Name: dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

저자들은 시설 사용에 대한 Rush Biomarker Development Core, 피험자 등록 및 생물 표본 처리를위한 Rush Biorepository, Walder Foundation의 Chicago Coronavirus Assessment Network (Chicago CAN) 이니셔티브 보조금 번호 SCI16 (J.R.S. 및 J.A.B.) 및 21-00147 (J.R.S. 및 J.A.B.) 및 Swim Across America Foundation (J.A.B.)의 상에게 감사드립니다.

모든 피험자는 ORA 프로토콜 20101207에 따라 러쉬 대학 의료 센터의 IRB (Institutional Review Board) 승인과 함께 서면 정보에 입각 한 동의하에 등록되었으며 윤리적 연구 수행에 대한 모든 제도적 지침이 관찰되었습니다. 혈액은 통상적인 정맥절제술을 통해 라벤더 진공 청소기 (K2EDTA)로 수집되고 권장 프로토콜로 처리되었습니다. 생성된 혈장은 평가가 수행될 때까지 -80°C에서 보관되었다.
1. 항원 컨쥬게이션된 마이크로스피어의 제조
<ol><li>고유 한 비드 영역을 가진 자기 미소 구체의 세 가지 다른 바이알을 선택하여 사용 된 각 바이알에 대한 비드 ID 및 로트 정보를 기록하십시오. 참고: 각 별개의 마이크로스피어 영역에 대해 다음 단계를 따릅니다. 미소 구체는 빛에 민감하며 빛에 장기간 노출되지 않도록 보호해야합니다. 세척 단계 동안, 미소 구체들을 방해하지 않도록 주의하라. 방해를 받으면 두 번째 60 초 분리를 허용하십시오.</li>
	<li>마이크로스피어 스톡을 60초 동안 소용돌이치고, 응집된 비드를 해리시키기 위해 사용하기 전에 5분 동안 초음파 처리한다.</li>
	<li>1.0 x 106 비드를 1.5 mL 저단백질 결합 마이크로원심분리 튜브에 옮깁니다.</li>
	<li>튜브를 자기 분리기에 삽입하고 60 초 동안 분리가 이루어지도록하십시오. 튜브를 자기 분리기에 가만히 두고, 비드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>자기 분리기에서 튜브를 분리하고, 비드를 100μL의 HPLC 등급 물로 재현탁시키고, 30초 동안 와류시킨다. 튜브를 다시 자기 분리기에 60초 동안 넣고, 이어서 상청액을 제거한다. 이 세척 프로토콜을 두 번 반복하십시오.</li>
	<li>자기 분리기로부터 튜브를 제거하고, 세척된 미소 구체를 90 μL의 100 mM 일염기성 인산나트륨, pH 6.2 (활성화 완충액)에 30초 동안 와류시켜 재현탁시켰다.</li>
	<li>10 μL의 50 mg/mL Sulfo-NHS (활성화 완충액으로 희석)를 미소 구체에 첨가하고 10 초 동안 부드럽게 와동하십시오. 50mg/mL EDC 용액 10μL(활성화 버퍼로 희석)를 넣고 10초 동안 부드럽게 와류합니다. 실온에서 20분 동안 미소 구체들을 인큐베이션(RT)하고 매 10분마다 완만한 와류를 가한다.</li>
	<li>LC/MS 등급 물 대신 50 mM MES, pH 5.0 (커플링 버퍼)로 세척 단계 1.4-1.5를 반복하여 총 두 번의 세척을 실시하십시오.</li>
	<li>자기 분리기로부터 튜브를 제거하고 비드를 100 μL의 커플링 버퍼로 재현탁시키고 30 초 동안 와류시킨 다음 즉시 원하는 양의 단백질을 첨가한다.</li>
	<li>커플링 버퍼를 사용하여 총 부피를 150 μL로 가져옵니다. 혼합 커플링 반응을 30초 동안 와류에 의해 혼합하고, RT에서 회전에 의해 2시간 동안 인큐베이션한다. 참고: 본원에 정의된 검정을 위해, 컨쥬게이션은 다음의 단백질 농도로 수행되었다: 스파이크 S1: 5 μg; 뉴클레오캡시드: 5 μg; 멤브레인: 12.5 μg.</li>
	<li>LC/MS 등급 물 대신 인산완충식염수(PBS)-1% 염소혈청알부민, 0.01% 폴리소르베이트-20(담금질 완충액)으로 세척 단계 1.4를 반복하여 총 2회 세척한다. 세척된 미소 구체를 30초 동안 와류에 의해 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 100 μL의 퀀치 완충액에 재현탁시킨다. 참고: 다른 절차를 진행하기 전에 비드가 적어도 6시간 동안 완전히 담금질되도록 허용하십시오.</li>
