Name: dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19 at JoVE.com

Os autores desejam agradecer ao Rush Biomarker Development Core pelo uso de suas instalações, o Rush Biorepository para inscrição de sujeitos e processamento de bioespecimen, e a Iniciativa de Avaliação de Coronavírus de Chicago (Chicago CAN) da Walder Foundation (Chicago CAN) concedem números SCI16 (J.R.S. e J.A.B.) e 21-00147 (J.R.S. e J.A.B.) e um prêmio da Swim Across America Foundation (J.A.B.).

Todos os sujeitos foram inscritos com consentimento por escrito informado com a aprovação completa do Centro Médico institucional (IRB) do Rush University Medical Center sob protocolo ORA 20101207 com todas as diretrizes institucionais para a conduta de pesquisa ética observadas. O sangue foi coletado via flebotomia convencional em vacutainers de lavanda (K2EDTA) e processado com protocolos recomendados. O plasma resultante foi arquivado a -80 °C até que as avaliações fossem realizadas.
1. Preparação de microesferas conjugadas por antígeno
<ol><li>Selecione três frascos diferentes de microesferas magnéticas com regiões de contas únicas, registrando iD de contas e informações de lotes para cada frasco usado. NOTA: As seguintes etapas serão seguidas para cada região de microesfera distinta. As microesferas são sensíveis à luz e devem ser protegidas da exposição prolongada à luz. Durante as etapas de lavagem, tenha cuidado para não perturbar as microesferas. Se perturbado, permita uma segunda separação de 60 anos.</li>
	<li>Vórtice o estoque de microesfera para 60 s e sonicate por 5 minutos antes de usar para dissociar contas agregadas.</li>
	<li>Transfira 1,0 x 106 contas para tubos de microcentrifuge de baixa proteína de 1,5 mL.</li>
	<li>Insira o tubo em um separador magnético e permita que a separação ocorra por 60 s. Com o tubo ainda no separador magnético, remova cuidadosamente o sobrenatante sem perturbar a pelota de contas.</li>
	<li>Remova o tubo do separador magnético, resuspenda as contas com 100 μL de água de grau HPLC e vórtice para 30 s. Coloque o tubo de volta no separador magnético por 60 s e, posteriormente, remova o sobrenante. Repita este protocolo de lavagem duas vezes.</li>
	<li>Remova o tubo do separador magnético e resuspenja as microesferas lavadas em 90 μL de fosfato de sódio monobásico de 100 mM, pH 6.2 (Buffer de Ativação) por vórtice para 30 s.</li>
	<li>Adicione 10 μL de 50 mg/mL Sulfo-NHS (diluído com Buffer de Ativação) às microesferas e vórtice suavemente por 10 s. Adicione 10 μL de solução EDC de 50 mg/mL (diluída com buffer de ativação) e vórtice suavemente para 10 s. Incubar microesferas por 20 minutos à temperatura ambiente (RT) com um vórtice suave a cada 10 minutos.</li>
	<li>Repetir as etapas de lavagem 1.4-1.5 com 50 mM MES, pH 5.0 (Tampão de Acoplamento) em vez de água de grau LC/MS para um total de duas lavagens.</li>
	<li>Remova o tubo do separador magnético e ressuspenda as contas com 100 μL de Tampão de Acoplamento por vórtice por vórtice para 30 s seguido imediatamente pela adição da quantidade desejada de proteína.</li>
	<li>Leve o volume total para 150 μL com buffer de acoplamento. Misture a reação de acoplamento por vórtice para 30 s e incubar por 2h por rotação na RT. NOTA: Para ensaios aqui definidos, foram realizadas conjugações com as seguintes concentrações proteicas: Spike S1: 5 μg; Nucleocapsid: 5 μg; Membrana: 12,5 μg.</li>
	<li>Repito passo de lavagem 1.4 com Salina Tampão Tampão fosfato (PBS)-1% Goat Serum Albumin, 0,01% Polysorbate-20 (Tampão de Súfato) em vez de água de grau LC/MS para um total de duas lavagens. Resuspenha as microesferas lavadas em 100 μL de Tampão de Súmia contendo 0,05% de azida de sódio por vórtice para 30 s. NOTA: Permita que as contas se saciam totalmente por pelo menos 6h antes de prosseguir para qualquer outro procedimento.</li>
	<li>Conte o número de microesferas recuperadas usando um contador celular automatizado ou um hemócito. Regisso da concentração observada de contas.</li>
	<li>Leve à geladeira as microesferas acopladas a 4 °C no escuro.</li>
</ol>2. Procedimentos
<ol><li>Desempenho do ensaio (protocolo base)<ol>
<li>Resuspend as microesferas acopladas por vórtice para 30 s e sonicate para ~60-90 s.</li>
		<li>Remova a quantidade necessária de cada coloide de contas do respectivo tubo e combine os coloides de contas em um novo tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.</li>
		<li>Insira o tubo em um separador magnético e permita que a separação ocorra por 60 segundos. Com o tubo ainda no separador magnético, remova cuidadosamente o sobrenatante sem perturbar a pelota de contas.</li>
		<li>Remova as contas do separador, resuspenque as contas com 100 μL de pbs-1% de albumina de soro bovino, 0,01% Polisorbate-20 (Assay Buffer) e vórtice para 30 s. Coloque o tubo em um separador magnético e permita que a separação ocorra por 60 s. Repita este protocolo de lavagem (ou seja, passos 2.1.3-2.1.4) duas vezes</li>
		<li>Ajuste a concentração da mistura de microesfera de trabalho de 3 plex adicionando um volume apropriado de Tampão de Ensaio para gerar uma concentração final de 100 microesferas por 1 μL para cada alvo.</li>
		<li>Alíquota de 12,5 μL da mistura de microesfera preparada na etapa 2.1.5 em cada poço de uma placa de 384-well ou 25 μL em cada poço de uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Diluir as amostras de plasma/soro 500 vezes em Assay Buffer. Prepare os espécimes padrão de acordo com a titulação desejada.</li>
