recentemente, è stato introdotto un ulteriore aumento di questa potenza multiplexing con strumenti in possesso di capacità dual-reporter. La funzione dual-reporter implementa due canali fluorescenti per il rilevamento, fornendo un'altra dimensione di multiplexing, consentendo il rilevamento di più epitopi sullo stesso analita.
Sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è l'agente patogeno responsabile dell'attuale pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19)5. Mentre il test RT-PCR è cruciale per la conferma dell'infezione all'inizio del decorso della malattia, gli esami sierologici dei titoli anticorpali si sono dimostrati indispensabili per la critica accurata e completa degli individui in merito a una precedente esposizione o recupero; una risposta all'immunizzazione; e/o una valutazione dell'efficacia della vaccinazione Covid-19 6,7.
Questo rapporto delinea i metodi per misurare la sieroconversione per più antigeni virali SARS-CoV-2 che utilizzano un sistema di doppia segnalazione basato sul flusso e lettore multiplex. In particolare, viene descritta la rilevazione simultanea di due sottotipi di anticorpi (configurati come IgG/IgM o IgA/IgM) per un pannello di antigeni SARS-CoV-2 3-plex che include saggi per glicoproteine Spike S1, Nucleocapsid e Membrane (aka Matrix). Questo approccio fornisce un'impresa ideale per la cattura della sieroconversione longitudinale e contribuisce a uno strumento prezioso nell'arsenale contro la pandemia di Covid-19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well black side polystyrene microtiter plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-565-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, heat shock fraction</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A-7888-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS8574735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA35391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Albumin, Fraction V Powder</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2514-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB205009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB204009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB403009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB202009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62999842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Analyzer</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>INTELLIFLEX-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex-C Microspheres, Region XXX</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>MC10XXX-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate aluminum sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>07-200-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-751-7328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-V08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40591-V08H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40592-T62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-R0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb</td>
			<td>ProSci</td>
			<td>10-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>W-64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19

Le tecnologie multiplex per interrogare più biomarcatori in concerto esistono da diversi decenni; tuttavia, i metodi per valutare più epitopi sullo stesso analita rimangono limitati. Questo rapporto descrive lo sviluppo e l'ottimizzazione di un test di immunosfere multiplexed per i test sierologici di isotipi di immunoglobuline comuni (ad esempio, IgA, IgM e IgG) associati a una risposta immunitaria all'infezione o alla vaccinazione da SARS-CoV-2. I saggi sono stati eseguiti utilizzando un lettore fluorescente multiplex basato sul flusso con capacità a doppio canale. Le ottimizzazioni si sono concentrate sul tempo di cattura degli analiti, sulla concentrazione degli anticorpi di rilevamento e sul tempo di incubazione degli anticorpi di rilevamento. Le caratteristiche analitiche delle prestazioni del saggio (ad esempio, l'intervallo di analisi (compresi i limiti inferiori e superiori di quantificazione) e la precisione intra e inter-saggio) sono state stabilite per la combinazione di sierotipi IgG/IgM o IgA/IgM in tandem utilizzando la modalità "doppio canale". I tempi di acquisizione degli analiti di 30 minuti per IgG, 60 minuti per IgM e 120 minuti per IgA erano adatti per la maggior parte delle applicazioni, fornendo un equilibrio tra prestazioni del test e throughput. Sono state osservate incubazioni ottimali di anticorpi di rilevamento a 4 μg/mL per 30 minuti e sono raccomandate per applicazioni generali, data l'eccellente precisione complessiva (coefficiente percentuale di varianza (%CV) ≤ 20%) e i valori di sensibilità osservati. La gamma dinamica per l'isotipo IgG si estendeva su diversi ordini di grandezza per ciascun saggio (Spike S1, Nucleocapsid e glicoproteine di membrana), che supporta valutazioni robuste del titolo a un fattore di diluizione 1:500 per applicazioni cliniche. Infine, il protocollo ottimizzato è stato applicato al monitoraggio della sieroconversione Spike S1 per soggetti (n = 4) che hanno completato un regime vaccinale SARS-CoV-2. All'interno di questa coorte, i livelli di Spike S1 IgG sono stati osservati per raggiungere i titoli massimi a 14 giorni dopo la somministrazione della seconda dose, ad un'intensità del segnale molto più alta (~ 40 volte) rispetto agli isotipi IgM o IgA. È interessante notare che abbiamo osservato tassi di decadimento del titolo Spike S1 IgG altamente variabili che erano in gran parte dipendenti dal soggetto, che saranno l'argomento di studi futuri.