	<li>자동화된 세포 계수기 또는 혈구측정기를 사용하여 회수된 미소 구체의 수를 계수하십시오. 관찰된 비드 농도를 기록한다.</li>
	<li>결합된 미소 구체들을 어둠 속에서 4°C에서 냉장 보관한다.</li>
</ol>2. 절차
<ol><li>분석 성능 (기본 프로토콜)<ol>
<li>결합 된 미소 구체를 30 초 동안 와류로 재현탁시키고 ~ 60-90 초 동안 초음파 처리하십시오.</li>
		<li>각 튜브로부터 각 비드 콜로이드의 필요한 양을 제거하고 비드 콜로이드를 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 결합시킨다.</li>
		<li>튜브를 자기 분리기에 넣고 60 초 동안 분리가 이루어지도록하십시오. 튜브를 자기 분리기에 가만히 두고, 비드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
		<li>세퍼레이터로부터 비드를 제거하고, 비드를 100 μL의 PBS-1% 소 혈청 알부민, 0.01% 폴리소르베이트-20 (어세이 버퍼) 및 30 초 동안 와류로 재현탁시켰다. 튜브를 자기 분리기에 넣고 60 초 동안 분리가 이루어지도록하십시오. 이 세척 프로토콜 (즉, 2.1.3-2.1.4 단계)을 두 번 반복하십시오.</li>
		<li>적절한 부피의 어세이 버퍼를 첨가하여 3-플렉스 작동 미소 구체 혼합물의 농도를 조정하여 각 표적에 대해 1 μL 당 100 미소 구체의 최종 농도를 생성한다.</li>
		<li>단계 2.1.5에서 제조된 미소 구체 혼합물 12.5 μL를 분취량하여 384-웰 플레이트의 각 웰 또는 25 μL의 각 웰에 넣고 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣는다.</li>
		<li>혈장/혈청 표본을 분석 버퍼에 500배 희석합니다. 원하는 적정에 따라 표준 표본을 준비하십시오.</li>
		<li>빈 샘플로서 12.5 μL의 Assay Buffer를 첨가하고, 희석된 시편 또는 표준물을 384-웰 시편 플레이트의 각 지정된 웰 또는 25 μL의 블랭크, 희석된 시편 또는 표준의 각 웰에 96-웰 시편 플레이트의 각 웰에 첨가한다.</li>
		<li>플레이트를 알루미늄 씰 또는 호일로 덮고 700rpm으로 설정된 플레이트 진탕기 상에서 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 참고: 희석 곡선에 대한 개략도는 표 1에 제공된다.</li>
		<li>단계 2.1.11에 명시된 대로 분석 버퍼를 사용하여 4 μg/mL의 항인간 검출 항체(이차 항체 용액) 용액을 준비합니다.</li>
		<li>슈퍼 브라이트 436 (SB) / 염소 - 항 인간 IgA, 피코 에리트린 (PE) 컨쥬게이트 검출 항체와 접합 된 염소 - 항 인간 IgM을 4 μg / mL에서 준비하십시오. 또는 염소-항-인간 IgM, SB 컨쥬게이트/염소-항-인간 IgG, PE 컨쥬게이트는 4 μg/mL에서 항체를 검출한다. 참고: 384-웰 플레이트 포맷의 경우, 준비된 이차 항체 용액의 12.5 μL/웰이 요구되며, 96-웰 플레이트 포맷의 경우, 25 μL/웰이 요구된다.</li>
		<li>플레이트를 자기 분리기에 놓고 빠르게 씻은 다음 생물 위험 용기 위로 강제로 뒤집어 웰에서 액체를 제거하십시오. 접시가 여전히 거꾸로 된 상태에서 두꺼운 종이 덩어리에 대해 접시를 강제로 누릅니다.</li>
		<li>각 웰을 100 μL의 어세이 버퍼로 세척하고, 앞서 기술한 바와 같이 생물학적 위험 용기 위에 강제 역전시켜 액체를 제거하였다. 이 단계(2.1.12-2.1.13)를 반복하여 총 두 번 세척합니다. 사용 된 모든 종이 덩어리를 생물 위험 용기에 버리십시오.</li>
		<li>12.5 μL의 이차 항체 작동 용액을 384-웰 플레이트의 각 웰 또는 25 μL의 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 알루미늄 씰 또는 호일로 덮고 700 rpm으로 설정된 플레이트 진탕기 상에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>세척 단계 2.1.12-2.1.13 반복</li>