		<li>Adicione 12,5 μL de Tampão de Ensaio como amostra em branco e adicione cada um do espécime diluído ou padrão em cada poço designado de uma placa de espécime de 384 poços ou 25 μL do espécime em branco, diluído ou padrão em cada poço de uma placa de espécime de 96 poços.</li>
		<li>Cubra a placa com uma vedação de alumínio ou folha e incubar por 1h no RT em um agitador de pratos definido a 700 rpm. NOTA: O esquema para as curvas de diluição está fornecido na Tabela 1.</li>
		<li>Prepare uma solução de anticorpos de detecção anti-humana (soluções secundárias de anticorpos) a 4 μg/mL com Tampão de Ensaio conforme especificado na etapa 2.1.11.</li>
		<li>Prepare O IgM anti-humano de cabra, conjugado com Super Bright 436 (SB)/Goat-anti-human IgA, Phycoerythrin (PE) Conjugate detecções anticorpos a 4 μg/mL; ou IgM anti-humano de cabra, SB Conjugate/Goat-anti-humano IgG, Anticorpos de detecções conjugados PE a 4 μg/mL. NOTA: Para um formato de placa de 384 poços, é necessário 12,5 μL/bem da solução de anticorpos secundários preparada, e para um formato de placa de 96 poços, é necessário 25 μL/well.</li>
		<li>Coloque a placa em um separador magnético, lave rapidamente e inverta com força sobre um recipiente de risco biológico para remover o líquido dos poços. Com a placa ainda invertida, bata com força a placa contra um maço de papel grosso.</li>
		<li>Lave cada poço com 100 μL de Tampão de Ensaio e remova o líquido por inversão forçada sobre um recipiente de risco biológico, como descrito anteriormente. Repita estas etapas (2.1.12-2.1.13) para um total de duas lavagens. Descarte todos os maços de papel usados em um recipiente de risco biológico.</li>
		<li>Adicione 12,5 μL da solução secundária de trabalho de anticorpos para cada poço de uma placa de 384 poços ou 25 μL a cada poço de uma placa de 96 poços. Cubra a placa com uma vedação de alumínio ou folha e incubar por 30 minutos em RT em um agitador de placa situado a 700 rpm.</li>
		<li>Repetito passos de lavagem 2.1.12-2.1.13</li>
		<li>Adicione 75 μL de tampão de ensaio em cada poço de uma placa de 384 poços ou 100 μL em cada poço de uma placa de 96 poços. Cubra a placa com uma vedação de alumínio ou folha e incubar por 5 min no RT em um agitador de pratos definido a 700 rpm.</li>
		<li>Analise 60 μL através do analisador de instrumentos de acordo com o manual do sistema.</li>
	</ol></li>
	<li>Otimização do tempo de incubação de captura de espécimes<ol>
<li>Realize as etapas na seção 2.1 utilizando duração de tempo de incubação de 30 min, 60 min e 120 min na etapa 2.1.9. NOTA: As incubações podem ser realizadas com placas distintas ou parando na etapa 2.1.6 até o momento de proceder à etapa 2.1.9. para alcançar os tempos de incubação desejados.</li>
		<li>Proceda com a leitura da placa no analisador utilizando 60 μL da mistura de ensaio de acordo com as recomendações do fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Otimização da concentração de anticorpos secundários<ol>
<li>Realize este procedimento conforme detalhado na seção 2.1, com exceção das concentrações finais de reagentes na solução de trabalho de anticorpos secundários (preparada na Etapa 2.1.10-2.1.11) modificadas da seguinte forma: IgM anti-humano de cabra (ou coelho), anticorpos de detecção de conjugados SB em 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL. IgA anti-humano de cabra (ou coelho), anticorpos de detecção conjugados pe em 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL. IgG anti-humano de cabra (ou coelho), anticorpos de detecção conjugados pe em 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL. IgG anti-humano de cabra (ou coelho), PE-conjugado/Cabra-anti-humano (ou coelho) IgM, anticorpos de detecção de sb-conjugados em 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL. IgM anti-humano de cabra (ou coelho), PE-conjugado/Cabra-anti-humano (ou coelho) IgM, anticorpos de detecção de sb-conjugados em 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL.</li>
		<li>Proceda com a leitura da placa no analisador utilizando 60 μL da mistura de ensaio de acordo com as recomendações do fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Otimização do tempo secundário de incubação de anticorpos<ol>
<li>Realize este procedimento conforme detalhado na seção 2.1 com 15 min, 30 min, 60 min e 120 min de duração de incubação definida na etapa 2.1.14.</li>
		<li>Proceda com a leitura da placa no analisador utilizando 60 μL da mistura de ensaio de acordo com as recomendações do fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação de espécimes sujeitos com ensaios otimizados de dois canais<ol>
<li>Coletar amostras de plasma sujeitos (n = 4) nos dias -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 e +120 relativos à conclusão da administração da vacina Covid-19 (ou seja, segunda dose). NOTA: O dia 0 representa o ponto de tempo pelo qual a vacinação foi concluída.</li>
		<li>Execute todos os ensaios usando o Protocolo base (seção 2.1.) como um ensaio de canal duplo IgG/IgM ou IgA/IgM.</li>
		<li>Normalize os resultados para o valor máximo observado de Intensidade Fluorescente Mediana (IMFI) para cada imunoglobulina específica e ensaio.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Dr. Borgia é o inventor do teste sorológico usado neste manuscrito que está pendente de patente. O artigo é apresentado de forma descritiva apenas sem análises estatísticas apresentadas para evitar viés potencial introduzido pelo conflito autor autor.