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Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

Questo articolo descrive un metodo conveniente per monitorare i cambiamenti dinamici nei titoli anticorpali per due isotipi di immunoglobuline contemporaneamente (IgA, IgM o IgG) derivanti da una risposta immunitaria all'infezione o alla vaccinazione da SARS-CoV-2. Questo "Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel" impiega tre test immunologici indiretti costruiti su microsfere codificate che vengono lette utilizzando un lettore multiplex basato sul flusso con funzionalità "dual-channel".

Monitoraggio dinamico della sieroconversione utilizzando un test multianalyte immunobead per Covid-19

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

Il metodo che dimostreremo oggi fornisce una soluzione ad alto rendimento per valutare la sieroconversione degli anticorpi associati alle infezioni da COVID-19 o alla vaccinazione per le analisi di routine. È interessante notare che questo approccio ci consente di valutare più epitopi sullo stesso analita. Questo ha numerose applicazioni nelle scienze biologiche, compresi gli studi di segnalazione cellulare e il monitoraggio delle risposte immunitarie.A dimostrare questa tecnica per voi oggi sarà il Dr.Imad Tarhoni, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio. Per iniziare, selezionare tre diverse fiale delle microsfere magnetiche con regioni di perline univoche e registrare l'ID del tallone e le informazioni sul lotto per ogni fiala utilizzata. Quindi, ruotare il calcio della microsfera selezionato per 60 secondi e sonicare per cinque minuti.Trasferire 1,0 volte 10 alle sei perline in un tubo microcentrifuga a bassa legante proteine da 1,5 millilitri e inserire il tubo in un separatore magnetico. per consentire la separazione per 60 secondi. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet di perline.Rimuovere il tubo dal separatore magnetico, quindi risospesciare le perline con 100 microlitri di acqua e vortice di grado HPLC per 30 secondi. Ancora una volta, riposizionare il tubo nel separatore magnetico per 60 secondi e successivamente rimuovere il surnatante. Ripetere il protocollo di lavaggio due volte.Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il tubo dal separatore magnetico e risospese le microsfere lavate in 90 microlitri di tampone di attivazione, pH 6,2, per vortice per 30 secondi. Successivamente, trattare sequenzialmente le microsfere con 10 microlitri da 50 milligrammi per millilitro di anidride-sulfosuccinamide e 10 microlitri da 50 milligrammi per millilitro di soluzione EDC per vortice per 10 secondi. Successivamente, incubare le microsfere per 20 minuti a temperatura ambiente con un vortice delicato ogni 10 minuti.Dopo l'incubazione, lavare le microsfere due volte con MES 50 millimolare o tampone di accoppiamento, pH 5,0, come descritto in precedenza. Ripetere il lavaggio due volte. Una volta fatto, rimuovere il tubo dal separatore magnetico e risospese le perline con 100 microlitri di buffer di accoppiamento tramite vortice per 30 secondi, seguito immediatamente aggiungendo la quantità desiderata di proteine al tubo.Portare il volume totale a 150 microlitri con buffer di accoppiamento e mescolare la reazione per vortice per 30 secondi. Quindi, incubare il tubo per due ore ruotando a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare le microsfere due volte con tampone di tempra PBS e risospescere le microsfere lavate in 100 microlitri di tampone di tempra contenente lo 0,05% di azide di sodio mediante vortice per 30 secondi.Contare il numero di microsfere recuperate utilizzando un contatore cellulare automatizzato e registrare la concentrazione di perline osservata. Per le prestazioni del test, risospesere le microsfere accoppiate tramite vortice per 30 secondi e sonicare per 60-90 secondi. Quindi, rimuovere la quantità richiesta di ciascun colloide di perline dal rispettivo tubo e combinare i colloidi di perline in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.Quindi, inserire il tubo in un separatore magnetico e consentire la separazione per 60 secondi. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet di perline. Dopo aver rimosso le perline dal separatore, risospese le perline in 100 microlitri di tampone di saggio.Vortice per 30 secondi prima di posizionare il tubo in un separatore magnetico per 60 secondi per separare le perline. Ripetere il lavaggio due volte. Quindi, regolare la concentrazione della miscela di microsfere funzionanti a tre plex aggiungendo un volume appropriato di tampone di saggio per generare una concentrazione finale di 100 microsfere per un microlitro per ciascun bersaglio.Aliquota 25 microlitri della miscela di microsfere in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Diluire i campioni di plasma o siero 500 volte nel tampone di analisi e preparare campioni standard in base alla titolazione desiderata. Aggiungere 25 microlitri di tampone di dosaggio come campione bianco e aggiungere ciascuno dei campioni diluiti o standard in ciascun pozzetto designato di una piastra campione a 96 pozzetti.Al termine, coprire la piastra con un sigillo di alluminio o un foglio per incubare per un'ora a temperatura ambiente su uno shaker a piastre impostato su 700 rotazioni al minuto. Preparare una soluzione di anticorpi anti-umani o soluzioni anticorpali secondarie a quattro microgrammi per microlitro con tampone di saggio come descritto nel manoscritto. Posizionare la piastra su un separatore magnetico per lavare rapidamente e quindi invertire con forza la piastra su un contenitore a rischio biologico per rimuovere il liquido dai pozzetti.Con la piastra ancora invertita, picchietta con forza la piastra contro una spessa mazzetta di carta. Quindi, lavare ogni pozzetto con 100 microlitri di tampone di saggio e rimuovere il liquido mediante inversione forzata su un contenitore a rischio biologico. Ripetere il lavaggio due volte.Dopo l'ultimo lavaggio, scartare tutti i batuffoli di carta usati in un contenitore a rischio biologico. Quindi, aggiungere 25 microlitri di soluzione di lavoro anticorpale secondaria a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e coprire la piastra con un foglio di alluminio per incubare su uno shaker a piastre a 700 rotazioni al minuto. Dopo 30 minuti di incubazione, lavare i pozzetti della piastra due volte con tampone di dosaggio come dimostrato in precedenza.Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone di saggio in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare per cinque minuti su uno shaker a piastre a temperatura ambiente. Analizzare un campione di 60 microlitri tramite l'analizzatore dello strumento in base al manuale del sistema.Per ottimizzare il tempo di incubazione della cattura del campione, incubare le piastre per una durata di 30, 60 e 120 minuti. Dopo l'incubazione, analizzare 60 microlitri della miscela di analisi sull'analizzatore. Una curva standard a sette punti basata su una serie di diluizioni seriali 1:5 è stata valutata per lo spike S1, gli anticorpi di membrana e il nucleocapside.Il test di precisione intra-test è stato eseguito sulla piastra per valutare la precisione del test calcolata come coefficiente percentuale di variazione, deviazione standard e media. Per la precisione tra i test, sono stati preparati tre lotti distinti dei set di perline per ciascun test. Sono state calcolate le variabili di precisione del test con i campioni di plasma standard e umani.I valori medi medi di intensità fluorescente mediana a 120 minuti dall'incubazione erano ottimali per i titoli IgG per lo spike S1, la membrana e gli anticorpi nucleocapsidi, indicando una rapida cinetica di legame anticorpale primario. Le ottimizzazioni della concentrazione di anticorpi secondari nelle prestazioni a doppio canale hanno dimostrato un'ampia gamma di segnali nella misurazione lineare per tutte le concentrazioni. I segnali osservati da diverse incubazioni temporali degli anticorpi secondari e i dettagli sui cambiamenti del segnale per tutti i tempi di incubazione sono mostrati qui.Nelle valutazioni di specificità per i saggi a doppio canale, è stata osservata una contaminazione trascurabile del segnale incrociato tra il canale vuoto e il singolo canale reporter. Nell'illustrazione degli eventi di sieroconversione a seguito della vaccinazione COVID 19, i valori di picco S1 IgA e IgM osservati erano circa 40 volte inferiori ai titoli di isotipo IgG. Questo metodo ha importanti implicazioni per il monitoraggio della risposta ai vaccini in individui immunocompromessi.Ci permetterà di determinare se questi pazienti sono veramente protetti da quelle vaccinazioni.

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