		<li>75μL의 어세이 버퍼를 384-웰 플레이트의 각 웰에 넣거나 100 μL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 알루미늄 씰 또는 호일로 덮고 700 rpm으로 설정된 플레이트 진탕기 상에서 RT에서 5분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>시스템 설명서에 따라 계측기 분석기를 통해 60μL를 분석합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시편 포획 배양 시간 최적화<ol>
<li>단계 2.1.9에서 30분, 60분, 및 120분의 인큐베이션 시간의 지속기간을 사용하여 섹션 2.1의 단계를 수행한다. 참고: 인큐베이션은 별개의 플레이트를 사용하거나 단계 2.1.9로 진행될 때까지 단계 2.1.6에서 일시 중지하여 수행될 수 있습니다. 원하는 배양 시간을 달성한다.</li>
		<li>제조자의 권고에 따라 60 μL의 분석 혼합물을 사용하여 분석기 상에서 플레이트 판독을 진행한다.</li>
	</ol></li>
	<li>이차 항체 농도의 최적화<ol>
<li>섹션 2.1에 상술된 바와 같이, 다음과 같이 변형된 2차 항체 작동액 (단계 2.1.10-2.1.11에서 제조됨) 중의 시약의 최종 농도를 제외하고, 이 절차를 수행한다: 염소-항-인간 (또는 토끼) IgM, SB-접합체 검출 항체를 8, 4, 2, 1 및 0.5 μg/mL에서 수득하였다. 염소-항-인간 (또는 토끼) IgA, 8, 4, 2, 1 및 0.5 μg/mL에서 PE-접합체 검출 항체. 염소-항-인간 (또는 토끼) IgG, 8, 4, 2, 1 및 0.5 μg/mL에서 PE-접합체 검출 항체. 염소-항-인간 (또는 토끼) IgG, PE-접합체/염소-항-인간 (또는 토끼) IgM, 8, 4, 2, 1 및 0.5 μg/mL의 SB-접합체 검출 항체. 염소-항-인간 (또는 토끼) IgA, PE-접합체/염소-항-인간 (또는 토끼) IgM, 8, 4, 2, 1 및 0.5 μg/mL의 SB-접합체 검출 항체.</li>
		<li>제조자의 권고에 따라 60 μL의 분석 혼합물을 사용하여 분석기 상에서 플레이트 판독을 진행한다.</li>
	</ol></li>
	<li>이차 항체 배양 시간의 최적화<ol>
<li>단계 2.1.14에서 정의된 인큐베이션 지속 시간의 15분, 30분, 60분 및 120분으로 섹션 2.1에 설명된 대로 이 절차를 수행하십시오.</li>
		<li>제조자의 권고에 따라 60 μL의 분석 혼합물을 사용하여 분석기 상에서 플레이트 판독을 진행한다.</li>
	</ol></li>
	<li>최적화된 이중 채널 분석을 통한 피험체 표본 평가<ol>
<li>Covid-19 백신의 완료일에 대하여 대상체 혈장 샘플 (n=4)을 수집한다 -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90, 및 +120 (즉, 2차 용량) 투여. 참고: 0일차는 백신 접종이 완료된 시점을 나타냅니다.</li>
		<li>기본 프로토콜(섹션 2.1)을 사용하여 IgG/IgM 또는 IgA/IgM 이중 채널 분석으로 모든 분석을 수행합니다.</li>
		<li>각각의 특이적 면역글로불린 및 검정에 대해 관찰된 최대 중간 형광 강도(MFI) 값으로 결과를 정규화한다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+EUROIMMUN+anti-SARS-CoV-2+ELISA+assay+for+detection+of+IgA+and+IgG+antibodies.">Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468 (2020).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+performance+of+a+semi-quantitative+assay+for+SARS-CoV2+IgG+and+SARS-CoV2+IgM+antibodies.">Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).</li></ol>