A apreciação de uma resposta imune à exposição sars-cov-2, em conjunto com a vigilância baseada em RT-PCR do estado de infecção, foi bem descrita como uma prescrição para esclarecer o curso de recuperação do Covid-19, para servir como um meio de identificar plasma convalescente com potencial valor terapêutico, e para levantamento das taxas de infecção em escala populacional10,11. Diferentes exemplos para a compreensão da soroconversão em seres humanos incluem matrizes de proteína (antígeno)12, imunoblots13, construções imunocromatográficas rápidas14 e ensaios imunossorbentes ligados à enzima (ELISAs)15,16,17. Cada uma dessas técnicas acima mencionadas pode avaliar vários isótipos de imunoglobulina individualmente com pequenas modificações. Esses procedimentos, no entanto, não são capazes de ser praticamente reaproveitados para permitir a análise paralela de múltiplos isótipos, como apresentado neste manuscrito, tornando os fatores de custo e throughput como limitações para sua administração em uma estratégia de teste de escala populacional. Várias dessas aplicações também oferecem a oportunidade de concatenar níveis de múltiplos antígenos em paralelo, seja apresentado ou em formatos alterados, como um multiplex ELISA18,19. Finalmente, a plataforma imunobead fornece a possibilidade de avaliar níveis de múltiplos antígenos emparalelo 20,21, mas foi limitada a um único epítope (ou seja, isótipo de imunoglobulina) por ensaio, a menos que, no entanto, o instrumento recente com capacidades de ensaio de "dual-channel".
Neste relatório, são enumerados protocolos que estabelecem a medição confiável de vários epítopos em um ensaio de imunoesfera utilizando o instrumento no modo "dual-channel" em um estudo de caso de soroconversão de indivíduos vacinados por Covid-19. O método demonstrou excelente precisão (%valores CV tipicamente <20%) utilizando projetos de ensaios manuais que podem ser melhorados com a integração de sistemas automatizados de laboratório. A sensibilidade do ensaio e o alcance dinâmico para todos os analitos e epítopos selecionados foram adequados para avaliações de rotina. Embora a falta de imunoreagentes IgA e IgM disponíveis comercialmente tenha limitado a quantitação ao isótipo IgG, tal restrição não exclui a capacidade de oferecer avaliações ou avaliações semi-quantitativas relativas a uma amostra específica como calibrante22,23.
O ensaio de imunoesfera validado foi alocado para investigar a soroconversão em uma coorte de indivíduos imunizados com a vacina Covid-19. Contrastada com outras plataformas semelhantes, a família de instrumentação permite a prospecção de soroconversão em centenas de indivíduos por dia em um fluxo de trabalho manual e milhares por dia em um esquema automatizado. No geral, esses achados confirmam que a abordagem "dual-channel" tem sensibilidade apropriada para a descrição de vários epítopos em paralelo para o ensaio idêntico e é viável em um contexto multianálise. Uma diferença de sensibilidades ao canal 1 e ao canal 2, como realizado com ficoerythrin e fluoroforos Super Bright 436, respectivamente, pode justificar o desenho de um experimento específico para garantir que resultados analíticos viáveis sejam adquiridos para um determinado experimento. Ou seja, a reserva do canal 1 para epítopos ou analitos de menor prevalência pode ser necessária para manter uma faixa dinâmica do ensaio que inclui os valores observados de desconhecidos. Além dessa consideração, o design de ensaios era óbvio e deveria ser facilmente acessível a laboratórios com capacidades analíticas limitadas. Certamente, essa consideração deve ser ponderada ao considerar a interferência do canal 1 para o canal 2, como observamos para a Figura 5, em que a interferência de isótipos de maior abundância pode causar erros analíticos enganosos para aqueles em abundância muito menor quando medidos em um formato de canal duplo. Esse potencial de interferência em situações com concentrações de analitos altamente diferentes pode representar uma limitação significativa à abordagem se não for adequadamente manuseado na fase de projeto de ensaio.
Em conclusão, foi apresentado um método para medir rapidamente os isótipos de anticorpos dos principais isótipos de imunoglobulina associados a uma resposta imune à infecção ou vacinação covid-19. Aplicar essa abordagem de forma longitudinal para avaliar a soroconversão pode fornecer insights que poderiam ser melhor utilizados para gerenciar e/ou monitorar o curso da doença ou, alternadamente, orientar potenciais programas de vacinação de reforço Covid-19.