Borgia 박사는 특허 출원 중인이 원고에 사용 된 혈청 학적 테스트의 발명가입니다. 이 기사는 저자 갈등에 의해 도입 된 잠재적 인 편향을 피하기 위해 통계 분석이 제시되지 않은 경우에만 설명 적 방식으로 제시됩니다.

감염 상태에 대한 RT-PCR 기반 감시와 함께 SARS-CoV-2 노출에 대한 면역 반응의 인식은 Covid-19로부터의 회복 과정을 명확히하고, 잠재적 인 치료 가치를 지닌 회복기 혈장을 확인하고, 인구 규모 기준으로 감염률을 조사하는 수단으로 작용하기위한 처방으로 잘 설명되었습니다10,11. 인간 피험자에서 혈청 전환을 이해하기 위한 상이한 예는 단백질(항원) 어레이 12, 면역블롯13, 신속한 면역크로마토그래피 구축물 14, 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISAs)15,16,17을 포함한다. 이들 전술한 기술들 각각은 사소한 변형으로 개별적으로 다수의 면역글로불린 이소형을 평가할 수 있다. 그러나 이러한 절차는이 원고에 제시된 바와 같이 여러 이소 타입의 병렬 분석을 허용하도록 실질적으로 용도를 변경할 수 없으므로 비용 및 처리량 요인을 인구 기반 규모 테스트 전략에 대한 관리의 한계로 간주합니다. 이러한 응용 프로그램 중 일부는 또한 멀티플렉스 ELISA18,19와 같이 제시되거나 변경된 형식으로 여러 항원의 수준을 병렬로 연결할 수 있는 기회를 제공합니다. 마지막으로, 면역비드 플랫폼은 병렬로20,21개의 다중 항원의 수준을 평가할 수 있는 가능성을 제공하지만, 분석당 단일 에피토프(즉, 면역글로불린 이소형)로 제한되어 왔지만, '이중 채널' 분석 능력을 갖는 최근의 계기가 채용되고 있다.
이 보고서에서는 Covid-19 예방 접종을받은 개인의 혈청 전환에 대한 사례 연구에서 '이중 채널'모드의 도구를 사용하여 면역 비드 분석에서 다중 에피토프의 신뢰할 수있는 측정을 확립하는 프로토콜이 열거되어 있습니다. 이 방법은 실험실 자동화 시스템의 통합으로 개선 될 수있는 수동 분석 설계를 사용하여 우수한 정밀도 (일반적으로 <20 %)를 입증했습니다. 선택된 모든 분석물 및 에피토프에 대한 분석 감도 및 동적 범위는 일상적인 평가에 적합하였다. 상업적으로 이용가능한 항항원 IgA 및 IgM 면역시약의 결여가 IgG 이소형에 대한 제한된 정량화이지만, 이러한 제한은 교정제22,23으로서 특정 표본에 대하여 반정량적 평가 또는 평가를 제공하는 능력을 배제하지 않는다.
검증된 면역비드 분석은 Covid-19 백신으로 면역화된 개인의 코호트에서 혈청 전환을 조사하기 위해 할당되었다. 다른 유사한 플랫폼과 대조적으로, 계측 제품군은 수동 워크 플로에서 하루에 수백 명의 개인과 자동화 된 체계로 하루에 수천 명의 개인에서 혈청 변환의 전망을 가능하게합니다. 전반적으로, 이러한 발견은 '이중 채널'접근법이 동일한 검정에 대해 병렬로 다중 에피토프의 설명에 대한 적절한 민감성을 가지며 다중 분석물 맥락에서 실행 가능하다는 것을 확인시켜준다. 피코에리트린과 슈퍼 브라이트 436 형광단으로 각각 수행된 채널 1 및 채널 2에 대한 민감도의 차이는 주어진 실험에 대해 실행 가능한 분석 결과를 얻기 위해 특정 실험의 설계를 보증할 수 있습니다. 즉, 더 낮은 유병률의 에피토프 또는 분석물에 대한 채널 1의 예약은 미지의 관찰된 값을 포함하는 분석의 동적 범위를 유지하기 위해 필요할 수 있다. 이러한 고려 사항 외에도 분석 설계는 분명했으며 제한된 분석 기능을 가진 실험실에서 쉽게 접근 할 수 있어야합니다. 물론, 그림 5에서 언급했듯이 채널 1에서 채널 2까지의 간섭을 고려할 때 이러한 고려 사항을 고려해야 하며, 이에 따라 더 높은 풍부도 이소형으로부터의 간섭은 이중 채널 형식으로 측정될 때 훨씬 낮은 풍부도에 있는 사람들에게 오해의 소지가 있는 분석 오류를 야기할 수 있습니다. 매우 상이한 분석물 농도를 갖는 상황과의 간섭에 대한 이러한 잠재성은 분석 설계 단계에서 적절하게 처리되지 않을 경우 접근법에 상당한 제한을 나타낼 수 있다.
결론적으로, Covid-19 감염 또는 백신접종에 대한 면역 반응과 관련된 주요 면역글로불린 이소형으로부터의 항체 역가를 신속하게 측정하는 방법이 제시되었다. 혈청 전환을 평가하기 위해 종적 방식으로이 접근법을 적용하면 질병의 경과를 관리 및 / 또는 모니터링하거나 장래의 Covid-19 부스터 백신 프로그램을 안내하는 데 더 잘 사용될 수있는 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

생물학적 샘플에서 여러 질병 관련 바이오마커를 동시에 측정하면 병리학 적 과정에 대한 설명 및 예측 통찰력을 얻을 수 있습니다. 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISAs)과 같은 기존의 단일 분석 물질 면역 학적 절차는 임상 및 연구 설정 모두에서 정량 분석의 초석이 되었지만, 이러한 기술은 처리량, 각 측정에 필요한 표본의 양 및 질병 과정1 전반에 걸쳐 자주 얽혀있는 여러 생물학적 요소에 대한 연구를 크게 제한하는 비용 효율성과 관련하여 상당한 한계를 가질 수 있습니다. . 마이크로스피어 기반 멀티플렉싱 기술은 실험실 처리량을 향상시키고, 샘플 부족을 완화하고, 반복적 인 테스트를 줄여 비용 절감을 극대화하기 위해 분석을 결합 할 수있는 능력을 갖춘 진단 및 연구 시설 모두에 없어서는 안될 플랫폼이되었습니다 1,2,3,4. 최근에는 이중 리포터 기능을 갖춘 장비로 이러한 멀티플렉싱 파워의 추가 증강이 도입되었습니다. 이중 리포터 기능은 검출을 위해 두 개의 형광 채널을 구현하여 멀티플렉싱의 또 다른 차원을 제공하여 동일한 분석물에서 여러 에피토프를 검출할 수 있도록 합니다.
중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)는 현재 코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19) 전염병5를 담당하는 병원체입니다. RT-PCR 검사는 질병 과정의 시작에서 감염 확인에 중요하지만, 항체 역가에 대한 혈청 학적 검사는 이전의 노출 또는 회복에 관한 개인의 정확하고 완전한 비판에 필수적임이 입증되었습니다. 예방 접종에 대한 반응; 및/또는 Covid-19 백신 접종 효능 평가 6,7.
이 보고서는 흐름 기반의 멀티플렉스 리더 이중 보고 시스템을 활용하는 여러 SARS-CoV-2 바이러스 항원에 대한 혈청 전환을 측정하는 방법을 설명합니다. 구체적으로, 스파이크 S1, 뉴클레오캡시드 및 멤브레인 (일명 매트릭스) 당단백질에 대한 분석을 포함하는 3-플렉스 SARS-CoV-2 항원 패널에 대한 2개의 항체 서브타입 (IgG/IgM 또는 IgA/IgM으로 구성됨)의 동시 검출이 기술된다. 이 접근법은 종단 혈청 전환의 포착을위한 이상적인 기업을 제공하고 Covid-19 전염병에 대한 무기고에 귀중한 도구를 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well black side polystyrene microtiter plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-565-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, heat shock fraction</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A-7888-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS8574735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA35391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Albumin, Fraction V Powder</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2514-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB205009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB204009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB403009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB202009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62999842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Analyzer</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>INTELLIFLEX-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex-C Microspheres, Region XXX</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>MC10XXX-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate aluminum sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>07-200-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-751-7328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-V08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40591-V08H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40592-T62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-R0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb</td>
			<td>ProSci</td>
			<td>10-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>W-64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19