A medição simultânea de biomarcadores múltiplos relacionados a doenças em amostras biológicas permite insights descritivos e preditivos em processos patológicos. Embora os procedimentos imunológicos de analito único simples convencionais, como ensaios imunosorbentes ligados à enzima (ELISAs), tenham sido a pedra angular das análises quantitativas em ambientes clínicos e de pesquisa, essas técnicas podem ter limitações substanciais em relação ao throughput, à quantidade de espécimes necessárias para cada medição e ao custo-efetividade que limitam muito o estudo de múltiplos elementos biológicos que são frequentemente entrelaçados ao longo do cursoda doença 1 . A tecnologia de multiplexação baseada em microesfera tornou-se uma plataforma indispensável tanto para as instalações de diagnóstico quanto de pesquisa para sua capacidade de combinar ensaios para melhorar o throughput laboratorial, mitigar a escassez de amostras e reduzir testes repetitivos para maximizar a economia decustos 1,2,3,4. Recentemente, um aumento adicional dessa potência multiplexa-de-multiplexing foi introduzido com instrumentos que possuem capacidades de dois repórteres. O recurso de dois repórteres implementa dois canais fluorescentes para detecção, fornecendo outra dimensão de multiplexação, permitindo a detecção de vários epítopos no mesmo analito.
Síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) é o patógeno responsável pela atual doença coronavírus 2019 (COVID-19) pandemia5. Embora o teste de RT-PCR seja crucial para a confirmação da infecção no início do curso da doença, exames sorológicos de títulos de anticorpos têm se mostrado imperativos para a crítica precisa e completa dos indivíduos em relação a uma exposição ou recuperação prévia; uma resposta à imunização; e/ou avaliação da eficácia vacinal covid-19 6,7.
Este relatório delineia métodos para medir a soroconversão para múltiplos antígenos virais SARS-CoV-2 que utilizam um sistema de relatórios duplos de leitor de multiplex baseado em fluxo. Especificamente, a detecção simultânea de dois subtipos de anticorpos (configurados como IgG/IgM ou IgA/IgM) para um painel de antígenos SARS-CoV-2 3-plex que inclui ensaios para Glicoproteínas de Spike S1, Nucleocapsid e Membrana (também conhecida como Matrix). Esta abordagem fornece uma empresa ideal para a captura de soroconversão longitudinal e contribui com uma ferramenta valiosa no arsenal contra a pandemia Covid-19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well black side polystyrene microtiter plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-565-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, heat shock fraction</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A-7888-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS8574735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA35391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Albumin, Fraction V Powder</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2514-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB205009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB204009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB403009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OB202009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62999842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Analyzer</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>INTELLIFLEX-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex-C Microspheres, Region XXX</td>
			<td>Luminex Corp.</td>
			<td>MC10XXX-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate aluminum sealing tape</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>07-200-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-751-7328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-V08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40591-V08H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40592-T62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb</td>
			<td>Sino Biologicals</td>
			<td>40588-R0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb</td>
			<td>ProSci</td>
			<td>10-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PIA39269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)</td>
			<td>Prepared in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>W-64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic monitoring of seroconversion using a multianalyte immunobead assay for covid-19