여러 바이오마커를 공동으로 조사하기위한 멀티플렉스 기술은 수십 년 동안 존재 해 왔습니다. 그러나, 동일한 분석물 상의 다중 에피토프를 평가하는 방법은 제한적이다. 이 보고서는 SARS-CoV-2 감염 또는 백신접종에 대한 면역 반응과 관련된 일반적인 면역글로불린 이소형(예를 들어, IgA, IgM 및 IgG)의 혈청학적 시험을 위한 다중화 면역비드 분석의 개발 및 최적화를 기술한다. 분석은 이중 채널 기능을 갖춘 흐름 기반의 멀티플렉스 형광 판독기를 사용하여 수행되었습니다. 최적화는 분석물 포획 시간, 검출 항체 농도 및 검출 항체 배양 시간에 중점을 두었습니다. 분석 분석 성능 특성(예를 들어, 분석 범위(정량의 하한 및 상한 포함) 및 인트라 및 인터 어세이 정밀도)이 '이중 채널' 모드를 사용하여 IgG/IgM 또는 IgA/IgM 혈청형 조합에 대해 동시에 확립되었다. IgG의 경우 30분, IgM의 경우 60분, IgA의 경우 120분의 분석물 포획 시간이 대부분의 응용 분야에 적합하여 분석 성능과 처리량의 균형을 제공했습니다. 30분 동안 4 μg/mL에서 최적의 검출 항체 인큐베이션이 관찰되었으며, 관찰된 민감도 값을 고려할 때 전반적으로 우수한 정밀도(분산계수(%CV) ≤ 20%)를 고려하여 일반적인 용도에 권장됩니다. IgG 이소형에 대한 동적 범위는 각 검정 (스파이크 S1, 뉴클레오캡시드 및 막 당단백질)에 대해 수 배의 크기에 걸쳐 있었으며, 이는 임상 적용을 위한 1:500 희석 인자에서 강력한 역가 평가를 지원한다. 마지막으로, 최적화된 프로토콜은 SARS-CoV-2 백신 요법을 완료한 피험자(n=4)에 대한 스파이크 S1 혈청 전환을 모니터링하는데 적용되었다. 이 코호트 내에서, 스파이크 S1 IgG 수준은 IgM 또는 IgA 이소형보다 훨씬 더 높은 (~40배) 신호 강도에서 두 번째 투여 후 14일에 최대 역가에 도달하는 것으로 관찰되었다. 흥미롭게도, 우리는 매우 가변적인 스파이크 S1 IgG 역가 붕괴 속도를 관찰하였고 이는 주로 피험자-의존적이었으며 이는 향후 연구의 주제가 될 것이다.

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Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

이 기사에서는 SARS-CoV-2 감염 또는 백신 접종에 대한 면역 반응으로 인해 발생하는 두 개의 면역글로불린 이소형(IgA, IgM 또는 IgG)에 대한 항체 역가의 동적 변화를 동시에 모니터링하는 편리한 방법을 설명합니다. 이 '다중 분석 물질 Covid-19 면역 반응 패널'은 '이중 채널'기능을 갖춘 흐름 기반 멀티플렉스 리더를 사용하여 판독되는 코딩된 미소 구체를 기반으로 구축된 세 가지 간접 면역 분석법을 사용합니다.