As tecnologias multiplex para interrogar vários biomarcadores em conjunto existem há várias décadas; no entanto, os métodos para avaliar vários epítopos no mesmo analito permanecem limitados. Este relatório descreve o desenvolvimento e otimização de um ensaio de imunoesfera multiplexado para testes sorológicos de isótipos comuns de imunoglobulina (por exemplo, IgA, IgM e IgG) associados a uma resposta imune à infecção ou vacinação SARS-CoV-2. Os ensaios foram realizados usando um leitor fluorescente multiplex baseado em fluxo com capacidade de canal duplo. Otimizações focadas no tempo de captura de analitos, concentração de anticorpos de detecção e tempo de incubação de anticorpos de detecção. Características de desempenho de ensaios analíticos (por exemplo, faixa de ensaio (incluindo limites inferiores e superiores de quantitação); e precisão intra e inter-ensaio) foram estabelecidas para a combinação de sorotipo IgG/IgM ou IgA/IgM em conjunto usando o modo 'dual channel'. Os tempos de captura de analito de 30 min para IgG, 60 min para IgM e 120 min para IgA foram adequados para a maioria das aplicações, proporcionando um equilíbrio de desempenho e throughput de ensaio. Foram observadas incubações de anticorpos de detecção ideais a 4 μg/mL por 30 min e recomendadas para aplicações gerais, dada a excelente precisão geral (coeficiente percentual de variância (%CV) ≤ 20%) e valores de sensibilidade observados. O alcance dinâmico do isótipo IgG abrangeu várias ordens de magnitude para cada ensaio (Spike S1, Nucleocapsid e glicoproteínas de membrana), que suporta avaliações robustas de titer em um fator de diluição de 1:500 para aplicações clínicas. Finalmente, o protocolo otimizado foi aplicado ao monitoramento da soroconversão de Spike S1 para sujeitos (n = 4) que completaram um regime vacinal SARS-CoV-2. Dentro desta coorte, os níveis de Spike S1 IgG foram observados para atingir os títulos máximos aos 14 dias após a administração da segunda dose, a uma intensidade de sinal muito maior (~40 vezes) do que os isótipos IgM ou IgA. Curiosamente, observamos altas variáveis as taxas de decadência de títulos spike S1 IgG que eram em grande parte dependentes de sujeitos, o que será tema de estudos futuros.

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Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

Este artigo descreve um método conveniente para monitorar mudanças dinâmicas em tituladores de anticorpos para dois isótipos de imunoglobulina simultaneamente (IgA, IgM ou IgG) resultante de uma resposta imune à infecção ou vacinação SARS-CoV-2. Este 'Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel' emprega três imunoensaias indiretas baseadas em microesferas codificadas que são lidas usando um leitor multiplex baseado em fluxo com capacidade de 'canal duplo'.

Monitoramento Dinâmico da Soroconversão usando um Ensaio de Imunobead Multianalyte para Covid-19

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

O método que demonstraremos hoje fornece uma solução de alto rendimento para avaliar a conversão soro de anticorpos associados a infecções covid-19 ou vacinação para análises de rotina. Curiosamente, essa abordagem nos permite avaliar vários epítopos no mesmo analito. Isso tem inúmeras aplicações nas ciências biológicas, incluindo estudos de sinalização celular e monitoramento de respostas imunes.Demonstrando esta técnica para vocês hoje será o Dr. Imad Tarhoni, um pós-doutorando no meu laboratório. Para começar, selecione três frascos diferentes das microesferas magnéticas com regiões de contas únicas e regis de contas únicas e regis de lote para cada frasco utilizado. Em seguida, o vórtice do estoque de microesfera selecionado por 60 segundos e sonicate por cinco minutos.Transfira 1,0 vezes 10 para as seis contas para um tubo de microcentrifusidade de ligação de proteína de 1,5 mililitro e insira o tubo em um separador magnético. para permitir a separação por 60 segundos. Com o tubo ainda no separador magnético, remova cuidadosamente o sobrenatante sem perturbar a pelota de contas.Remova o tubo do separador magnético e, em seguida, resuspenja as contas com 100 microliters de água e vórtice de hplc por 30 segundos. Novamente, coloque o tubo de volta no separador magnético por 60 segundos e, posteriormente, remova o sobrenante. Repita o protocolo de lavagem duas vezes.Após a última lavagem, remova o tubo do separador magnético e ressumem as microesferas lavadas em 90 microliters de tampão de ativação, pH 6.2, por vórtice por 30 segundos. Em seguida, trate sequencialmente as microesferas com 10 microlitadores de 50 mililígratos por mililitro anhydroxy-sulfosuccinamida e 10 microlitrais de 50 mililíquidos por solução EDC mililitro por vórtice por 10 segundos. Mais tarde, incubar as microesferas por 20 minutos em temperatura ambiente com um vórtice suave a cada 10 minutos.Após a incubação, lave as microesferas duas vezes com MES de 50 mililitros ou tampão de acoplamento, pH 5.0, como descrito anteriormente. Repita a lavagem duas vezes. Uma vez feito, remova o tubo do separador magnético e resuspenja as contas com 100 microliters de tampão de acoplamento por vórtice por 30 segundos, seguido imediatamente adicionando a quantidade desejada de proteína ao tubo.Leve o volume total para 150 microliters com tampão de acoplamento e misture a reação por vórtice por 30 segundos. Em seguida, incubar o tubo por duas horas por rotação à temperatura ambiente. Após a incubação, lave as microesferas duas vezes com tampão de sarampo pbs e resuspenja as microesferas lavadas em 100 microliters de tampão de sada contendo azida de sódio de 0,05% por vórtice por 30 segundos.Conte o número de microesferas recuperadas usando um contador celular automatizado e regise a concentração de contas observada. Para o desempenho do ensaio, resuspenja as microesferas acopladas por vórtice por 30 segundos e sonicar por 60 a 90 segundos. Em seguida, remova a quantidade necessária de cada coloide de contas do respectivo tubo e combine os coloides de contas em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Em seguida, insira o tubo em um separador magnético e permita a separação por 60 segundos. Com o tubo ainda no separador magnético, remova o supernatante sem perturbar a pelota de contas. Depois de remover as contas do separador, resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de ensaio.Vórtice por 30 segundos antes de colocar o tubo