Covid-19에 대한 다중 분석 물질 면역 비드 분석을 사용한 혈청 전환의 동적 모니터링

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

오늘 우리가 시연 할 방법은 COVID-19 감염과 관련된 항체의 혈청 전환을 평가하거나 일상적인 분석을위한 예방 접종을위한 높은 처리량 솔루션을 제공합니다. 흥미롭게도,이 접근법은 우리가 동일한 분석물 상의 다중 에피토프를 평가할 수있게합니다. 이것은 세포 신호 연구 및 면역 반응 모니터링을 포함하여 생물 과학에서 수많은 응용 프로그램을 가지고 있습니다.오늘 당신을 위해이 기술을 시연하는 것은 내 실험실의 박사 후 연구원 인 Imad Tarhoni 박사가 될 것입니다. 시작하려면 고유 한 비드 영역을 가진 자기 미소 구체의 세 가지 다른 바이알을 선택하고 사용 된 각 바이알에 대한 비드 ID 및 로트 정보를 기록하십시오. 이어서, 선택된 미소 구체 스톡을 60초 동안 와류시키고, 5분 동안 초음파 처리한다.여섯 개의 비드를 1.5 밀리리터 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브에 1.0 배 10 번 옮기고 튜브를 자기 분리기에 삽입하십시오. 60 초 동안 분리를 허용한다. 튜브를 자기 분리기에 가만히 두고, 비드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.자기 분리기에서 튜브를 제거한 다음 100 마이크로리터의 HPLC 등급 물과 와류로 비드를 30초 동안 재현탁시켰다. 다시 튜브를 60초 동안 자기 분리기에 다시 넣고 상층액을 제거합니다. 세척 프로토콜을 두 번 반복하십시오.마지막 세척 후, 자석 분리기로부터 튜브를 제거하고, 세척된 미소 구체들을 90 마이크로리터의 활성화 완충액, pH 6.2에 재현탁시키고, 30초 동안 와류시켰다. 다음으로, 미소 구체를 10초 동안 와류하여 밀리리터 당 50밀리그램의 10 마이크로리터의 anhydroxy-sulfosuccinamide 및 밀리리터 당 50 밀리그램의 EDC 용액 10 마이크로리터로 순차적으로 처리한다. 나중에, 미소 구체들을 실온에서 20분 동안 10분마다 온화한 와류로 인큐베이션한다.인큐베이션 후, 앞서 기술한 바와 같이, 미소 구체를 50-밀리몰 MES 또는 커플링 완충액, pH 5.0으로 두 번 세척한다. 세탁을 두 번 반복하십시오. 완료되면 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 비드를 100 마이크로 리터의 커플링 버퍼로 30 초 동안 와류하여 재현탁시킨 다음 즉시 원하는 양의 단백질을 튜브에 첨가합니다.커플링 버퍼를 사용하여 총 부피를 150 마이크로리터로 가져오고 30초 동안 와류에 의해 반응물을 혼합한다. 이어서, 튜브를 실온에서 회전시켜 두 시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 미소 구체를 PBS 켄치 완충액으로 두 번 세척하고, 세척된 미소 구체를 30초 동안 와류에 의해 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 담금질 완충액 100 마이크로리터에 재현탁시켰다.자동화된 세포 계수기를 사용하여 회수된 미소 구체의 수를 계수하고 관찰된 비드 농도를 기록한다. 분석 성능을 위해, 결합된 미소 구체들을 30초 동안 와류에 의해 재현탁시키고, 60 내지 90초 동안 초음파 처리한다. 이어서, 각각의 튜브로부터 각각의 비드 콜로이드의 필요한 양을 제거하고, 비드 콜로이드를 새로운 1.5-밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 결합시킨다.다음으로, 튜브를 자기 분리기에 넣고 60 초 동안 분리하십시오. 튜브를 자기 분리기에 여전히 넣고 비드 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하십시오. 세퍼레이터로부터 비드를 제거한 후, 비드를 100 마이크로리터의 분석 완충액에 재현탁시킨다.튜브를 60초 동안 자기 분리기에 넣기 전에 30초 동안 소용돌이 치며 비드를 분리하였다. 세탁을 두 번 반복하십시오. 다음으로, 적절한 부피의 분석 완충액을 첨가하여 삼중계 작동 마이크로스피어 혼합물의 농도를 조정하여 각 표적에 대해 하나의 마이크로리터당 100마이크로스피어의 최종 농도를 생성한다.25 마이크로리터의 마이크로스피어 혼합물을 96-웰 플레이트의 각 웰에 분취한다. 혈장 또는 혈청 표본을 분석 완충액에 500배 희석하고 원하는 적정에 따라 표준 표본을 준비합니다. 25 마이크로리터의 분석 완충액을 빈 샘플로 첨가하고, 희석된 각각의 시편 또는 표준을 96-웰 시편 플레이트의 각각의 지정된 웰에 첨가한다.