em um separador magnético por 60 segundos para separar as contas. Repita a lavagem duas vezes. Em seguida, ajuste a concentração da mistura de microesfera de trabalho de três plex adicionando um volume apropriado de tampão de ensaio para gerar uma concentração final de 100 microesferas por um microliter para cada alvo.Alíquota 25 microlitadores da mistura de microesfera em cada poço de uma placa de 96 poços. Diluir amostras de plasma ou soro 500 vezes no tampão de ensaio e preparar amostras padrão de acordo com a titulação desejada. Adicione 25 microliters de tampão de ensaio como amostra em branco e adicione cada uma das amostras diluídas ou padrão em cada poço designado de uma placa de 96 poços.Quando terminar, cubra a placa com uma vedação de alumínio ou folha para incubar por uma hora em temperatura ambiente em um agitador de placas definido para 700 rotações por minuto. Prepare uma solução de anticorpos de detecção anti-humana ou soluções secundárias de anticorpos em quatro microgramas por microliter com tampão de ensaios conforme descrito no manuscrito. Coloque a placa sobre um separador magnético para lavar rapidamente e, em seguida, inverta com força a placa sobre um recipiente de risco biológico para remover o líquido dos poços.Com a placa ainda invertida, bata com força a placa contra um maço de papel grosso. Em seguida, lave cada poço com 100 microliters de tampão de ensaio e remova o líquido por inversão forçada sobre um recipiente de risco biológico. Repita a lavagem duas vezes.Após a última lavagem, descarte todos os maços de papel usados em um recipiente de risco biológico. Em seguida, adicione 25 microliters de solução de trabalho de anticorpos secundários a cada poço de uma placa de 96 poços e cubra a placa com papel alumínio para incubar em um agitador de placa a 700 rotações por minuto. Após 30 minutos de incubação, lave os poços da placa duas vezes com tampão de ensaio como demonstrado anteriormente.Em seguida, adicione 100 microliters de tampão de ensaio em cada poço da placa de 96 poços. Cubra a placa com papel alumínio e incubar por cinco minutos em um agitador de pratos à temperatura ambiente. Analise uma amostra de 60 microliter através do analisador de instrumentos de acordo com o manual do sistema.Para otimização do tempo de incubação da captura da amostra, incubar as placas por uma duração de 30, 60 e 120 minutos. Após a incubação, analise 60 microliters da mistura de ensaio no analisador. Uma curva padrão de sete pontos baseada em uma série de diluição serial de 1:5 foi avaliada para o pico S1, os anticorpos de membrana e o nucleocapsídeo.O teste de precisão intra-ensaio foi realizado na placa para avaliar a precisão do ensaio calculada como coeficiente percentual de variação, desvio padrão e média. Para precisão entre ensaios, três lotes distintos dos conjuntos de contas foram preparados para cada ensaio. Foram calculadas variáveis de precisão do ensaio com o padrão e as amostras de plasma humano.Os valores médios de intensidade fluorescente em 120 minutos da incubação foram ideais para os títulos de IgG para o pico S1, a membrana e os anticorpos nucleocapsídeos, indicando uma cinética de ligação de anticorpos primários rápido. Otimizações secundárias de concentração de anticorpos no desempenho de canal duplo demonstraram uma ampla gama de sinais em medição linear para todas as concentrações. Os sinais observados de diferentes incubações de tempo dos anticorpos secundários e os detalhes sobre as alterações de sinal para todos os tempos de incubação são mostrados aqui.Nas avaliações específicas para ensaios de dois canais, observou-se contaminação insignificante de sinal cruzado entre o vazio e o canal de repórteres único. Na ilustração dos eventos de conversão de soro após a vacinação COVID 19, os valores observados de pico S1 IgA e IgM foram aproximadamente 40 vezes menores que os títulos de isótipo IgG. Este método tem implicações importantes para monitorar a resposta às vacinas em indivíduos imunocomprometidos.Isso nos permitirá determinar se esses pacientes estão realmente sendo protegidos por essas vacinas.

Research

JoVE Journal

Medicine

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