완료되면 플레이트를 알루미늄 씰 또는 호일로 덮고 분당 700회 회전으로 설정된 플레이트 진탕기 상에서 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션한다. 원고에 기재된 바와 같이 분석 완충액으로 마이크로리터당 네 마이크로그램의 항인간 검출 항체 또는 이차 항체 용액의 용액을 준비한다. 플레이트를 자기 분리기 위에 올려 놓고 빠르게 씻은 다음 플레이트를 생체 위험 용기 위로 강제로 뒤집어 웰에서 액체를 제거하십시오.접시가 여전히 거꾸로 된 상태에서 두꺼운 종이 덩어리에 대해 접시를 강제로 누릅니다. 그런 다음, 각 웰을 100 마이크로리터의 분석 완충액으로 세척하고, 생물학적 위험 용기 위에 강제 역전시켜 액체를 제거한다. 세척을 두 번 반복하십시오.마지막 세척 후, 사용 된 모든 종이 덩어리를 생물 위험 용기에 버리십시오. 다음으로, 25 마이크로리터의 이차 항체 작동 용액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 분당 700회 회전으로 플레이트 진탕기 상에서 인큐베이션한다. 30분의 인큐베이션 후에, 플레이트의 웰을 앞서 입증된 바와 같이 분석 완충액으로 두 번 세척한다.이어서, 100 마이크로리터의 분석 완충액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 플레이트 진탕기 상에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다. 시스템 설명서에 따라 계측기 분석기를 통해 60마이크로리터 샘플을 분석합니다.시편 포획 인큐베이션 시간의 최적화를 위해, 플레이트를 30분, 60분 및 120분의 지속 시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 분석기 상에서 60 마이크로리터의 분석 혼합물을 분석한다. 1:5 연속 희석 시리즈에 기초한 7-포인트 표준 곡선을 스파이크 S1, 막 항체, 및 뉴클레오캡시드에 대해 평가하였다.플레이트 상에서 인트라-어세이 정밀 검정을 수행하여 변동 퍼센트 계수, 표준 편차 및 평균으로서 계산된 분석 정밀도를 평가하였다. 인터-어세이 정밀도를 위해, 비드 세트의 세 개의 별개의 배치가 각각의 검정에 대해 준비되었다. 표준 및 인간 혈장 샘플을 사용한 검정의 정밀 변수를 계산하였다.인큐베이션의 120분에서의 평균 중간 형광 강도 값은 스파이크 S1, 막, 및 뉴클레오캡시드 항체에 대한 IgG 역가에 대해 최적이었으며, 이는 빠른 1차 항체 결합 동역학을 나타낸다. 이중 채널 성능의 이차 항체 농도 최적화는 모든 농도에 대한 선형 측정에서 광범위한 신호를 입증했습니다. 이차 항체의 상이한 시간 인큐베이션으로부터의 관찰된 신호 및 모든 인큐베이션 시간에 대한 신호 변화에 대한 세부사항이 여기에 도시되어 있다.이중 채널 분석에 대한 특이성 평가에서, 블랭크와 단일 리포터 채널 사이에서 무시할 수 있는 교차 신호 오염이 관찰되었다. COVID 19 백신 접종 후의 혈청 전환 사건의 그림에서, 관찰된 스파이크 S1 IgA 및 IgM 값은 IgG 이소형의 역가보다 약 40배 낮았다. 이 방법은 면역 저하 된 개인의 백신에 대한 반응을 모니터링하는 데 중요한 영향을 미칩니다.이 환자들이 진정으로 예방 접종에 의해 보호되고 있는지 여부를 결정할 수있게 해줄 것입니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

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연구

의학

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In modern implantology, the application of surgical navigation systems is becoming increasingly important. In addition to static surgical navigation ...

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티베트 Minipigs에서 박출률이 보존된 심부전의 수술 모델

More than half of heart failure (HF) cases are classified as heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) worldwide. Large animal models are ...

Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

근관 치료의 동적 내비게이션: 소형화된 내비게이션 시스템을 통한 접근 캐비티 준비 안내

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...